Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kvantifiera allergen laddade partiklar genom flödescytometri. Omgivande partiklar partiklar kan fungera som bärare av adsorberade allergener. Vi visar här att flödescytometri, en metod som används i stor utsträckning för att karakterisera suspenderade fasta ämnen> 0,5 ^ m i diameter, kan användas för att mäta dessa allergen belastade partiklar.
Abstract
Flödescytometri är en metod används i stor utsträckning för att kvantifiera suspenderade fasta ämnen, såsom celler eller bakterier i ett storleksintervall från 0,5 till flera tiotals mikrometer i diameter. Förutom en karakterisering av framåt- och åt sidan spridningsegenskaper, möjliggör den användning av fluorescerande märkta markörer som antikroppar för att detektera respektive strukturer. Användning av antikropp-färgning indirekt, flödescytometri användes här för att kvantifiera björkpollen-allergen (exakt Bet v 1) -loaded partiklar av 0,5 till 10 ^ m i diameter i inhalerbar partiklar (PM10, partikelstorlek ≤10 pm i diameter). PM10-partiklar kan fungera som bärare av adsorberade allergener eventuellt transportera dem till de nedre luftvägarna, där de kan utlösa allergiska reaktioner.
Hittills innehållet i PM10 allergen har studerats med hjälp av enzymlänkade immunosorbentanalyser (ELISA) och svepelektronmikroskopi. ELISA mäter upplöst och inte partikeln-bunden allergen. Jämfört med svepelektronmikroskop, som kan visualisera allergen belastade partiklar, flödescytometri kan dessutom kvantifiera dem. Som allergenhalten i luften kan avvika från björkpollen räkna kan allergiska symtom kanske korrelerar bättre med allergenexponering än med pollen räkna. I samband med kliniska data, erbjuder den presenterade metoden möjlighet att testa i framtida experiment om allergiska reaktioner mot björkpollen antigener associerade med Bet v 1 allergenhalt av PM10-partiklar> 0,5 um.
Introduction
Luftföroreningar övervägs som en viktig miljö orsak till den ökade förekomsten och svårighetsgraden av luftvägsallergier som observerats under de senaste decennierna 1-3. Dessutom fanns det ett växande intresse i fördelningen av gemensamma allergener i damm 4,5.
Björkpollen kan framkalla hösnuva, men kan också vara en viktig utlösare av allergisk astma 6-8. Hela björkpollen är inte troligt att komma in i nedre luftvägarna eller återfinns i PM10 till följd av sin storlek (22 mikrometer i diameter). Däremot kan björk pollenallergener som Bet v 1, huvud björkpollen allergen komponent, att släppas efter pollen bristning 9 och kan binda till partiklar från omgivande luft 10, vilket möjligen in i nedre luftvägarna. I själva verket har det visat sig att PM10 kan innehålla biologiskt aktiva allergener såsom demonstreras genom in vitro-aktivering av basofiler från en pollenallergisk proband-11
Bet v 1 allergeninnehåll i PM10 prover har studerats genom att extrahera respektive allergen och efterföljande kvantifiering med ELISA 12-14. Med ELISA-tekniken, var den upplösta allergen mätas, men mängden av allergen-laddade partiklarna förblev fortfarande okänd. Svepelektronmikroskopi visade allergen laddade partiklar men inte tillåta kvantifiering 10,15.
Denna studie använder flödescytometri att kvantifiera andelen Bet v 1-laddade PM10-partiklar i luften prover. På grund av den detektionsgräns av flödet endast cytometern partiklar kan undersökas större än 0,5 | im. Den> 0,5 um fraktion av PM10 kommer att hänvisas vidare till som PM10> 0,5.
Protocol
OBS: Detta protokoll beskriver indirekt färgning av PM10-partiklar med en monoklonal antikropp (monoklonal mus IgG1 antikropp, klon MA-3B4) mot Bet v 1, huvud björkpollen antigenkomponent, plus en allofykocyanin (APC) -märkt sekundär antikropp (anti -Mouse IgG1 antikropp, klon A85-1) och den efterföljande analysen på en flödescytometer. Med lämpliga andra antikroppar som finns, kan denna metod utvidgas till detektion av andra antigener bundna till partiklar från omgivande luft.
