Introduction
Os mecanismos pelos quais o intestino regula o processamento de lípidos na dieta, o fígado controla complexo metabolismo síntese de lípidos e lipoproteínas, e como estes órgãos trabalhar com o sistema nervoso central para controlar a ingestão de alimentos está compreendida de forma incompleta. É de interesse biomédico para elucidar este biologia à luz dos actuais epidemias de obesidade, doenças cardiovasculares, diabetes e doença hepática gordurosa não-alcoólica. Estudos em cultura de células e camundongos forneceram a maioria da nossa compreensão das relações mecanicistas entre lipídios na dieta e doenças, e peixe-zebra (Danio rerio) estão emergindo como um modelo ideal para complementar este trabalho.
Peixe-zebra tem gastrointestinal semelhante (GI) órgãos, metabolismo lipídico e de transporte de lipoproteínas de vertebrados superiores 1,2, desenvolver-se rapidamente, e são geneticamente tratável. A limpidez óptica do peixe-zebra larval facilita estudos in vivo, uma particulavantagem r para o estudo do sistema de GI como seu meio extracelular (ou seja, bile, microbiota, endócrino sinalização) é praticamente impossível modelo ex vivo. Em conformidade, um corpo de pesquisa que combina a rastreabilidade genética e conducividade a viver imagiologia de larvas do peixe com uma variedade de manipulações dietéticas (elevado teor de gordura, 3,4 5 -colesterol, e dietas -carbohydrate 6,7), e os modelos de doença cardiovascular 8, diabetes 9,10, esteatose hepática 11-13, 14-16 e obesidade, estão surgindo para fornecer uma série de insights metabólicas.
Um aspecto essencial da transição peixe-zebra larval em pesquisa metabólica é a otimização de técnicas desenvolvidas em outros animais modelo para o peixe-zebra e do desenvolvimento de novos ensaios que exploram os pontos fortes únicas do peixe-zebra. Este protocolo apresenta técnicas desenvolvidas e otimizadas para alimentar peixe-zebra larval um Lipi-D refeição rica, visualizar processamento de lipídios na dieta de corpo inteiro para subcelular resolução, e medir a ingestão de alimentos. gema de ovo de galinha foi escolhido para compor a refeição rica em lipídios, já que contém altos níveis de gorduras e colesterol (lipídios compor ~ 58% de gema de ovo de galinha, dos quais ~ 5% é o colesterol, 60% são triglicéridos, e 35% são fosfolipídios ). Gema de ovo de galinha fornece mais gordura do que os alimentos típicos comerciais de peixe-zebra de micropastilha (~ 15% de lipídios) e a vantagem de que é uma alimentação padronizada com percentagens conhecidas de espécies de ácidos graxos específicos, como dietas de peixe-zebra e regimentos de alimentação não foram padronizadas em laboratórios 17. Além disso, os análogos de lipídios fluorescentes fornecidas na gema de ovo visualizar transporte e acumulação de lípidos na dieta 18, componentes celulares de imagem, incluindo gotículas lipídicas, agindo ambos os corantes como vitais 3 e através da incorporação covalente em lípidos complexos, investigar o metabolismo através de cromatografia em camada delgada (TLC) 19 20.
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Protocol
Estes protocolos foram aprovados pela Carnegie Institution for Science Animal Care Institucional e Comitê de Uso (protocolo nº. 139).
1. Preparação de animais
- Manter adultos e larvas a 28 ° C em um 14 hr: luz 10 hr: ciclo escuro. Alimente adultos duas vezes por dia com Artemia shell livre (decapsulated, non-incubação, a partir de 14 dpf) e microaglomerados comerciais.
- Estes protocolos são optimizados para o uso de 6-7 larvas dpf recolhido por desova natural do fundo AB. Os protocolos podem ser modificados para larvas de outras idades e origens. Não fornecer alimentos exógena antes de 6 dpf.
- Anestesiar larvas com tricaina em meios de embrião (EM) (4,2 ml de 4 mg / tricaina ml por 100 ml de Em) à temperatura ambiente (TA).
