Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere allergen-lastet partikler ved flowcytometri. Ambient svevestøvpartikler kan virke som bærere av adsorberte allergener. Vi viser her at flowcytometri, en metode som er mye brukt for å karakterisere suspenderte faste stoffer> 0,5 pm i diameter, kan anvendes for å måle disse allergen belastede partikler.
Abstract
Strømningscytometri er en metode som er mye brukt for å kvantifisere suspenderte faste stoffer slik som celler eller bakterier i et størrelsesområde fra 0,5 til flere titalls mikrometer i diameter. I tillegg til en karakterisering av forover og sideveis strø egenskaper, gjør det mulig å bruke fluorescerende merkede markører som antistoffer for å detektere respektive strukturer. Ved hjelp av indirekte antistoff farging, flowcytometri er ansatt her for å kvantifisere bjørkepollen allergen (presist Bet v 1) -loaded partikler på 0,5 til 10 mm i diameter i inhalerbar svevestøv (PM10, partikkelstørrelse ≤10 mikrometer i diameter). PM10 partikler kan virke som bærere av adsorberte allergener eventuelt transportere dem til de nedre luftveier, hvor de kunne utløse allergiske reaksjoner.
Så langt allergenet innholdet av PM10 er blitt studert ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og scanning elektronmikroskopi. ELISA måler oppløst og ikke partikkel-bundet allergen. Sammenlignet med scanning elektronmikroskopi, som kan visualisere allergen-lastet partikler, flowcytometri kan i tillegg tallfeste dem. Som allergen innholdet i luften kan avvike fra bjørk pollen teller, kan allergiske symptomer kanskje samsvarer bedre med allergen eksponering enn med pollen teller. I forbindelse med kliniske data, gir den presenterte fremgangsmåten muligheten til å teste i senere eksperimenter om allergiske reaksjoner mot bjørkepollen antigener blir assosiert med Bet v 1 allergen innhold av PM10 partikler> 0,5 um.
Introduction
Luftforurensning blir ansett som en viktig miljø årsak til økt forekomst og alvorlighetsgrad av luftveisallergier observert de siste tiårene 1-3. Dessuten var det en økende interesse i fordelingen av vanlige allergener i støv 4,5.
Bjørkepollen kan provosere høysnue, men kan også være en viktig årsak til allergisk astma 6-8. Hele bjørkepollen er ikke sannsynlig å gå inn i nedre luftveier eller som befinner seg i PM10 som et resultat av sin størrelse (22 mikrometer i diameter). Imidlertid kan bjørk pollen allergener som Bet v 1, de store bjørkepollen allergen komponent, bli løslatt etter pollen ruptur 9 og kan binde seg til omgivende luft partikler 10, og dermed muligens inn nedre luftveiene. Faktisk har det vist seg at PM10 kan inneholde biologisk aktive allergener som demonstrert ved in vitro-aktivering av basophiles fra et pollen allergisk proband 11
Bet v 1 allergen innhold i PM10 prøver har blitt undersøkt ved å ekstrahere det aktuelle allergen og påfølgende kvantifisering med ELISA 12-14. Med ELISA-teknikk, ble det oppløst genet måles, men mengden av allergen belastede partikler forble ukjent. Scanning elektronmikroskopi avslørte allergen-lastet partikler, men ikke tillater kvantifisering 10,15.
Denne studien benytter flowcytometri å kvantifisere andelen av Bet v 1-lastet PM10-partikler i omgivelsesluftprøver. På grunn av den påvisningsgrensen for strømningscytometer eneste partikler som er større enn 0,5 pm kan bli undersøkt. Den> 0,5 um fraksjon av PM10 vil bli ytterligere referert til som PM10> 0,5.
Protocol
MERK: Denne protokollen beskriver indirekte farging av PM10 partikler med et monoklonalt antistoff (monoklonalt mus lgG1 antistoff, klon MA-3B4) mot Bet v 1 hoved bjørkepollen antigen-komponent, samt en allofykocyanin (APC) -merket sekundært antistoff (anti -Mouse lgG1-antistoff, klon A85-1) og den etterfølgende analyse på et strømningscytometer. Med egnede andre antistoffer er tilgjengelig, kan denne metoden bli utvidet til påvisning av andre antigener bundet til omgivende luft partikler.
