Introduction
Les mécanismes par lesquels l'intestin réglemente le traitement des lipides alimentaires, le foie contrôle la synthèse des lipides et des lipoprotéines de métabolisme complexe, et comment ces organes fonctionnent avec le système nerveux central pour contrôler la prise alimentaire sont encore mal compris. Il est d'intérêt biomédical pour élucider cette biologie à la lumière des épidémies actuelles de l'obésité, les maladies cardiovasculaires, le diabète, et non alcoolisées maladie du foie gras. Des études en culture cellulaire et les souris ont fourni la majorité de notre compréhension des relations mécanistes entre les lipides et les maladies alimentaires, et le poisson zèbre (Danio rerio) sont en train de devenir un modèle idéal pour compléter ce travail.
Zebrafish ont gastrointestinal similaire (GI) organes, le métabolisme des lipides, et le transport des lipoprotéines de vertébrés supérieurs 1,2, se développent rapidement, et sont génétiquement traitable. La clarté optique du poisson zèbre larvaire facilite les études in vivo, une particular avantage pour l' étude du système gastro - intestinal comme son milieu extracellulaire (ie, la bile, le microbiote, la signalisation endocrine) est pratiquement impossible de modéliser ex vivo. Conformément, un organisme de recherche combinant la traçabilité génétique et favorables à l' imagerie active des larves de poisson zèbre avec une variété de manipulations diététiques (riches en matières grasses 3,4, -cholestérol 5, et les régimes alimentaires 6,7), hydrate de carbone et des modèles de maladies cardio - vasculaires 8, le diabète 9,10, stéatose hépatique 11-13, 14-16 et de l' obésité, émergent de fournir une foule d'idées métaboliques.
Un aspect essentiel de la transition du poisson zèbre larvaire dans la recherche métabolique est l'optimisation des techniques développées dans d'autres modèles animaux au poisson zèbre et le développement de nouveaux tests qui exploitent les atouts uniques du poisson zèbre. Ce protocole présente les techniques développées et optimisées pour nourrir le poisson zèbre larvaire un lipid-repas riche, visualisent alimentaire traitement lipidique du corps entier à la résolution subcellulaire, et de mesurer l'apport alimentaire. jaune d'oeufs de poules a été choisi pour composer le repas riche en lipides, car il contient des niveaux élevés de graisses et de cholestérol (lipides composent ~ 58% de jaune d'oeuf de poulet, dont ~ 5% est le taux de cholestérol, 60% sont des triglycérides, et 35% sont des phospholipides ). Jaune poulet oeuf fournit plus de matières grasses que les aliments typiques commerciaux de poisson zèbre de micropellets (~ 15% de lipides) et l'avantage qu'il est un aliment normalisé avec des pourcentages connus d'espèces d'acides gras spécifiques, comme les régimes de poisson zèbre et régiments d'alimentation ne sont pas normalisées dans les laboratoires 17. En outre, les analogues de lipides fluorescents prévus dans le jaune d'oeuf visualiser le transport et l' accumulation de lipides alimentaires 18, les composants cellulaires d'image , y compris gouttelettes lipidiques en agissant les deux colorants vitaux 3 et par liaison covalente incorporation dans des lipides complexes, l' étude du métabolisme par chromatographie sur couche mince (CCM) 19 20.
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Protocol
Ces protocoles ont été approuvés par la Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care et utilisation Comité (protocole no. 139).
1. Préparation d'un animal
- Maintenir les adultes et les larves à 28 ° C sur un 14 heures: la lumière de 10 h: cycle d'obscurité. Nourrir les adultes deux fois par jour avec Artemia shell libre (decapsulated, non-éclosion, à partir de 14 dpf) et micropellets commerciales.
- Ces protocoles sont optimisés pour l'utilisation des larves de 6-7 dpf recueillies par la reproduction naturelle du fond de l'AB. Les protocoles peuvent être modifiés pour les larves d'autres âges et origines. Ne pas fournir la nourriture exogène avant le 6 dpf.