2. Preparação de rica em lipídios Gema de Ovo Alimentação
- Preparar e armazenar as gemas de ovos de galinha. Separar a gema ea clara de 12 ovos de galinha. Reunir as gemas, alíquota de 1 ml em 1,5tubos ml e armazenar a -80 ° C até 1 ano (12 gemas fará ~ 80 alíquotas). Associação A brancos, armazenar e usar como um feed de lipídios-pobre, rica em proteínas.
- Prepare analógico lípido fluorescente (s) a ser adicionado à alimentação de gema de ovo, se desejado.
- Suspender o, análogo lipídico comprada em pó fluorescente em etanol a 100% ou 100% de clorofórmio a 0,1 mg / mL (ver nota seguinte discussão solventes), da alíquota em tubos de vidro opaco, selar com parafilme e armazenamento de acordo com as instruções do fabricante. Devido à rápida evaporação de solventes orgânicos não usar volumes alíquotas inferior a ~ 400 ul para o armazenamento a longo prazo.
Nota: Se o análogo de lípido é suspenso em etanol, grandes volumes de o análogo de lípido será utilizado porque secam rapidamente sob N2 de clorofórmio. Se o análogo de lípido é suspenso em etanol que não tem de ser seco e ressuspenso antes de o adicionar à ração lipossoma no passo 2.2.4, mas a concentração total de etanol não deve ser superior a 0.1% na ração de lipossomas para evitar os efeitos fisiológicos potencialmente confusão de etanol. - Para os análogos de ácidos gordos fluorescentes: Preparar um volume total de 20 ml de 5% de emulsão de gema de ovo em EM. A partir desse preparar aliquotas de 5 ml com uma concentração final de 6,4 uM 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno (BODIPY C 16) para os ensaios de imagiologia confocal vivo e se alimentar ou 1 ug / ml BODIPY C 12 para imagiologia estereomicroscópio. Transferir a quantidade desejada do análogo de lípido fluorescente dentro de um tubo de plástico de 1,5 ml. Seca-se o lípido sob uma corrente de N 2, tomando cuidado para não soprar o lípido para fora do tubo.
- Imediatamente, ressuspender em 5 ul de etanol a 100% por pipetagem de uma corrente para baixo os lados do tubo, adicionar 95 ul de EM, e misturar bem.
Nota: A mistura deve aparecer homogénea; Se lípido cor permanece sobre os lados do tubo ou do líquido aparece agrupado, o lípido não foi totalmente solubilizado e requer mais etanol. Proteger o tubo from luz e armazenar no gelo. - Para analógico colesterol fluorescente: preparar uma concentração final de 2,4 ug / ml de colesterol em 5 ml de 0,5-5% de emulsão de gema de ovo para estudos de imagem ao vivo. Transferir a quantidade desejada de colesterol para um tubo de plástico de 1,5 ml. Seca-se o lípido sob uma corrente de N 2, tomando cuidado para não soprar o lípido para fora do tubo.
- Imediatamente, ressuspender em 15 ul de etanol a 100% RT por pipetagem de uma corrente para baixo os lados do tubo e misturar-se com 85 ul de RT 1% de BSA livre de ácido gordo em H 2 O. purificado Proteger o tubo da luz e armazenar no gelo.
- Suspender o, análogo lipídico comprada em pó fluorescente em etanol a 100% ou 100% de clorofórmio a 0,1 mg / mL (ver nota seguinte discussão solventes), da alíquota em tubos de vidro opaco, selar com parafilme e armazenamento de acordo com as instruções do fabricante. Devido à rápida evaporação de solventes orgânicos não usar volumes alíquotas inferior a ~ 400 ul para o armazenamento a longo prazo.
- Prepare Gema de Ovo de Lipossomas de alimentação.
- Adicionar uma alíquota descongelada de gema de ovo para EM em um tubo de 50 ml. Vortex a mistura de gema de ovo diluída para 1-2 min; a mistura deve parecer ser uma emulsão homogénea.
