Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare le particelle allergeni-caricati mediante citometria di flusso. le particelle di particolato ambientali possono agire come vettori di allergeni adsorbiti. Noi mostriamo che la citometria a flusso, un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare solidi sospesi> 0,5 micron di diametro, può essere utilizzato per misurare queste particelle allergeni caricato.
Abstract
Citometria di flusso è un metodo ampiamente utilizzato per quantificare solidi sospesi come cellule o batteri in un range da 0,5 a diverse decine di micrometri di diametro. Oltre ad una caratterizzazione delle proprietà di dispersione in avanti e di lato, consente l'uso di marcatori fluorescenti etichettati come anticorpi per rilevare rispettive strutture. Utilizzando indiretta colorazione degli anticorpi, citometria a flusso è impiegato qui per quantificare betulla allergeni del polline (BET appunto v 1) MOLLA particelle di 0,5 a 10 micron di diametro nel particolato inalabile (PM10, la dimensione delle particelle ≤10 micron di diametro). le particelle PM10 possono agire come vettori di allergeni adsorbiti forse li trasporta al tratto respiratorio inferiore, dove avrebbero potuto scatenare reazioni allergiche.
Finora il contenuto allergenico di PM10 è stata studiata per mezzo di enzimi legati analisi immunoassorbimento (ELISA) e microscopia elettronica a scansione. ELISA misure del sciolto e non la particellaallergene -bound. Rispetto al microscopio elettronico a scansione, che può visualizzare le particelle allergeni-caricato, citometria a flusso potrebbero inoltre li quantificare. Come contenuto allergenico di aria ambiente può deviare dal conteggio del polline di betulla, i sintomi allergici potrebbero forse correlare meglio con esposizione agli allergeni che con pollini. In concomitanza con i dati clinici, il metodo presentato offre la possibilità di testare in esperimenti futuri se le reazioni allergiche al polline betulla antigeni sono associati con il Bet v 1 contenuto allergenico di particelle PM10> 0,5 micron.
Introduction
L'inquinamento atmosferico viene considerato come una causa importante ambientale della maggiore incidenza e la gravità delle allergie respiratorie osservate negli ultimi decenni 1-3. Inoltre, c'è stato un crescente interesse nella distribuzione di allergeni comuni in 4,5 polvere.
Birch polline può provocare febbre da fieno, ma può anche essere un trigger importante di asma allergica 6-8. Tutta polline di betulla non è in grado di penetrare nel tratto respiratorio inferiore o di interesse PM10 a causa delle sue dimensioni (22 micron di diametro). Tuttavia, gli allergeni del polline di betulla come Bet v 1, il principale componente polline di betulla allergene, possono essere rilasciati dopo la rottura polline 9 e possono legarsi alle particelle dell'aria ambiente 10, quindi, eventualmente immettere le vie respiratorie inferiori. Infatti, è stato dimostrato che PM10 può contenere allergeni biologicamente attive come dimostra l'attivazione in vitro di basofili da un polline probando allergica 11
Bet v 1 contenuto di allergene in campioni di PM10 è stato studiato estraendo il rispettivo allergene e la successiva quantificazione con ELISA 12-14. Con la tecnica ELISA, l'allergene disciolto è stato misurato, ma la quantità di particelle allergene-caricato rimaneva ancora sconosciuta. Microscopia elettronica a scansione ha rivelato particelle allergene-caricato, ma non ha permesso la quantificazione 10,15.
Questo studio si avvale di citometria a flusso per quantificare la percentuale di particelle PM10 Bet v 1-caricati in campioni di aria ambiente. A causa del limite di rilevazione del citofluorimetro solo particelle più grandi di 0,5 micron può essere esaminato. L'> 0,5 micron frazione PM10 sarà ulteriormente definito come PM10> 0,5.
Protocol
NOTA: Questo protocollo descrive la colorazione indiretta di particelle PM10 con un anticorpo monoclonale (mouse anticorpo monoclonale IgG1, clone MA-3B4) contro Bet v 1, il principale componente polline di betulla antigene, più un Allophycocyanin (APC) -labeled anticorpo secondario (anti anticorpo -mouse IgG1, clone A85-1) e la successiva analisi su un citofluorimetro. Con opportune altri anticorpi disponibili, questo metodo potrebbe essere esteso al rilevamento di altri antigeni legati alle particelle nell'aria ambiente.