- Anesthetize larves avec Tricaine dans les milieux de l'embryon (EM) (4,2 ml de 4 mg / Tricaine ml par 100 ml EM) à la température ambiante (RT).
2. Préparation de Lipid riche Egg Yolk RSS
- Préparer et stocker les jaunes d'œufs de poulet. Séparez le jaune et le blanc de 12 œufs de poule. Réunir les jaunes, aliquote de 1 ml dans 1,5tubes ml, et conserver à -80 ° C jusqu'à 1 an (12 jaunes feront ~ 80 aliquotes). Rassembler les blancs, stocker et utiliser comme un aliment riche en protéines pauvre en lipides.
- Préparer fluorescent analogique (s) lipide à ajouter à la charge de jaune d'oeuf, si désiré.
- Suspendre le acheté, poudre analogue lipidique fluorescent dans 100% d'éthanol ou 100% de chloroforme à 0,1 pg / pl (voir note suivante discuter des solvants), aliquote dans des tubes de verre opaque, sceller avec du parafilm, et stocker selon les instructions du fabricant. En raison de l'évaporation rapide des solvants organiques ne pas utiliser des volumes de moins de ~ 400 pi pour le stockage à long terme aliquotes.
Remarque: Si l'analogue de lipide est mis en suspension dans de l' éthanol, des volumes importants de l'analogue de lipide sera utilisé car il sèche rapidement sous N2 de chloroforme. Si l'analogue de lipide est mis en suspension dans de l'éthanol, il n'a pas besoin d'être séché et remis en suspension avant de l'ajouter à la charge des liposomes à l'étape 2.2.4, mais la concentration totale d'éthanol ne doit pas dépasser 0.1% dans l'alimentation du liposome pour éviter les effets physiologiques potentiellement confondants de l'éthanol. - Fluorescentes pour les analogues d'acides gras: préparer un volume total de 20 ml de 5% de jaune d'oeuf dans l'émulsion EM. A partir de ce préparer aliquotes de 5 ml avec une concentration finale de 6,4 pM de 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène (BODIPY C 16) pour l' imagerie confocale en temps réel et la consommation alimentaire des dosages ou 1 pg / ml BODIPY C 12 pour l' imagerie stéréoscopique. Transférer la quantité désirée de l'analogue de lipide fluorescent dans un tube en plastique de 1,5 ml. Sécher le lipide sous un courant de N 2, en prenant soin de ne pas souffler le lipide du tube.
- Immédiatement, remettre en suspension dans 5 ul éthanol à 100% par pipetage un flux sur les côtés du tube, ajouter 95 ul EM, et bien mélanger.
Remarque: Le mélange doit apparaître homogène; si lipide de couleur se dépose sur les parois du tube ou le liquide soit grumeleux, le lipide n'a pas complètement solubilisé et nécessite plus d'éthanol. Protéger le tube from de lumière et de stocker sur la glace. - Pour fluorescent analogue de cholestérol: préparer une concentration finale de 2,4 pg / ml de cholestérol dans 5 ml d'émulsion de 0,5 à 5% de jaune d'oeuf pour des études d'imagerie en direct. Transférer la quantité désirée de cholestérol dans un tube en plastique de 1,5 ml. Sécher le lipide sous un courant de N 2, en prenant soin de ne pas souffler le lipide du tube.
- Immédiatement, remettre en suspension dans 15 pi de RT éthanol à 100% par pipetage un flux sur les côtés du tube et mélanger avec 85 pl de RT 1% de BSA sans acide gras dans H 2 O. purifié Protéger le tube de la lumière et de stocker sur la glace.
- Suspendre le acheté, poudre analogue lipidique fluorescent dans 100% d'éthanol ou 100% de chloroforme à 0,1 pg / pl (voir note suivante discuter des solvants), aliquote dans des tubes de verre opaque, sceller avec du parafilm, et stocker selon les instructions du fabricant. En raison de l'évaporation rapide des solvants organiques ne pas utiliser des volumes de moins de ~ 400 pi pour le stockage à long terme aliquotes.
- Préparer Egg Yolk liposome RSS.