- Despeje a mistura por uma peneira de malha fina para remover conglomerados de proteína e recolher em um novo, fresco tubo de 50 ml.
- Sonica pulsote a mistura de ovos com um MICROTIP cônico um quarto de polegada (5 vezes (5 x 1 segundo ligado, 1 seg desligado) parando 5-10 segundos entre cada conjunto; intensidade de saída: 6 W) à temperatura ambiente para criar lipossomas. configurações de energia Sonicator são dependentes instrumento e, portanto, requerem otimização para cada instrumento e MICROTIP.
Nota: Continuamente mistura agitar à TA de lipossomas para manter a homogeneidade até à sua utilização.
- Adicionar o análogo de lípido fluorescente para os lipossomas de gema de ovo, se desejado. Imediatamente após a soni cação, pipetar os lípidos preparados na mistura lipossoma e vórtice a alta velocidade durante 30 segundos para incorporar em lipossomas. Proteger a mistura da luz envolvendo o tubo em folha e continuar balançando à temperatura ambiente.
3. Alimentação Paradigm
- Prepare as larvas para a alimentação.
- Antes de iniciar a alimentação, as larvas de tela para defeitos morfológicos óbvios que podem impedir a alimentação. Transferência das larvas para 60 mm x 15 mm ou placas de Petri de 6 ou 12 poços PLATES, EM reduzir a um mínimo, e substituir com 5 ml da solução de lipossoma preparado.
- Se necessário, a transferência das larvas de controle não alimentado para 5 ml de Em e / ou 5 ml de 5% de clara de ovo em EM e tratar em paralelo.
- Agite suavemente as larvas em um balancim incubadas (29-31 ° C a 30 rpm) durante todo o feed para incentivar a ingestão de alimentos, continuando a proteger da luz, se análogos lipídicos fluorescentes estão presentes. Se larvas precisam ser expostos à luz, minimizar a exposição com uma tampa de incubadora de vidros fumados.
- No final do período de alimentação, lavar as larvas que nadam livremente em EM 3 vezes.
Nota: As larvas podem começar a consumir lipossomas em qualquer ponto durante a alimentação. Se é crítico que as larvas começar a alimentação ao mesmo tempo, a tela de ingestão de alimentos (ver 3.4) após 1 h de alimentação e retornar apenas larvas que têm início a alimentação de emulsão de gema de ovo para completar a alimentação. - Tela as larvas neste momento para a ingestão de alimentos como um número pequeno não pode eAT (~ geralmente 0-5%). Examinar os intestinos de larvas que foram anestesiados ou ligeiramente arrefecido em um bloco de metal em gelo para determinar se eles alimentados: larvas que tenham consumido lipossomas terão uma escurecida intestino (Figura 1).
- Imagens ou processo de larvas para a ingestão de comida imediatamente. Alternativamente, as larvas lugar em EM fresco e incuba-se a 28 ° C para permitir o processamento metabólico de ocorrer.
4. Montagem Larvas for Imaging ao vivo
- Preparação da mídia de montagem.
- Por metil celulose 3%: adicionar 0,75 g de metil-celulose a 25 ml de ebulição próximo EM, vórtice, rocha à TA 2-3 dias até que esteja completamente dissolvido, e armazenar a 4 ° C, durante anos a -20 ° C. Os ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, a 4 ° C irá remover as bolhas de ar. Armazenar 3% de celulose de metilo em gelo durante a montagem larvas.
- Para 1,2% de agarose de baixo-mount: adicionar 0,3 g de agarose de baixa fusão a 25 mL EM e dissolver, trazendo a ferver, alíquota em 2 ml de tUBEs, e manter a 26-28 ° C em um bloco de aquecimento. alíquotas não utilizados podem ser armazenados à temperatura ambiente ou -20 ° C e fervida novamente no momento da utilização. Certifique-se de que agarose é fresco bastante para segurar antes de expor a larvas ou eles podem ser sobre-aquecido.