1. PM10 Sampling
- Samle PM10 fra omgivende luft på polytetrafluoretylen (PTFE) filtre ved bruk av et lavt volum sampler med en strømningshastighet på 2,3 m 3 / time (figur 1). En karakterisering av prøvetagnings anvendt for eksperimentene som er beskrevet her er funnet i 16. Kjøretiden avhenger av mengden av PM10 nødvendig (vanligvis mellom 1 og 10 dager).
- Ved slutten av inkubasjonstiden, fjerne filteret fra sampler og fryse den på-20 ° C inntil bruk.
Figur 1. Lavt volum PM10 sampler. Eksempel på et lavt volum PM10 sampler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. PM10 Fjerning og partikkeltelling
- La den PTFE-filter tine i ca 5 min. Deretter satte filteret i en ren polystyrol petriskål (figur 2A). Ta en ny petriskål for hvert filter, hvis mer enn ett filter behandles.
- Deretter overlappe PTFE-filter med fosfat-bufret saltvann (PBS). Denne protokollen er etablert for en endelig konsentrasjon på 8x10 PM10 6 partikler per ml (se trinn 3.3). For å få i det minste at konsentrasjon, bruker du følgende empiriske volumet av PBS å overlappe filteret med: Hvis PM10 samling gang var < 2 dager, bruke 2 ml. For inkubasjonstider ≥2 dager, bruke 4 ml.
NB: For å øke partikkelkonsentrasjonen av PM10 suspensjon, kan suspensjoner fra forskjellige filtre samles, dersom dette er hensiktsmessig. - Hold PTFE filter med pinsett og pensel med en elektrisk tannbørste med en følsom børstehode i 1 min (Tall 2B, 2C). Overfør den partikkel-PBS-suspensjon, heretter betegnet PM10 suspensjon, til en ren reaksjonsrør.
Figur 2. PM10 fjernelse med en elektrisk tannbørste. En polytetrafluoretylen-filter med samplet PM10 er plassert i en petriskål polystyrol (A) og er belagt med 4 ml PBS. Deretter PM10 fjernes med en elektrisk tannbørste (B: før børsting og C: etter børsting for 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Måle konsentrasjonen av PM10 partikler, f.eks, ved anvendelse av en partikkelteller. Fortynn et tilstrekkelig volum av PM10 suspensjon eksempel 50 pl i 10 ml isotonisk måling buffer, måler tre ganger, og beregne det midlere totale antall partikler per ml. Sørg for å bruke en partikkelteller som kan oppdage partikler av den aktuelle størrelsen.
3. Bet v 1 Farging
- Beregne antall reaksjonsrør som er nødvendige for analyse av prøven: Minst tre reaksjonsrørene er nødvendig: (i) en rør med bare prøve (native kontroll) (ii) ett rør med prøven pluss sekundært antistoff (negativ kontroll), og ( iii) en tube med prøven pluss primær og sekundær antistoff (spesifikk prøve). Hvis målt for første gang, fremstille i det minste to reaksjonsrørene for (i) (ii),og (iii) å ha nok materiale å justere cytometer innstillinger (se trinn 4.1).
- Beregne mengden av PM10 suspensjon som kreves for antall reaksjonsrør. Hvert reaksjonsrør krever 50 ul suspensjon.
- Juster partikkelkonsentrasjonen målt i trinn 2,4 i volum av suspensjonen beregnet i trinn 3,2 til en sluttkonsentrasjon på 8x10 6 partikler per ml ved å tilsette en passende mengde av PBS.
NB: Den gjenværende PM10 Suspensjonen fryses ved -20 ° C for senere eksperimenter, men for denne protokollen nylagede PM10 suspensjon anbefales. - Blokk uspesifikk binding ved å supplere den PM10 suspensjonen med bovint serumalbumin (BSA) ved en sluttkonsentrasjon på 0,02%, ved hjelp av en lagerløsning slik som 1% BSA fremstilt med PBS. Vortex kort og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- For hver prøve som skal bli analysert ved flow-cytometri, overfør 50 pl av suspensjonen fra trinn 3,4 til aclean reaksjonsrør. Legg et monoklonalt museantistoff mot Bet v 1 ved en sluttkonsentrasjon på 0,02 ug / ul til reaksjonsrørene er utformet for spesifikk farging, vortex kort og inkuber i 60 min ved romtemperatur.