- Ajouter un aliquote décongelé de jaune d'oeuf à EM dans un tube conique de 50 ml. Vortex le mélange de jaune d'oeuf dilué pendant 1-2 min; le mélange doit apparaître comme une émulsion homogène.
- Verser le mélange à travers une passoire fine pour éliminer les conglomérats de protéines et de recueillir dans un nouveau 50 ml tube conique, frais.
- Pulse sonicatE le mélange d'oeuf avec une micropointe conique un quart de pouce (5 fois (5 x 1 sec sur, 1 sec off) arrêtant 5-10 secondes entre chaque série, l'intensité de sortie: 6 W) à la température ambiante pour créer des liposomes. les paramètres d'alimentation de sonicateur sont dépendants instrument et nécessitent donc l'optimisation pour chaque instrument et micropointe.
Remarque: la roche en continu le mélange de liposomes à température ambiante pour maintenir l'homogénéité jusqu'à utilisation.
- Ajouter l'analogue de lipide fluorescent aux liposomes de jaune d'oeuf, si désiré. Immédiatement après sonication, pipeter les lipides préparés dans le mélange de liposome et vortex à grande vitesse pendant 30 secondes à incorporer dans des liposomes. Protéger le mélange de la lumière en enveloppant le tube en aluminium et continuer à bascule à la température ambiante.
3. Alimentation Paradigm
- Préparer le Larves pour l'alimentation.
- Avant de commencer l'alimentation, les larves d'écran pour des défauts évidents morphologiques qui peuvent entraver l'alimentation. Transfert des larves à 60 mm x 15 mm des boîtes de Pétri ou 6 ou 12 puits plates, réduire EM à un minimum, et le remplacer par 5 ml de la solution de liposomes préparée.
- Si nécessaire, transférer les larves de contrôle unfed à 5 ml EM et / ou 5 ml 5% de blanc d'oeuf dans EM et de traiter en parallèle.
- Agitez doucement les larves dans un rocker incubés (29-31 ° C à 30 tours par minute) tout au long de l'alimentation pour encourager l'apport alimentaire tout en continuant à protéger de la lumière si les analogues de lipides fluorescents sont présents. Si les larves ont besoin d'être exposé à la lumière, minimiser l'exposition avec un couvercle de l'incubateur de verre teinté.
- A la fin de la période d'alimentation, rincer les larves nageant librement dans EM 3 fois.
Remarque: Les larves peuvent commencer à consommer des liposomes à tout moment au cours de l'alimentation. S'il est essentiel que les larves commencent à alimenter en même temps, l'écran de la prise alimentaire (voir 3.4) après 1 heure de l'alimentation et de retour seules les larves qui ont commencé l'alimentation à l'émulsion de jaune d'oeuf pour compléter l'alimentation. - Screen les larves à ce stade pour la prise alimentaire comme un petit nombre ne peut pas eat (en général ~ 0-5%). Examiner l'intestin des larves qui ont été anesthésiés ou légèrement refroidies sur un bloc de métal sur de la glace pour déterminer si elles sont alimentées: des larves qui ont consommé des liposomes aura un intestin sombre (figure 1).
- Image ou processus larves pour la prise de nourriture immédiatement. Alternativement, le lieu des larves dans l'eau douce EM et incuber à 28 ° C pour permettre la transformation métabolique de se produire.
4. Larves de montage pour l'imagerie en direct
- Préparer le milieu de montage.
- Pour 3% de méthylcellulose: ajouter 0,75 g de cellulose de méthyle à 25 ml de près ébullition EM, vortex, roche à RT 2-3 jours jusqu'à dissolution complète, et conserver à 4 ° C pour les années à -20 ° C. Des cycles répétés de gel et de dégel à 4 ° C va supprimer les bulles d'air. Rangez 3% de méthylcellulose sur la glace lors du montage des larves.