1. PM10 Provtagning
- Samla PM10 från omgivande luft på polytetrafluoreten (PTFE) filter med användning av en låg volym sampler med en flödeshastighet av 2,3 m 3 / timme (Figur 1). En karakterisering av provtagaren användes för experimenten som beskrivs här återfinns i 16. Gångtid beror på mängden PM10 behövs (vanligtvis mellan 1 och 10 dagar).
- Vid slutet av inkubationstiden, ta bort filtret från provtagaren och frysa den vid-20 ° C fram till användning.
Figur 1. Låg volym PM10 sampler. Exempel på en låg volym PM10 sampler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. PM10 Borttagning och partikelantal
- Låt PTFE filter tina under ca 5 min. Sedan satte filtret i en ren polystyren petriskål (Figur 2A). Ta en ny petriskål för varje filter, om mer än ett filter bearbetas.
- Därefter överlagra PTFE-filter med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Detta protokoll upprättas för en slutlig PM10 koncentration av 8x10 6 partiklar per ml (se steg 3,3). För att få åtminstone denna koncentration, använd följande empiriska volym PBS för att överlagra filtret med: Om uppsamlingstiden PM10 var < 2 dagar, använda 2 ml. För inkubationstider ≥2 dagar, använda 4 ml.
OBS: För att öka partikelkoncentrationen av PM10 fjädring kan suspensioner från olika filter slås samman, om detta är lämpligt. - Håll PTFE-filter med pincett och borsta med en elektrisk tandborste med en känslig borsthuvud för en min (figurerna 2B, 2C). Överför partikel PBS-fjädring, hädanefter benämnd PM10 fjädring, till en ren reaktionsrör.
Figur 2. PM10 borttagning med en elektrisk tandborste. En polytetrafluoreten filter med samplad PM10 placeras i en polystyrol petriskål (A) och överdras med 4 ml PBS. Därefter PM10 bort med en elektrisk tandborste (B: innan du borstar och C: efter tandborstning under 1 minut).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Mäta koncentrationen av PM10-partiklar, t.ex., genom användning av en partikelräknare. Späd en tillräcklig volym av PM10 suspension såsom 50 ^ i 10 ml isoton mätning buffert mäter tre gånger och beräkna medelvärdet totala antalet partiklar per ml. Var noga med att använda en partikelräknare som kan detektera partiklar av relevant storlek.
3. Bet v 1 Färgning
- Beräkna antalet reaktionsrör som behövs för analys av provet: Minst tre reaktionsrör behövs: (i) ett rör med prov endast (native kontroll) (ii) ett rör med prov plus sekundär antikropp (negativ kontroll), och ( iii) ett rör med prov plus primär och sekundär antikropp (specifik prov). Om mätas för första gången, förbereda minst två reaktionsrör för (i) (ii),och (iii) att ha tillräckligt med material för att korrekt justera cytometer inställningar (se steg 4,1).
- Beräkna mängden PM10 suspension krävs för antalet reaktionsrör. Varje reaktionsrör kräver 50 pl suspension.
- Justera partikelkoncentrationen mätt i steg 2,4 för volymen suspension beräknas i steg 3,2 till en slutlig koncentration av 8x10 6 partiklar per ml genom att tillsätta en lämplig mängd PBS.
OBS: Den återstående PM10 suspensionen kan frysas vid -20 ° C för framtida experiment, även om för detta protokoll nyberedda PM10 suspension rekommenderas. - Blocket ospecifik bindning genom att komplettera den PM10 suspensionen med bovint serumalbumin (BSA) vid en slutkoncentration av 0,02%, med användning av en förrådslösning, såsom 1% BSA beredd med PBS. Vortex en kort stund och inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur.
- För varje prov som skall analyseras genom flödescytometri, överföra 50 | il av suspensionen från steg 3,4 till acmagert reaktionsrör. Lägga till en monoklonal musantikropp mot Bet v 1 vid en slutlig koncentration av 0,02 | j, g / | al till reaktionsrören kort avsedda för specifik färgning, virvel och inkubera i 60 min vid rumstemperatur.