- La reaksjonsrørene med den PM10-BSA suspensjon som er angitt for den native kontroll og den negative kontroll også opphold i 60 minutter ved romtemperatur.
- Vask alle prøvene ved å tilsette 500 ul PBS supplert med 0,02% BSA i hvert reaksjonsrør, vortex kort og sentrifuger prøvene deretter ved 4700 xg i 5 min ved romtemperatur. Kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en vakuumpumpe.
- Gjenta trinn 3.6.
- Å bestemme den totale mengde av APC-merket sekundært anti-mus lgG1 antistoff som trengs: 1 pg antistoff oppløst i 50 ul PBS supplert med 0,02% BSA per reaksjonsrør. Fortynn den passende mengde av antistoff med de respektive volum PBS supplert med 0,02% BSA.
- Tilsett 50 ul fortynnet, sekundært antistoff til alle reaksjonsrør med unntak av reaksjonsrøret som er angitt for den native kontroll. Supplere den sistnevnte med 50 ul PBS supplert med 0,02% BSA. Vortex alle prøver for noen få sekunder.
- Inkuber alle prøvene i 30 min i mørket.
- Gjenta trinn 3,6 to ganger.
- Tilsett 50 mL PBS til hvert reaksjonsrør, Vortex og analysere prøvene i et flowcytometer.
4. flowcytometrisk analyse
- Bruke den innfødte kontroll, justere følgende cytometeret parametere for å optimalisere dataanalyse.
- Ved å benytte termin scatter (FSC) terskel kontrolleren vises på enhetens bord, sette FSC terskelen til den laveste verdien (200) og starte analysen.
- Som bruker scatter spenning kontrolleren, justere FSC og sideveis scatter (SSC) på den måten at alle PM10-partikler kan oppdages og at befolkningen av partikler ligger omtrent i the midt på FSC aksen og i den nedre halvdel av SSC-aksen.
- Ved å bruke fluorescens spenningsstyreenheten, justere APC spenning og en annen fluorescens spenning som fluorescein-isothiocyanat (FITC), som ikke avgir på samme bølgelengde som APC, om nødvendig. Sørg for at alle partikler er synlige i den nedre halvdelen av begge fluorescens akser.
- Fortløpende, undersøke hver prøve inkludert innfødte kontroll og lagre FSC, SSC, APC, og FITC data på minst 10.000 partikler per prøve.
- Evaluere dataene med den respektive programvare. Adsorberte allergen-innholdet i den bestemte prøven kan kvantifiseres på to måter:
- Analyser APC fluorescensintensiteten av alle partikler (medianverdi) som et mål av Bet v 1 belastningen over alle PM10 partikler.
MERK: Hvis den bestemte prøven inneholdt allergen, bør APC fluorescens intensitet økning i den spesifikke prøven sammenlignet med den negative kontroll. I motsetning til dette, andre fluorescence intensiteter (f.eks., FITC fluorescens-intensitet) bør ikke signifikant endring. - Beregn prosentandelen av PM10 partikler med bundet anti-Bet v 1-antistoff. Dermed i den negative kontrollen, satt en gate rundt partiklene anses APC positiv, kopiere og lime inn denne porten til den spesifikke prøven og trekke fra prosentandelen av APC positive partikler i negativ kontroll fra prosentandelen av APC positive partikler i den spesifikke prøven.
- Analyser APC fluorescensintensiteten av alle partikler (medianverdi) som et mål av Bet v 1 belastningen over alle PM10 partikler.