- Para baixa ampliação, de médio rendimento imagens ao vivo, coloque uma lâmina de vidro em um tecido em um bloco de metal no gelo e esperar que o slide para esfriar. Aplique uma quantidade generosa de metilcelulose a 3% (que foi mantido a 4 ° C no gelo) sobre a lâmina, transferir uma larva para a metilcelulose a 3%, utilizando um poker-linha de pesca (linha de pesca de diâmetro 0,41 milímetros colado à extremidade de um tubo capilar de vidro) criar um Troth para drenar o excesso eM (de modo que a metilcelulose não será diluída) e posicionar as larvas se o desejar.
- Para a curto prazo (<20 min), de grande ampliação de imagens ao vivo com um objetivo emersão de óleo na posição vertical, montagem larvas com a lamela método lean-to.
- Use cola à base de cianoacrilato (Super Bonder) paraanexar AA lamela 22 milímetros x 30 mm a uma extremidade de uma lâmina de vidro. Use um poker para colocar uma linha fina de metilcelulose a 3% no slide ao lado da lamela e transferir as larvas para o slide com uma grande furo Pasteur pipeta. Retire o excesso de EM por isso não vai diluir a metilcelulose.
- Usando um póquer, suavemente posicionar larvas no metilcelulose sobre os seus lados (lado esquerdo para cima à imagem mais do fígado, do lado direito para cima para a imagem da vesícula biliar), com as cabeças ao lado da lamela.
- Ponto supercola nos cantos de uma segunda lamela e gentilmente colocar uma borda da lamela na lamela montado eo outro no slide, ponte larvas. Tome cuidado para não aplicar pressão excessiva durante esta etapa ou com o objetivo, enquanto imagem de modo a que as larvas permanecem sem ferimentos.
- Para longo prazo, imagens de alta ampliação com uma objectiva de imersão vertical, montagem larvas em agarose. Adicionar uma larva de uma pequena alíquota de 1,2% baixo ponto de fusão agarose, em seguida, transferir olarva em um pequeno volume de agarose para uma placa de Petri.
- posicionar rapidamente as larvas com um poker antes os solidifica de agarose. Permitir que a agarose a secar durante 2-3 min e cobrir totalmente a agarose com EM frescos para evitar a sua secagem.
- Para longo prazo, imagens de alta ampliação com um objetivo invertido, montar larvas em um prato com fundo de vidro em agarose.
- Arrefecer um bloco de metal no gelo. Coloque o prato no bloco de metal separadas por um tecido para evitar o resfriamento excessivo e congelamento larval. Transferir uma larva para o prato e remover o EM por absorção com papel absorvente.
- Coloque uma gota de 28 ° C agarose de baixo ponto de fusão (1,2%) no topo da larva e posicionar imediatamente com um póquer (lado esquerdo para baixo a melhor imagem do fígado, do lado direito para baixo a imagem da vesícula biliar). Remover prato do bloco frio, deixe secar por 2-3 min, e adicionar um volume suficiente de EM fresco para cobrir a agarose (~ 2-5 ml).
Ingestão 5. AlimentosEnsaio
- No fim de uma alimentação de lipossoma de gema de ovo contendo 6,4 uM BODIPY C 16, reunir um mínimo de 10 larvas lavadas em um tubo de plástico de 1,5 ml ou 2, remover o EM, e encaixe congelamento. As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C ao abrigo da luz durante vários meses.
Nota: Se possível, recolher várias repetições. É importante recolher larvas não alimentadas neste passo para normalizar para a fluorescência de fundo de lípido (larvas idealmente a partir da mesma embraiagem são utilizados). - Realizar uma extração de lipídios Bligh-Dyer modificada 3,21.
- Adicionar 100 ul de tampão de homogeneização (20 mM de Tris-Cl, EDTA 1 mM) à amostra em gelo (H 2 O, alternativamente, purificado pode ser utilizado). Homogeneizar no gelo com um sonicador MICROTIP (5 segundos no total: 1 segundo em 1 seg desligado). Verifique se as larvas são totalmente homogeneizada; Se não, repita. Transfira para uma ml tubo de cultura de vidro descartável 13 (podem ser utilizados outros tubos de vidro).