- Låt reaktionsrören med PM10-BSA suspension avsedd för den inhemska kontrollen och den negativa kontrollen också stanna i 60 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta alla prover genom att tillsätta 500 | il PBS kompletterad med 0,02% BSA till varje reaktionsrör, vortex en kort stund och centrifugera proverna därefter vid 4700 xg under 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten noggrant genom användning av en vakuumpump.
- Upprepa steg 3,6.
- Bestämma den totala mängden av APC-märkt sekundär anti-mus lgG1-antikropp som behövs: 1 | ig antikropp upplöst i 50 pl PBS supplementerat med 0,02% BSA per reaktionsrör. Späd den lämpliga mängden antikropp med respektive volym PBS supplementerat med 0,02% BSA.
- Tillsätt 50 pl av utspätt sekundär antikropp till alla reaktionsrören med undantag av reaktionsröret som utsetts för den nativa kontrollen. Komplettera den senare med 50 | il PBS kompletterad med 0,02% BSA. Vortex alla prover för några sekunder.
- Inkubera alla prover i 30 minuter i mörker.
- Upprepa steg 3,6 gånger.
- Tillsätt 50 pl PBS till varje reaktionsrör, virvel och analysera proverna på en flödescytometer.
4. Flödescytometrisk analys
- Med hjälp av infödda kontroll, justera följande cytometern parametrar för att optimera dataanalys.
- Genom att använda framåtspridning (FSC) tröskel controller visas på kontrollkortet, ställa in tröskel FSC till det lägsta värdet (200) och starta analysen.
- Genom att använda spridningsspänningsregulator, justera FSC och sidled spridning (SSC) på så sätt att alla PM10-partiklar kan detekteras och att populationen av partiklar ligger ungefär i the mitten av FSC axeln och i nedre halvan av SSC-axeln.
- Genom att använda fluorescensspänningsregulator, justera APC spänning och en annan fluorescens spänning som fluoresceinisotiocyanat (FITC), som inte avger på samma våglängd som APC, om det behövs. Se till att alla partiklar är synliga i den nedre halvan av både fluorescens axlarna.
- Varandra, undersöka varje prov inklusive infödda kontroll och lagra FSC, SSC, APC, och FITC uppgifter om åtminstone 10.000 partiklar per prov.
- Utvärdera data med respektive programvara. Adsorberat allergeninnehåll i det specifikt prov kan kvantifieras på två sätt:
- Analysera APC fluorescensintensiteten av alla partiklar (medianvärde) som ett mått på Bet v 1 belastningen över alla PM10-partiklar.
OBS: Om den specifika provet innehöll allergen, bör APC fluorescensintensitet ökar i det specifika provet jämfört med den negativa kontrollen. Däremot andra fluorescence intensiteter (eg., FITC fluorescensintensiteten) bör inte signifikant förändring. - Beräkna andelen PM10-partiklar med bunden anti-Bet v 1 antikropp. Därigenom i den negativa kontrollen, som en grind runt partiklarna som anses APC positiv, kopiera och klistra in den här porten till specifikt prov och subtrahera den procentuella andelen APC positiva partiklar i den negativa kontrollen från andelen APC positiva partiklar i specifika provet.
- Analysera APC fluorescensintensiteten av alla partiklar (medianvärde) som ett mått på Bet v 1 belastningen över alla PM10-partiklar.