1. PM10 campionamento
- Raccogliere PM10 dal nell'aria ambiente politetrafluoroetilene (PTFE) filtri utilizzando un campionatore basso volume con una portata di 2,3 m 3 / hr (Figura 1). Una caratterizzazione del campionatore utilizzato per gli esperimenti descritti qui si trova in 16. Tempo di esecuzione dipende dalla quantità di PM10 necessario (solitamente tra 1 e 10 giorni).
- Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il filtro dal campionatore e congelare a-20 ° C fino al momento dell'uso.
Figura 1. Basso volume PM10 campionatore. Esempio di un basso volume di campionatore PM10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Rimozione 2. PM10 e conte di particelle
- Lasciate che il disgelo filtro in PTFE per circa 5 minuti. Poi, mettere il filtro in polistirolo pulito Petri (Figura 2A). Prendere un nuovo piatto Petri per ogni filtro, se più di un filtro viene elaborato.
- Successivamente, sovrapporre il filtro PTFE con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questo protocollo è stabilito per una concentrazione di PM10 finale della 8x10 6 particelle per ml (vedi punto 3.3). Per ottenere almeno quella concentrazione, utilizzare il seguente volume di empirica di PBS di sovrapporre il filtro con: Se il tempo di raccolta PM10 era < 2 giorni, utilizzano 2 ml. Per tempi di incubazione ≥ 2 giorni, utilizzare 4 ml.
NOTA: Al fine di aumentare la concentrazione di particelle della sospensione PM10, sospensioni di diversi filtri possono essere raggruppati, se questo è appropriato. - Tenere il filtro in PTFE con una pinzetta e pennello con uno spazzolino da denti elettrico con una testa sensibile pennello per 1 min (figure 2B, 2C). Trasferire la particella-PBS-sospensione, sospensione PM10 seguito definito, ad un tubo di reazione pulito.
Figura 2. rimozione PM10 con uno spazzolino elettrico. Un filtro di politetrafluoroetilene con campionamento PM10 viene posto in un polistirolo Petri (A) ed è rivestito con 4 ml di PBS. Poi, PM10 viene rimosso con uno spazzolino elettrico (B: prima di spazzolatura e C: dopo la spazzolatura per 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Misurare la concentrazione di particelle PM10, ad esempio, mediante l'uso di un contatore di particelle. Diluire un volume adeguato di PM10 sospensione ad esempio 50 microlitri in 10 ml tampone di misura isotonico, misurare tre volte e calcolare il numero totale medio di particelle per ml. Assicurarsi di utilizzare un contatore di particelle in grado di rilevare le particelle di dimensioni rilevanti.
3. Bet v 1 colorazione
- Calcolare il numero di provette di reazione richiesti per l'analisi del campione: Almeno tre sono necessari tubi di reazione: (i) un tubo con un solo campione (controllo nativo) (ii) un tubo con il campione più anticorpo secondario (controllo negativo), e ( iii) un tubo con il campione più anticorpo primario e secondario (campione specifico). Se misurato per la prima volta, preparare almeno due provette per (i) (ii),e (iii) di avere abbastanza materiale per regolare correttamente le impostazioni citofluorimetro (vedi punto 4.1).
- Calcolare la quantità di sospensione PM10 richiesto per il numero di provette di reazione. Ogni tubo reazione richiede 50 ml di sospensione.
- Regolare la concentrazione di particelle misurata nel passo 2.4 per il volume della sospensione calcolata al punto 3.2 ad una concentrazione finale di 8x10 6 particelle per ml aggiungendo una quantità appropriata di PBS.
NOTA: La sospensione PM10 rimanente può essere congelato a -20 ° C per gli esperimenti futuri, anche se per questo protocollo appena Si raccomanda la sospensione PM10 preparati. - Block legame aspecifico completando la sospensione PM10 con albumina di siero bovino (BSA) ad una concentrazione finale di 0,02%, utilizzando una soluzione madre, ad esempio 1% BSA preparato con PBS. Vortex brevemente e incubare per 20 min a temperatura ambiente.