Nota: O clorofórmio é perigosa; praticar todos os ex lipídico subsequenteetapas de tração em temperatura ambiente em uma capa química. - Para cada 100 ul de tampão de homogeneização utilizadas, adicionar 375 ul de 1: 2 (clorofórmio: metanol). 30-60 seg Vortex, incubar 10 min, adicionar 125 ul de clorofórmio por 100 ul de tampão de homogeneização utilizada, e agitar com vortex 30 seg.
- Adicionar 125 ul de Tris 200 mM, pH 7,5 por 100 ul de tampão de homogeneização utilizada, vortex 30 seg, e centrifugar (2000 x g, 5 min, temperatura ambiente, protegidas da luz). Remova cuidadosamente as amostras da centrifugadora. Eles vão ser separado em duas fases: uma fase aquosa superior é, uma interface de detritos das larvas, e uma fase orgânica inferior (contém lípidos).
- Com uma pipeta de vidro limpo recolher o fundo, fase orgânica e transferi-lo para um tubo de vidro de 13 ml limpo.
Nota: Tome cuidado para evitar a fase aquosa e detritos larval na interface; se a contaminação ocorre, repita o passo centrifugação e recoleta. Descarte a fase superior, aquosa; pode ser útil para remover e descartar estefase, antes de recolher a fase orgânica. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C durante até 1 mês. - Seca-se a fase orgânica sob vácuo (0,12 atm), ao mesmo tempo proteger da luz. Não continue a secar as amostras após o líquido tenha evaporado uma vez que irá reduzir a solubilidade lipídica. Ressuspender os lípidos em 2: 1 (clorofórmio: metanol) e armazenar em gelo. O volume óptimo de clorofórmio: metanol a solução depende do método de detecção utilizado; iniciar e continuar baixo para diluir conforme necessário. A orientação geral é a utilização de 10 ml para 10 larvas em pool.
- Adicionar 100 ul de tampão de homogeneização (20 mM de Tris-Cl, EDTA 1 mM) à amostra em gelo (H 2 O, alternativamente, purificado pode ser utilizado). Homogeneizar no gelo com um sonicador MICROTIP (5 segundos no total: 1 segundo em 1 seg desligado). Verifique se as larvas são totalmente homogeneizada; Se não, repita. Transfira para uma ml tubo de cultura de vidro descartável 13 (podem ser utilizados outros tubos de vidro).
- Manchar todo o volume da amostra em intervalos uniformemente espaçados sobre uma placa de TLC canalizada e digitalizar a placa com um scanner a laser rotineiramente utilizado para imagiologia biomolecular (por exemplo, um leitor de placas fluorescente). Para os análogos de lipídios fluorescentes incluídos na lista de materiais que têm uma maxima de excitação 500-650 maxima nm e emissão 510-665 nm, utilizar um laser de 488 nm e com a coleta de emissão a 520 nm.
- Quantificar a fluorescência total de cada local com software de imagem.
Nota: Corrigir que ocorrem naturalmente fundo lipídico fluorescência subtraindo a fluorescência, amostras de larvas em jejum emparelhados.
- Quantificar a fluorescência total de cada local com software de imagem.
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Representative Results
Quando alimentados com uma cadeira de balanço em 29-31 ° C, a maioria das larvas saudáveis (≥95%) vai comer dentro de 1 hora. Após a consumir a emulsão de gema de ovo, o intestino das larvas em cor escurece. Muito intestinos escuras pode ser observada em 2 horas (Figura 1). Se as larvas estão em jejum ou não avançam, o intestino continua a ser clara. As larvas ovo alimentado exposições branco Um distendidas lúmen intestinal que não escurece na cor.