Representative Results
Bet v 1 allergenet adsorption till PM10> 0,5 partiklar kvantifierades genom färgning indirekt antikropp och efterföljande analys på en flödescytometer. Ett PM10 prov från hög pollensäsongen tjänade som mall. Såsom anges i steg 3,1, bestod den negativa kontrollen av PM10-partiklar inkuberas med APC märkt sekundär antikropp enbart (Figur 3A). PM10-partiklar färgade med anti-Bet v 1-antikropp plus sekundär antikropp uppvisade allergen lastade partiklarna (figur 3B). Såsom beskrivs i steg 4,3, var två sätt att kvantifiera den allergen last som används: Å ena sidan, var medianvärdet av APC fluorescensintensitet av alla partiklar analyseras att vara 137 för den negativa kontrollen och 904 för det specifika provet. Å andra sidan, var procentandelen av partiklar med bunden anti-Bet v 1-antikropp bestämmas: En grind var satt runt APC positiva partiklarna i den negativa kontrollen och därefter copied och klistras in i specifika provet. I den negativa kontrollen, var 3% av PM10> 0,5 partiklar anses APC positivt. Denna procentsats av falskt positiva partiklar subtraherades från procentandelen av positiva partiklar i den specifika provet således resulterar i 77,5% APC positiv PM10> 0,5 partiklar i det specifika provet. För att bevisa att den observerade bindningen av den anti-Bet v 1-antikroppen var specifik, var bindningskapacitet blockeras med motsvarande antigen före färgning. Denna minskade bindning av anti-Bet v 1-antikroppen med 69%, om kvantifierades genom APC fluorescensintensitet, och med 84%, om kvantifierades genom procentandel av Bet v 1 positiv PM10> 0,5 partiklar (Fig 3C).
Figur 3. Partikelbundna Bet v 1 allergenet kan visualiseras genom flödescytometri. APC fluorescensintensiteten hos ett PM10 prov från hög pollen säsong färgas endast med APC märkt sekundär antikropp (A), färgade med anti-Bet v 1 primär antikropp och därefter med APC märkt sekundär antikropp (B), och efter blockering den primära antikroppen med rekombinant Bet v 1-antigen (C ). Grinden P APC + sattes runt partiklarna som anses APC positiv (visas i rött) och respektive procentsatser ges. Denna siffra har ändrats något från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att testa om denna metod skulle kunna antas för att avslöja skillnader i mängden av adsorberat Bet v 1 innehållet i PM10> 0,5 prover från hög och från låg pollensäsongen, var 13 PM10 prover från hög och 6 PM10 prover från låg pollensäsong analyseras. Figur 4skildrar betydande skillnader i APC fluorescensintensitet och i andelen Bet v 1 positiva PM10> 0,5 partiklar av PM10 prover från hög pollensäsongen jämfört med PM10 prover från låg pollensäsongen. Båda kvantifieringsmetoder visade härmed liknande resultat.
Figur 4. PM10 prover från låga och höga pollensäsongen skiljer sig åt i mängden adsorberat Bet v 1. Låg pollensäsongen PM10 provtogs i höst / vinter 2013 (n = 6), hög pollensäsong PM10 i maj 2012 och 2013 (n = 13). (A) APC fluorescensintensiteten av PM10> 0,5 partiklar från hög pollensäsongen var betydligt högre än från låg pollensäsongen (median / min / max hög pollensäsongen: 796/313/1097; median / min / max låg pollensäsongen: 197 / 85/277). (B) PM10 från hög pollensäsongen innehöll significantly mer Bet v 1-positiva PM10> 0,5 partiklar än PM10 från låg pollensäsongen (median / min / max hög pollensäsongen: 45,2 / 18,5 / 74,5, median / min / max låg pollensäsongen: 11,8 / 4,4 / 19,8). Boxdiagram visar medianvärden (inre raden av lådan), 25. och 75. percentiler respektive (nedre och övre gränser i lådan) och min- och maxvärden (whiskers). *** P <0,001 jämfört med låg pollensäsong, Mann Whitney U-test. Denna siffra har ändrats något från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Ett kritiskt steg i protokollet är användningen av ett lämpligt filter för uppsamling av PM10-partiklar från luften (se steg 1.1). Filtret måste vara tillräckligt starka för att uthärda borstning med en elektrisk tandborste, och inte alla filtermaterial uppfyller detta krav. Färgningsprotokollet upprättades med en PM10 partikelkoncentration av 8x10 6 partiklar per ml. Men om materialet är begränsad och sammanslagning av prover är inte lämpligt, kommer metoden troligen fungera så bra, men de antikroppskoncentrationer (se steg 3,5 och 3,8) kan behöva justeras.