Representative Results
Bet v 1 allergen adsorpsjon til PM10> 0,5-partikler ble kvantifisert ved indirekte antistoff farging og etterfølgende analyse på et strømningscytometer. En PM10 prøve fra høy pollen sesongen fungert som mal. Som nevnt i trinn 3.1, den negative kontroll bestod av PM10 partikler inkubert med APC-merket sekundært antistoff bare (figur 3A). PM10 partikler farget med anti-Bet v 1-antistoff pluss sekundært antistoff vises allergen lastet partikler (figur 3B). Som beskrevet i trinn 4.3, ble to metoder for kvantifisering av allergen belastning brukt: På den ene siden ble medianverdien av APC-fluorescens-intensiteten av alle partikler analysert være 137 for den negative kontroll og 904 for den bestemte prøven. På den annen side, ble prosentandelen av partikler med bundet anti-Bet v 1-antistoff bestemt: En port ble satt rundt APC positive partiklene i den negative kontrollen og deretter kopied og limes inn i den spesifikke prøven. I den negative kontrollen, ble 3% av PM10> 0,5 partikler anses APC positive. Denne prosentandel av falske positive partikler ble subtrahert fra prosentandelen av positive partikler i den aktuelle prøven og dermed resulterer i 77,5% APC positiv PM10> 0.5 partikler i den aktuelle prøve. For å bevise at den observerte binding av anti-Bet v 1-antistoff var spesifikk, ble bindingsevne blokkert med det tilsvarende antigen før farging. Denne redusert binding av anti-Bet v 1-antistoff ved 69%, hvis kvantifisert ved APC fluorescens intensitet, og med 84%, hvis kvantifisert ved prosentandel av Bet v 1. positiv PM10> 0,5 partikler (figur 3C).
Figur 3. Partikkel-bundet Bet v 1 allergen kan visualiseres ved strømningscytometri. APC fluorescensintensitet av en PM10 prøve fra høy pollen sesong farget bare med APC-merket sekundært antistoff (A), farget med anti-Bet v 1 primært antistoff og deretter med APC-merket sekundært antistoff (B), og etter blokkering det primære antistoff med rekombinant Bet v 1-antigen (C ). Porten P APC + var satt rundt partiklene vurderes APC positive (vist i rødt) og respektive prosenter er gitt. Dette tallet har blitt litt endret fra 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å teste om denne metoden kan bli vedtatt å avdekke forskjeller i mengden av adsorbert Bet v 1 innhold av PM10> 0,5 prøver fra høy og fra lav pollensesongen ble 13 PM10 prøver fra høy og 6 PM10 prøver fra lav pollensesongen analysert. Figur 4viser signifikante forskjeller i APC fluorescens intensitet og i andelen Bet v 1 positiv PM10> 0,5 partikler av PM10 prøver fra høye pollensesongen sammenlignet med PM10 prøver fra lav pollensesongen. Begge kvantifisering metoder viste herved lignende resultater.
Figur 4. PM10 prøver fra lav og høy pollensesongen ulik mengde adsorbert Bet v 1. Lav pollensesongen PM10 ble prøvetatt i høst / vinter 2013 (n = 6), høy pollensesongen PM10 i mai 2012 og 2013 (n = 1. 3). (A) APC fluorescens intensitet av PM10> 0,5 partikler fra høy pollensesongen var betydelig høyere enn fra lav pollensesongen (median / min / maks høye pollensesongen: 796/313/1097; median / min / maks lav pollensesongen: 197 / 85/277). (B) PM10 fra høy pollen sesongen inneholdt significantly mer Bet v 1-positive PM10> 0,5 partikler enn PM10 fra lav pollensesongen (median / min / maks høye pollensesongen: 45,2 / 18,5 / 74,5, median / min / maks lav pollensesongen: 11.8 / 4.4 / 19.8). Boksplott viser medianverdier (indre linje av boksen), 25. og 75. percentil, henholdsvis (nedre og øvre grenser boksen) og minimums- og maksimumsverdier (værhår). *** P <0,001 versus lav pollensesongen, Mann Whitney U testen. Dette tallet har blitt litt endret fra 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Et kritisk trinn i protokollen er bruken av et passende filter for oppsamling av partikler fra PM10 omgivende luft (se trinn 1.1). Filteret må være sterk nok til å tåle børsting med en elektrisk tannbørste, og ikke alle filtermaterialer oppfyller dette kravet. Fargingen protokollen ble etablert med en PM10 partikkelkonsentrasjon på 8x10 6 partikler per ml. Men hvis materialet er begrenset og samkjøring av prøvene er ikke hensiktsmessig, vil metoden sannsynligvis fungere også, men antistoffkonsentrasjoner (se trinn 3.5 og 3.8) kanskje må justeres.