Figura 1:. Triagem Larvas de Consumo Alimentar tipo selvagem larvas de 6 dpf foram alimentados com 5% de gema de ovo em EM, durante 2 horas, ou tratados em paralelo no EM de obter controlos em jejum. larvas não alimentadas têm intestinos claras, enquanto as larvas alimentadas que tenham consumido a gema de ovo tem intestinos escuros quando visualizados em 10X em um estereoscópio. barras de escala representam 0,1 mm.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Alimentação com análogos lipídicos fluorescentes permite a visualização do transporte sistêmica e acumulação subcelular de lipídios na dieta. O sinal fluorescente está presente em todo os órgãos digestivos (intestino, fígado e pâncreas) de larvas alimentadas 5% de gema de ovo com 6,4 mM fluorescente C 16 analógico de 8 hr montado com a lamela lean-to método e fotografada com um objetivo na posição vertical (Figura 2) 3.
Figura 2:. Fluorescent Lipid Análogos Visualize Dietary Lipid Transporte imagem composta Representante de uma larva 6-DPF (cabeça virada para a direita) alimentados 5% de gema de ovo EM com 6,4 mM BODIPY FL C 16 para 8 horas. As larvas foi montado em metilcelulose a 3% pela lamela inclinar-to método e fotografada com uma posição vertical 63X objectiva de imersão em óleo em um único fóton microscópio confocal com um laser de argônio. barras de escala representam 20 mm. Fígado, G; intestino, I; pâncreas, P, da vesícula biliar, GB; reimpresso com a permissão de Dev Bio 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vários análogos lipídicos permitir a visualização de conjuntos únicos de estruturas celulares, uma vez que são diferencialmente metabolizado em lípidos complexos (isto é, triglicéridos, ésteres de colesterol, fosfolípidos). Seguindo 4-8 hr alimenta, fluorescente C 16 e C 12 análogos rotular gotículas lipídicas, FL C gotículas lipídicas 5 etiquetas fluorescentes, dutos hepáticos e pancreáticos, membranas celulares e redes arteriais e fluorescente C analógica 2 etiquetas hepática e ductos pancreáticos e celular membranas (Figura 3) 3.
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Figura 3:. Diferente fluorescentes lipídicas Análogos rótulo exclusivo celulares Órgãos imagens compostas representativos de larvas alimentadas 5% de gema de ovo EM com 6,4 mM BODIPY FL C 16, C 12, C 5 ou C 2 para 4-8 hr (6 dpf) . C 16 analógico é observada em gotículas lipídicas (LD) dos enterócitos, C 12 e C 5 análogos em LD enterócitos e do lúmen intestinal e C 2 analógico no lúmen intestinal. As larvas foram montados em metilcelulose a 3% pela lamela inclinar-to método e fotografada com um 63X objetiva de imersão em óleo de pé sobre um único fóton microscópio confocal com um laser de argônio. barras de escala representam 20 microns. Reproduzido com permissão de Drogas Discov Hoje Dis Models 22._blank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ensaio de ingestão de alimento larval foi desenvolvido para investigar mutações genéticas como, superexpressão de genes transgênicos, e / ou tratamento exógeno afetar a ingestão de alimento larval. As larvas são alimentados com uma refeição rica em lípidos cravado com um análogo de lípido fluorescente para indicar a quantidade de alimentos consumidos. larvas não alimentadas são recolhidos em paralelo para normalizar para a quantidade de fluorescência de fundo presente em larvas, aumentando a sensibilidade em que o análogo de lípido fluorescente pode ser detectado. Este ensaio foi utilizado para demonstrar que a sobre-expressão da apolipoproteína A-IVb.1 (apoA-IVb.1) diminui a ingestão de alimentos. Anteriormente unfed Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) larvas alimentadas com 10% de gema de ovo com 6,4 mM fluorescente C 16 analógico durante 4 horas a 7 dpf consumiram aproximadamente 30% menos do que os lipídios larvas do tipo selvagem (Figura 4) 20.