- Pour 1,2% low-mount agarose: ajouter 0,3 g de faible fondre agarose à 25 mL EM et dissoudre en amenant à ébullition, aliquote dans 2 ml tubes, et maintenir à 26-28 ° C sur un bloc thermique. inutilisées des aliquotes peuvent être stockées à température ambiante ou à -20 ° C et on fait bouillir à nouveau au moment de l'utilisation. Assurez-vous que l'agarose est suffisamment refroidi avant d'exposer à des larves ou ils peuvent être trop chauffé.
- Pour un faible grossissement, à débit moyen d'imagerie en direct, placez une lame de verre sur un tissu sur un bloc de métal sur la glace et attendre la diapositive à refroidir. Appliquer une quantité généreuse de 3% de méthylcellulose (qui a été maintenu à 4 ° C sur la glace) sur la lame, transférer une larve sur la cellulose de méthyle de 3%, en utilisant un poker de ligne de pêche (ligne de pêche de diamètre 0,41 mm collé à la extrémité d'un tube capillaire en verre) créer une troth pour drainer l'excès EM (de sorte que la méthylcellulose ne sera pas dilué) et positionner les larves comme on le souhaite.
- Pour court terme (<20 min), à fort grossissement imagerie en temps réel avec un objectif verticale d'émersion de l'huile, les larves avec la lamelle méthode appentis pour monter.
- Utilisez de la colle cyanoacrylate à base (superglue) àattacher aa 22 mm x 30 mm, la lamelle à une extrémité d'une lame de verre. Utilisez un tisonnier pour mettre une fine ligne de 3% de méthylcellulose sur la diapositive à côté de la lamelle et transférer les larves à la diapositive avec un large trou Pasteur pipette. Enlever l'excès EM afin de ne pas diluer la cellulose de méthyle.
- L'utilisation d'un poker, placer délicatement les larves dans la cellulose de méthyle sur leurs côtés (côté gauche jusqu'à l'image plus du foie, côté droit jusqu'à l'image de la vésicule biliaire) avec leurs têtes à côté de la lamelle.
- Coin superglue dans les coins d'une seconde lamelle couvre-objet et placez doucement un bord de la lamelle couvre-objet sur la lamelle montée et l'autre sur le coulisseau, en comblant les larves. Prenez soin de ne pas appliquer une pression excessive au cours de cette étape ou avec l'objectif tout en imagerie de sorte que les larves restent indemne.
- Pour le long terme, l'imagerie à fort grossissement avec un objectif à immersion verticale, les larves de montage dans l'agarose. Ajouter une larve à une petite aliquote de 1,2% à faible masse fondue agarose puis transférer lelarve dans un petit volume d'agarose dans une boîte de pétri.
- Placez rapidement les larves avec un tisonnier avant la solidification d'agarose. Permettre l'agarose à sécher pendant 2-3 min et couvre entièrement l'agarose avec des produits frais EM pour l'empêcher de sécher.
- Pour le long terme, l'imagerie à fort grossissement avec un objectif inversé, les larves monter sur un plat à fond de verre dans l'agarose.
- Refroidir un bloc de métal sur la glace. Placer le récipient sur le bloc de métal séparé par un tissu pour empêcher un refroidissement excessif et la congélation des larves. Transférer une larve à l'antenne et retirez le EM en évacuant avec un tissu.
- Déposer une goutte de 28 ° C à faible masse fondue agarose (1,2%) au-dessus de la larve et de positionner immédiatement avec un tisonnier (côté gauche vers le bas pour meilleure image du foie, côté droit vers le bas à l'image de la vésicule biliaire). Retirer le plat du bloc froid, laisser sécher pendant 2-3 min, et ajouter un volume suffisant de EM frais pour couvrir l'agarose (~ 2-5 ml).
Apport 5. alimentaireEssai
- A la fin d'une charge de liposome de jaune d'oeuf contenant 6,4 uM BODIPY C 16, en commun un minimum de 10 larves lavé dans un tube de 1,5 ou 2 ml en plastique, retirez EM, et enclenchez gel. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C, à l'abri de la lumière pendant plusieurs mois.
Remarque: Si possible, recueillir des multiples répétitions. Il est important de recueillir les larves unfed à cette étape pour normaliser fond lipidique fluorescence (idéalement les larves de la même embrayage sont utilisés). - Effectuer une extraction des lipides Bligh-Dyer modifiée 3,21.