Bet v 1 färgning av PM10-partiklar resulterade inte i distinkta populationer av positivt och negativt färgade partiklar. Detta kan orsakas av de olika mängder av Bet v 1 allergenet som adsorberats till var och en av partiklarna som sträcker sig från mycket lite upp till en hög mängd. Detta kan resultera i utbyggnaden av APC-signalen därigenom flytta befolkningen motAPC positivitet. Eftersom det är svårt att separera den positiva från de negativa partiklarna framställdes två kvantifieringsmetoder används för att bestämma skillnaderna i Bet v 1 innehållet i de PM10> 0,5 prover: (i) relativ kvantifiering genom mätning av median APC fluorescensintensitet av alla partiklar och (ii) att bestämma andelen APC positiva partiklar. När det Bet v 1 belastning av partiklar från låga och höga pollensäsongen PM10> 0,5, båda metoderna visade liknande resultat. Ändå är relativ kvantifiering av medianfluorescensintensitet av alla partiklar rekommenderas eftersom det är oberoende av att placera porten och därför antagligen mindre felbenägen.
Hittills många studier undersöka innehållet allergen i luften partiklar genom att extrahera respektive allergen och efterföljande kvantifiering med ELISA 5,12-14,17. Det finns en grundläggande skillnad mellan det förfarande som beskrivs här och quantification med ELISA: ELISA kvantifierar det extraherade och upplöst antigen, medan flödescytometri analyserar partikelbundna antigen. Med hjälp av ELISA Bet v 1 belastning av de testade PM10 prover (n = 8) var under detektionsgränsen på 1,2 ng / ml (data ej visade). Likaså Buters och andra identifierade ingen Bet v 1 i PM <2,5 um fraktion och endast cirka 7% i 10 um> PM> 2,5 um fraktion, men mer än 93% i PM> 10 um fraktion av luften 13. De kontrasterande resultaten av ELISA, å ena sidan och FACS-analys, å andra sidan, kan orsakas av skillnader i detektionsmetoden i samband med avvikande känslighet. Ytterligare forskning men behövs för att fullt ut förstå denna skillnad.
En metod för att visualisera partikelbundet antigen svepelektronmikroskopi 10,14. Genom svepelektronmikroskopi, Ormstad et al. Visualiseras Bet v 1 på ytan av suspenderat kornformigt mattr sotpartiklar samplas i hög pollensäsongen och i mindre utsträckning på partiklar i urvalet i den låga pollensäsongen 15. Dessutom var allergener från pollen, latex och även p-glukaner befunnits adsorberas till förbränningspartiklar i luften 10. Denna metod är dock inte tillåter kvantifiering av partikelbundna allergen.
Genom användning av flödescytometri, kan partikelbundna Bet v 1 allergen kvantifieras. Således, flödescytometri kan erbjuda ett nytt sätt att karakterisera 10 till 0,5 um biologiska fraktionen av PM10 som med andra lämpliga antikroppar på sidan kan denna metod utvidgas till detektion av andra antigener på omgivande luftpartiklar, t.ex. mögel, dammkvalster allergener eller LPS. Som PM10-partiklar adsorbera inte bara biologiskt material, men också kemikalier och metaller helt enkelt, ospecifik bindning av antikroppar kan dock utgöra ett problem. Om en ny antikropp testas, är ett kritiskt steg för att bevisa specifika bindIng. Detta kan göras genom att, till exempel, blockerar bindningskapaciteten hos den specifika antikroppen med motsvarande antigen före färgning 11.
Som Bet v 1 innehållet i luften kan skilja sig från björkpollen räkna 12,13,18 kan allergiska symtom kanske korrelerar bättre med allergen nivå än med pollen räkna 14,18. Därför den presenterade metoden i samband med kliniska data gör det möjligt att undersöka i framtida experiment om allergiska reaktioner mot björk motsvara Bet v 1 allergenet belastning av PM10> 0,5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma? J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al.
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M.
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, , WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. , Available from: http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18 (2016).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