- Per ogni campione da analizzare mediante citometria di flusso, trasferire 50 ml di sospensione dal punto 3.4 a corrente alternatatubo di reazione magra. Aggiungere un anticorpo monoclonale di topo contro Bet v 1 ad una concentrazione finale di 0,02 mg / mL per le provette di reazione designati per la colorazione specifica, vortex brevemente e incubare per 60 min a temperatura ambiente.
- Lasciare le provette di reazione con la sospensione PM10-BSA designato per il controllo nativo e il controllo negativo anche stare per 60 min a temperatura ambiente.
- Lavare tutti i campioni con l'aggiunta di 500 microlitri di PBS integrato con 0,02% BSA per ciascun tubo di reazione, brevemente vortex e centrifugare i campioni successivamente a 4.700 xg per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante con cura utilizzando una pompa a vuoto.
- Ripetere il punto 3.6.
- Determinare la quantità totale di anticorpo anti-IgG1 di topo secondario APC-etichettato necessario: 1 mg anticorpi sciolto in 50 ml di PBS integrato con 0,02% di BSA per tubo di reazione. Diluire la quantità appropriata di anticorpi con il rispettivo volume di PBS integrato con 0,02% BSA.
- Aggiungere 50 ml di anticorpo secondario diluito a tutte le provette di reazione ad eccezione del tubo di reazione designato per il controllo nativo. Supplemento quest'ultima con 50 ml di PBS integrato con 0,02% di BSA. Vortex tutti i campioni per alcuni secondi.
- Incubare tutti i campioni per 30 minuti al buio.
- Ripetere il punto 3.6 due volte.
- Aggiungere 50 ml di PBS per ogni reazione tubo, vortice e analizzare i campioni su un citofluorimetro.
4. analisi di citometria di flusso
- Utilizzando il controllo nativo, regolare le seguenti citometro parametri per ottimizzare l'analisi dei dati.
- Utilizzando il controller soglia di forward scatter (FSC) visualizzato sulla scheda di controllo del dispositivo, impostare la soglia FSC al valore più basso (200) e avviare l'analisi.
- Usando il regolatore di tensione a dispersione, regolare l'FSC e dispersione laterale (SSC) in questo modo che tutte le particelle PM10 possono essere rilevati e che la popolazione di particelle si trova a circa in the centro dell'asse FSC e nella metà inferiore dell'asse SSC.
- Utilizzando il regolatore di tensione di fluorescenza, regolare la tensione APC e un'altra tensione di fluorescenza come isotiocianato di fluoresceina (FITC), che non emette alla stessa lunghezza d'onda come APC, se necessario. Assicurarsi che tutte le particelle sono visibili nella metà inferiore di entrambi gli assi di fluorescenza.
- Consecutivamente, esaminare ogni campione compreso il controllo nativo e memorizzare i dati FSC, SSC, APC, e FITC di almeno 10.000 particelle per campione.
- Valutare i dati con il relativo software. contenuto allergenico adsorbito nel campione specifico può essere quantificato in due modi:
- Analizzare l'intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle (valore mediano) come misura di Bet v 1 carico su tutte le particelle PM10.
NOTA: Se il campione specifico conteneva allergene, intensità di fluorescenza APC dovrebbe aumentare nel campione specifico rispetto al controllo negativo. Al contrario, altre fluorintensità escence (ad es., FITC intensità di fluorescenza) non devono cambiare in modo significativo. - Calcolare la percentuale di particelle PM10 con limite anti-Bet v 1 anticorpi. In tal modo, nel controllo negativo, impostare un cancello intorno particelle considerate APC positivo, copia e incolla questo cancello nel campione specifico e sottrarre la percentuale di APC particelle positive nel controllo negativo dalla percentuale di APC particelle positive nel campione specifico.
- Analizzare l'intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle (valore mediano) come misura di Bet v 1 carico su tutte le particelle PM10.