- Ajouter 100 ul de tampon d'homogénéisation (20 mM de Tris-Cl, 1 mM EDTA) à l'échantillon sur la glace (H 2 O alternativement purifié peut être utilisé). Homogénéiser sur la glace avec un sonicateur à micropointes (5 sec total: 1 sec sur 1 sec off). Vérifiez que les larves sont totalement homogénéisé; sinon, répéter. Transfert à un tube 13 ml de culture en verre jetable (autres tubes de verre peuvent être utilisés).
Remarque: Le chloroforme est dangereux; effectuer tous les ex lipidique ultérieureles étapes de traction à la température ambiante dans une hotte chimique. - Pour chaque 100 pi de tampon d'homogénéisation utilisé, ajouter 375 ul de 1: 2 (chloroforme: methanol). Vortex 30-60 sec, incuber 10 min, ajouter 125 ul de chloroforme pour 100 tampon d'homogénéisation ul utilisé, et le vortex 30 sec.
- Ajouter 125 ul de 200 mM Tris pH 7,5 par 100 tampon d'homogénéisation ul utilisé, vortex 30 sec, et centrifuger (2000 x g, 5 min, RT, protégé de la lumière). Retirez délicatement les échantillons de la centrifugeuse. Ils seront séparés en deux phases: une phase aqueuse supérieure est une interface de débris des larves, et une phase organique inférieure (contient des lipides).
- Avec une pipette en verre propre recueillir le fond, la phase organique et le transférer dans un tube de verre de 13 ml propre.
Remarque: Prenez soin d'éviter la phase aqueuse et les débris des larves à l'interface; si la contamination se produit, répétez l'étape de centrifugation et de se souvenir. Jeter la phase aqueuse supérieure; il peut être utile pour enlever et jeter cephase précédant la collecte de la phase organique. L'échantillon peut être conservé à -80 ° C pendant jusqu'à 1 mois. - Sécher la phase organique sous vide (0,12 atm), tout en protégeant de la lumière. Ne pas continuer à sécher les échantillons après évaporation du liquide car il permettra de réduire la solubilité des lipides. Resuspendre les lipides dans 2: 1 (chloroforme: méthanol) et de stocker sur la glace. Le volume optimal du chloroforme et une solution de methanol dépend de la méthode de détection utilisée; commencer bas et continuer à diluer au besoin. Une ligne directrice générale est d'utiliser 10 pi pour 10 larves groupé.
- Ajouter 100 ul de tampon d'homogénéisation (20 mM de Tris-Cl, 1 mM EDTA) à l'échantillon sur la glace (H 2 O alternativement purifié peut être utilisé). Homogénéiser sur la glace avec un sonicateur à micropointes (5 sec total: 1 sec sur 1 sec off). Vérifiez que les larves sont totalement homogénéisé; sinon, répéter. Transfert à un tube 13 ml de culture en verre jetable (autres tubes de verre peuvent être utilisés).
- Découvrir les volumes d'échantillons entiers dans des intervalles espacés uniformément sur une plaque de CCM canalisé et balayer la plaque avec un scanner laser couramment utilisé pour l' imagerie biomoléculaire (par exemple, un lecteur de plaque fluorescente). Pour les analogues de lipides fluorescents inclus dans la liste des matériaux qui ont un maximum d'excitation 500-650 maxima nm et émission 510-665 nm, utiliser un laser à 488 nm et à la collecte d'émission à 520 nm.
- Quantifier la fluorescence totale de chaque tache avec un logiciel d'imagerie.
Note: Correct pour le fond lipidique fluorescence naturelle en soustrayant la fluorescence des paires, des échantillons larvaires à jeun.
- Quantifier la fluorescence totale de chaque tache avec un logiciel d'imagerie.