Figura 4:. Representativas Consumo Alimentar ensaio do tipo selvagem (WT) e Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) (Tg) larvas foram alimentadas com 10% de gema de ovo de galinha com 6,4 uM BODIPY FL C16 durante 4 h (Fed) ou tratadas em paralelo em eM (em jejum). (A) As larvas foram reunidas (n = 10), os lípidos foram extraídos e os extractos foram vistos numa placa de TLC. (B) total de fluorescência foi quantificada, expressa em unidades arbitrárias fluorescentes (AFU), normalizados para a fluorescência de fundo em irmãos não alimentadas, por subtracção, e expressa em relação ao WT. Tg larvas que sobre-expressam de ApoA-IVb.1 ingerem menos análogos lipídicos marcados com fluorescência como mostrado por comparação com WT (teste t emparelhado de Student, p <0,001; N = 9, 20 larvas por experiência). A caixa representa os percentis 25-75, ea mediana é indicado. Os bigodes mostram os percentis 10-90. Reproduzidocom a permissão de Dis Modelo Mech 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As técnicas descritas aqui permitem aos pesquisadores para tratar peixe-zebra larval com uma alimentação rica em lipídios, visualizar o processamento de lípidos na dieta em larvas vivas, e quantificar a ingestão de alimentos larval. Para garantir o sucesso, deve ser dada especial atenção a vários passos críticos. ovos de galinha comerciais variam; para minimizar a variabilidade potencial realizamos todos os ensaios em ovos orgânicos de galinhas livres de gaiolas que não tenham sido enriquecido para ácidos graxos ômega-3. Taxas mais baixas de alimentação pode ser observada em peixes mais jovens de 6 dpf com o restante estoques endógenos de gema de energia, peixes insalubres, ou peixe com mutações de desenvolvimento que impedem a ingestão de alimentos (ou seja, mandíbula ou malformação do intestino, incapacidade de nadar adequadamente). O laboratório de Farber geralmente executa ensaios de alimentação em 6-7 dias após a fertilização (DPF), porque as larvas não necessitam de alimentos exógeno até suas lojas gema endógenos estão esgotados e exaustão gema permite uma melhor visualização do sistema digestivo. Alimentandoà TA também reduz grandemente o número de larvas que se alimentam. A falta de larvas de tela para a ingestão de alimentos e inclusão involuntária de larvas não alimentadas em experimentos subsequentes podem confundir os resultados. Além disso, é importante para proteger os análogos lipídicos fluorescentes, e todas as amostras de larvas alimentadas com os análogos, a partir de luz quando possível manter a fluorescência máxima, e, assim, a sensibilidade do ensaio. Finalmente, se a ingestão de alimentos vai ser medido, não permitem a alimentação e Chase (período de metabolismo pós-feed) para exceder um total de 4 horas, desde a refeição começará a ser excretado. Actualmente, a taxa em que a refeição e análogos fluorescente lipídicos associados são excretados é desconhecida, mas a fluorescência pode persistir ao longo do corpo de larvas, para, pelo menos, 2 dias pós alimentação (JPO e SAF dados não publicados).
Existem várias maneiras de modificar e resolver os protocolos para responder às questões experimentais de interesse. A alimentação rica em lipídios pode ser realizada por vários períodos de time: 1 hr irá fornecer uma pequena refeição, ao mesmo tempo 4 h vai encher o intestino com uma grande quantidade de lípido. No entanto, alimentar as larvas mais de 6 horas não é recomendado como a gema e EM não são preparados em condições estéreis e crescimento excessivo de bactérias na emulsão de gema de ovo / branco pode confundir os resultados (ou seja, aumento da inflamação, alteradas perfil microbiota intestinal). As larvas podem ser examinadas imediatamente após a alimentação para investigar os efeitos agudos da larvas alimentam-se imobilizada por breve de arrefecimento ou de anestesia começam rapidamente a alimentados novamente após o reaquecimento, mas o arrefecimento é o método preferido de imobilização como larvas podem apresentar emese após anestesia (SAF observação não publicada). Alternativamente, os períodos de perseguição pode ser levada a cabo depois da alimentação para permitir o transporte e o metabolismo dos lípidos alimentares antes do estudo. Embora alimentações são geralmente efectuadas em solução de lipossomas de 5 ml, as alimentações foram realizados com sucesso em volumes que variam de 1 a 20 ml. várias concentraçõess de gema de ovo pode ser usado em alimentos para animais de larvas; o laboratório Farber rotineiramente realiza experiências com 5% de gema de ovo (1 ml de gema de ovo adicionado a 19 ml de Em), 0,5% de gema de ovo, e 10% de gema de ovo.