Representative Results
Bet v 1 allergene adsorbimento di PM10> 0,5 particelle è stata quantificata mediante colorazione anticorpi indiretta e successiva analisi su un citofluorimetro. Un campione PM10 da alta stagione dei pollini servito come modello. Come indicato nel passo 3.1, il controllo negativo costituito da particelle PM10 incubati con APC marcato anticorpo secondario solo (Figura 3A). Le particelle PM10 colorati con anti-Bet v 1 anticorpo più anticorpo secondario visualizzati l'allergene caricato particelle (Figura 3B). Come descritto nel passaggio 4.3, sono stati utilizzati due metodi per quantificare il carico allergenico: da un lato, il valore medio dell'intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle è stato analizzato essendo 137 per il controllo negativo e 904 per il campione specifico. D'altra parte, la percentuale di particelle con bound anti-Bet v 1 'anticorpo è stato determinato: Un cancello è stato fissato intorno alle particelle positive APC nel controllo negativo e successivamente copied e incollato nel campione specifico. Nel controllo negativo, 3% delle particelle PM10> 0,5 sono stati considerati positivi APC. Questa percentuale di particelle falsi positivi è stata sottratta dalla percentuale di particelle positive nel campione specifico conseguente 77,5% APC PM10 positivo> 0,5 particelle nel campione specifico. Per dimostrare che il legame del anti-Bet v 1 anticorpo osservato era specifico, capacità di legame è stato bloccato con il corrispondente antigene prima della colorazione. Questo diminuita legame del anti-Bet v 1 anticorpi del 69%, se quantificato da intensità di fluorescenza APC, e dal 84%, se quantificato dalla percentuale di Bet v 1 PM10 positivo> 0,5 particelle (Figura 3C).
Figura 3. Particle-bound Bet v 1 allergene può essere visualizzato mediante citometria di flusso. Intensità di fluorescenza APC di un campione di PM10 da alta PoMolto llen tinto solo con l'APC marcato anticorpo secondario (A), colorati con l'anti-Bet v 1 anticorpo primario e successivamente con l'APC marcato anticorpo secondario (B), e dopo aver bloccato l'anticorpo primario con ricombinante Bet v 1 antigene (C ). Il cancello P APC + è stato fissato attorno alle particelle considerate APC positivo (visualizzato in rosso) e rispettive percentuali sono dati. Questa cifra è stata leggermente modificata dalla 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per verificare se questo metodo potrebbe essere adottato per rivelare differenze nella quantità di adsorbito Bet v 1 contenuto di PM10> 0,5 campioni provenienti da alti e da bassa stagione dei pollini, 13 PM10 campioni di alta e 6 campioni di PM10 da bassa stagione dei pollini sono stati analizzati. Figura 4raffigura significative differenze nell'intensità APC fluorescenza e della percentuale di Bet v 1 PM10 positivo> 0,5 particelle di campioni di PM10 da alta stagione polline rispetto ai campioni di PM10 da bassa stagione dei pollini. Entrambi i metodi di quantificazione presente ha mostrato risultati simili.
Figura 4. I campioni di PM10 da bassa e alta stagione dei pollini si differenziano per la loro quantità di adsorbita Bet v 1. Basso PM10 stagione dei pollini è stata campionata in autunno / inverno 2013 (n = 6), alta polline stagione PM10 nel maggio 2012 e il 2013 (n = 13). (A) L'intensità della fluorescenza APC di PM10> 0,5 particelle di alta stagione dei pollini è stata significativamente superiore a quello di bassa stagione dei pollini (mediana / min / max alta stagione dei pollini: 796/313/1097; mediana / min / max bassa stagione dei pollini: 197 / 85/277). (B) PM10 da alta stagione dei pollini contenuti RILIEVOtly più Bet v 1 PM10-positivo> 0,5 particelle di PM10 da bassa stagione dei pollini (mediana / min / max alta stagione dei pollini: 45,2 / 18,5 / 74,5; mediana / min / max bassa stagione dei pollini: 11,8 / 4,4 / 19,8). trame di dialogo Mostra valori mediani (linea interna della scatola), 25. e 75. percentili, rispettivamente (i bordi inferiore e superiore della scatola) e valori minimi e massimi (baffi). *** P <0.001 vs bassa stagione dei pollini, Mann Whitney U test. Questa cifra è stata leggermente modificata dalla 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Un punto critico del protocollo è l'uso di un filtro appropriato per la raccolta di particelle PM10 da aria ambiente (vedi passo 1.1). Il filtro deve essere abbastanza forte da sopportare spazzolatura con uno spazzolino elettrico, e non tutti i materiali filtranti soddisfare questo requisito. Il protocollo di colorazione è stato istituito con una concentrazione di particelle PM10 di 8x10 6 particelle per ml. Tuttavia, se il materiale è limitato e il raggruppamento dei campioni non è appropriato, il metodo sarà probabilmente funziona pure, ma le concentrazioni di anticorpi (vedere i passi 3.5 e 3.8) potrebbe avere da regolare.