Bet v 1-farging av PM10 partikler resulterte ikke i distinkte populasjoner av positivt og negativt fargede partikler. Dette kan være forårsaket av varierende mengder av Bet v 1 allergen adsorbert til hver av de partikler som varierer fra meget lite opp til en høy verdi. Dette kan føre til utvidelse av APC signal dermed skiftende befolkningen motAPC positivitet. Ettersom det er vanskelig å separere den positive fra de negative partikler ble to kvantifisering metoder som brukes for å bestemme forskjellene i Bet v 1-innholdet i PM10> 0.5 prøver: (i) i forhold kvantifisering ved å måle den midlere APC fluorescensintensiteten av alle partikler og (ii) å bestemme prosentandelen av APC positive partikler. Når det gjelder Bet v 1 belastning av partikler fra lav og høy pollensesongen PM10> 0,5, begge metodene avslørt lignende resultater. Likevel er relativ kvantifisering av midlere fluorescensintensitet av alle partikler anbefales som det er uavhengig av å plassere porten og derfor sannsynligvis mindre utsatt for feil.
Til dags dato mange studier undersøke allergen innholdet i luften svevestøv ved å trekke den respektive allergen og påfølgende kvantifisering med ELISA 5,12-14,17. Det er en fundamental forskjell mellom fremgangsmåten som er beskrevet her og den quantification med ELISA: ELISA kvantifiserer det ekstraherte og oppløste antigen, mens flowcytometri analyserer partikkel-bundne antigen. Ved hjelp av ELISA Bet v en belastning av de testede prøvene PM10 (n = 8) var under påvisningsgrensen på 1,2 ng / ml (data ikke vist). Tilsvarende Buters og andre identifiserte ikke Bet v 1 i PM <2,5 um fraksjon og bare omkring 7% i den 10 um> PM> 2,5 um fraksjon, men mer enn 93% i PM> 10 um fraksjon av omgivende luft 13. Kontraster Resultatene av ELISA på den ene side og FACS-analyse på den annen side, kan være forårsaket av forskjeller i påvisningsfremgangsmåten i forbindelse med avvikende følsomhet. Videre forskning er imidlertid nødvendig for å fullt ut forstå denne forskjellen.
En fremgangsmåte for å visualisere partikkel-bundne antigen er scanning-elektronmikroskope 10,14. Ved scanning-elektronmikroskopi, Ormstad et al. Visualisert Bet v 1 på overflaten av suspendert partikkelformet matter sotpartikler samplet i høy pollensesongen og i mindre grad på partiklene samplet i lav pollensesongen 15. I tillegg ble allergener fra pollen, lateks og også p-glukaner funnet å adsorberes til forbrennings partikler i omgivelsesluften 10. Denne metode er imidlertid ikke tillater kvantifisering av partikkel-bundne allergen.
Ved bruk av flowcytometri, kan partikkelbundet Bet v 1 genet kvantifiseres. Således flowcytometri kan tilby en ny måte for å karakterisere 10 til 0,5 pm biologisk fraksjon av PM10 som med andre egnede antistoffer for hånden, kan denne metoden bli utvidet til påvisning av andre antigener av omgivelsesluftpartikler, for eksempel, mugg, støv midd allergener eller LPS. Som PM10-partikler absorberer ikke bare biologisk materiale, men også kjemikalier og metaller ganske lett, uspesifikk binding av antistoffer kan imidlertid utgjøre et problem. Dersom et nytt antistoff som er testet, er et kritisk trinn for å påvise spesifikk bindingsing. Dette kan gjøres ved for eksempel å blokkere bindingskapasiteten av det spesifikke antistoff med det tilsvarende antigen før farging 11.
Som Bet v 1 innholdet i luften kan avvike fra bjørkepollen teller 12,13,18, kan allergiske symptomer kanskje samsvarer bedre med allergen nivå enn med pollen teller 14,18. Derfor presenterte metoden i forbindelse med kliniske data gjør det mulig å undersøke i fremtidige eksperimenter om allergiske reaksjoner på bjørk tilsvare Bet v 1 allergen belastningen av PM10> 0,5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma? J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al.
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M.
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, , WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. , Available from: http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18 (2016).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