Não há limitações potenciais dos análogos lipídicos fluorescentes que devem ser considerados. Ao escolher um análogo de lípido fluorescente é importante considerar como o lípido é fisiologicamente processada e em que o grupo fluorescente está ligado à estrutura química do lípido na interpretação dos resultados. Por exemplo, os triglicéridos são divididos em ácidos gordos livres e glicerol, colesterol e ésteres de colesterol em ácidos gordos livres e, no lúmen intestinal antes da absorção. Portanto, se um triglicérido ou éster de colesterol analógico fluorescente é fornecida na dieta a fluorescência observada no corpo irá acompanhar o ácido gordo, colesterol livre, ou glicerol que o grupo fluorescente está ligado a, e não o éster de triglicéridos ou de colesterol inicial. fluorescen diferenteanálogos de t lipídicas rotular estruturas celulares únicas, e este fato deve ser considerado durante a seleção 3. Também de nota, em comparação com o metabolismo de ácidos gordos nativos, a adição de uma porção de BODIPY é aproximadamente equivalente à adição de ~ 2-3 átomos de carbono para o comprimento da cadeia de ácidos gordos (FAE dados não publicados).
As técnicas descritas aqui representam avanços significativos sobre ensaios anteriores descritos no campo. Estudos antes do desenvolvimento deste alimento gema de ovo de galinha, dois manuscritos detalhados em que as larvas foram alimentadas alimentado ovo cozido gema 4,23. A técnica aqui descrita apresenta a vantagem de a gema de ovo não precisa de ser cozido e pulverizado antes de ser utilizado e que a gema de ovo em pó tem uma meia-vida muito curto devido à sua rápida oxidação. gema de ovo líquida, também podem ser preparados como lipossomas que prontamente aceitam análogos lipídicos fluorescentes para a entrega eficiente dietético. Alternativamente, lípidos marcados radioactivamente pode ser usado para investigar metabolismo lipídico da dieta e medir a ingestão de alimentos, mas análogos lipídicos fluorescentes não apresentam os riscos de segurança associados com radioatividade. No entanto, se os investigadores desejam utilizar lípidos radiomarcados, o laboratório Farber realizados estudos para verificar se os lípidos radiomarcados pode ser incorporado, e alimentados com êxito, os lipossomas 19. Os análogos de lipídios fluorescentes descritas aqui foram escolhidos porque eles mostram o metabolismo altamente semelhantes aos lipídios endógenos e radiomarcados, e eram suficientemente brilhante para baixo e de imagem de alta potência.
Precedendo o desenvolvimento desta técnica para alimentar análogos lipídicos fluorescentes para as larvas, não há outros métodos disponíveis para visualizar o transporte de lípidos e acumulação dietética in vivo. A visualização direta dos análogos lipídicos fluorescentes podem fornecer uma vantagem sobre usando medidas indiretas de fisiologia, como lipídeos séricos. A medição precisa do consumo de alimentos de peixe-zebra larval também foi um longo standing desafio no campo. A única alternativa era paramecia cultura, rotulá-los com o marcador fluorescente lipofílico 4- (4- (didecylamino) estiril) - N iodeto de -methylpyridinium (4-Di-10-ASP), permitir que as larvas se alimentam, e medir a fluorescência a área intra-abdominal com um leitor de placas de 24. Finalmente, estas técnicas têm a vantagem de ser aplicável a ambas as telas de médio rendimento (isto é, para a frente telas genéticos de processamento de lípidos na dieta), bem como estudos de imagem focada de elevada ampliação (isto é, inverter os estudos genéticos, hipótese motrizes). No futuro, essas técnicas podem ser aplicadas para o fenótipo e tela de diversos modelos de metabólica e GI doenças em peixes-zebra.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
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