Bet v 1 colorazione delle particelle PM10 non ha provocato distinte popolazioni di particelle positivamente e negativamente macchiati. Questo potrebbe essere causato da quantità variabili di Bet v 1 allergeni adsorbiti a ciascuna delle particelle che vanno da pochissimo fino a una quantità elevata. Ciò potrebbe causare l'espansione del segnale APC spostando così la popolazione versoAPC positività. Poiché è difficile separare il positivo dalle particelle negative, due metodi di quantificazione sono stati usati per determinare le differenze nel contenuto Bet v 1 del PM10> 0,5 esemplari: (i) quantificazione relativa misurando la mediana intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle e (ii) determinare la percentuale di APC particelle positive. Per quanto riguarda il Bet v 1 carico di particelle di bassa e alta stagione polline PM10> 0.5, entrambi i metodi hanno rivelato risultati simili. Ancora, quantificazione relativa, intensità di fluorescenza media delle particelle è raccomandato in quanto è indipendente posizionare il cancello e quindi probabilmente meno soggetto a errori.
Fino ad oggi molti studi esaminare il contenuto allergenico di particolato nell'aria ambiente estraendo il rispettivo allergene e la successiva quantificazione con ELISA 5,12-14,17. Vi è una differenza fondamentale tra il procedimento descritto qui e il quantification con Elisa: ELISA quantifica l'antigene estratto e sciolto, mentre citometria a flusso analizza l'antigene in particelle. Mediante ELISA Bet v 1 carico dei campioni PM10 testati (n = 8) era inferiore al limite di rilevamento di 1,2 ng / ml (dati non mostrati). Allo stesso modo, Buters e altri identificati senza Bet v 1 nel PM <2,5 micron frazione e solo il 7% in 10 micron> PM> 2,5 micron frazione, ma oltre il 93% nel PM> 10 micron frazione di aria ambiente 13. I risultati contrastanti della ELISA da un lato e l'analisi FACS invece, possono essere causate da differenze nel metodo di rilevamento in concomitanza con sensibilità divergenti. Ulteriori ricerche, tuttavia, è necessaria per comprendere appieno questa differenza.
Un metodo per visualizzare particelle legato antigene è microscopio elettronico a scansione 10,14. In microscopia elettronica a scansione, Ormstad et al. Visualizzato Bet v 1 sulla superficie opaca particolato sospesole particelle di fuliggine R campionate in alta stagione dei pollini e, in misura minore sulle particelle campionate in bassa stagione dei pollini 15. Inoltre, gli allergeni da polline, lattice e anche beta-glucani sono stati trovati ad essere assorbiti da particelle di combustione nell'aria ambiente 10. Questo metodo, tuttavia, non consente la quantificazione del allergene particelle.
Con l'utilizzo di citometria a flusso, particella-bound Bet v 1 allergene potrebbe essere quantificato. Così, la citometria a flusso può offrire un nuovo modo di caratterizzare 10 al 0,5 micron frazione biologica di PM10 come con altri anticorpi adatti a portata di mano, questo metodo potrebbe essere esteso al rilevamento di altri antigeni su particelle dell'aria ambiente, ad esempio, muffe, acari allergeni o LPS. Come le particelle PM10 assorbono non solo materiale biologico, ma anche sostanze chimiche e metalli abbastanza facilmente, non specifico legame degli anticorpi potrebbe, però, rappresentare un problema. Se un nuovo anticorpo è testato, un passaggio fondamentale è quello di dimostrare bind specificaing. Questo può essere fatto, per esempio, bloccare la capacità di legame dell'anticorpo specifico con dell'antigene corrispondente Prima della marcatura 11.
Come Bet v 1 contenuto di aria ambiente possono differire dai betulla pollini 12,13,18, i sintomi allergici potrebbero forse correlare meglio con il livello di allergeni che con polline contare 14,18. Quindi, il metodo presentato, unitamente ai dati clinici permette di esaminare in esperimenti futuri se le reazioni allergiche a Birch corrispondono alla Bet v 1 carico allergenico di PM10> 0.5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
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