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Representative Results
Lorsque alimenté sur une bascule à 29-31 ° C, la majorité des larves saines (≥95%) sera manger dans 1 h. À consommer l'émulsion de jaune d'oeuf, l'intestin des larves obscurcit en couleur. Très intestins sombres peuvent être observés à 2 h (figure 1). Si les larves sont unfed ou ne parviennent pas à se nourrir, l'intestin reste claire. Larves oeuf nourri d'exposition blanche un distendus de lumière intestinale qui ne noircissent pas en couleur.
Figure 1:. Screening Larves pour la prise alimentaire de type sauvage larves 6 dpf ont été nourris avec 5% de jaune d'oeuf dans EM pendant 2 heures ou traités en parallèle dans EM pour obtenir des contrôles à jeun. Les larves à jeun ont des intestins claires alors que les larves nourris qui ont consommé le jaune d'œuf ont des intestins sombres où imagé à 10X sur un stéréoscope. Les barres d'échelle représentent 0,1 mm.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Nourrir avec des analogues de lipides fluorescents permet la visualisation du transport systémique et de l'accumulation intracellulaire de lipides alimentaires. Le signal fluorescent est présent dans les organes digestifs (intestins, le foie et le pancréas) des larves nourries 5% de jaune d'oeuf avec 6,4 uM fluorescent C 16 analogique pendant 8 heures monté avec la lamelle appentis procédé et imagé avec un objectif vertical (Figure 2) 3.
Figure 2:. Fluorescent Lipid Analogues Visualize Dietary Lipid Transport image composite représentant d'une larve 6-DPF (tête tournée vers la droite) alimenté 5% de jaune d'oeuf dans EM avec 6,4 uM BODIPY FL C 16 pendant 8 heures. Les larves a été monté dans 3% de méthylcellulose par la lamelle couvre-objet appentis procédé et imagée avec un montant 63X un objectif à immersion d'huile sur un seul photon confocal avec un laser à argon. Les barres d'échelle représentent 20 um. Foie, L; intestin, I; pancréas, P, la vésicule biliaire, GB; réimprimé avec la permission de Dev Bio 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Divers analogues de lipides permettent de visualiser des ensembles uniques de structures cellulaires car ils sont métabolisés de manière différentielle dans les lipides complexes ( par exemple, des triglycérides, des esters de cholestérol, phospholipides). Après 4-8 h nourrit, fluorescent C 16 et C 12 analogues étiqueter des gouttelettes lipidiques, fluorescentes FL C 5 étiquettes gouttelettes lipidiques, canaux hépatiques et pancréatiques, les membranes cellulaires et les réseaux artériels et fluorescent C 2 analogiques étiquettes hépatiques et pancréatiques et cellulaire membranes (figure 3) 3.
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Figure 3:. Différent Fluorescent Lipid Analogues Étiquette uniques cellulaires Organes images composites représentatifs de larves nourries 5% de jaune d'oeuf dans EM avec 6,4 uM BODIPY FL C 16, C 12, C 5 ou C 2 pour 4-8 heures (6 dpf) . C 16 analogue est observé dans les gouttelettes lipidiques (LD) d'entérocytes, C 12 et C 5 analogues à entérocytes LD et la lumière intestinale et C 2 analogiques dans la lumière intestinale. Les larves ont été montés dans 3% de méthylcellulose par la lamelle couvre-appentis procédé et imagé avec un objectif 63X à immersion verticale de l'huile sur un seul photon confocal avec un laser à argon. Les barres d'échelle représentent 20 microns. Reproduit avec la permission de modèles Drug Discov Aujourd'hui Dis 22._blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le dosage de l'apport alimentaire des larves a été développé pour étudier la façon dont des mutations génétiques, la surexpression du gène transgénique et / ou un traitement exogène affecte la prise de nourriture des larves. Les larves sont nourris avec un repas riche en lipides dopés avec un analogue lipidique fluorescent pour indiquer la quantité de nourriture consommée. Les larves non alimentées en parallèle sont recueillies pour normaliser la quantité de fluorescence de fond présent dans des larves, ce qui augmente la sensibilité à laquelle l'analogue de lipide fluorescent peut être détectée. Cet essai a été utilisé pour montrer que la surexpression de l'apolipoprotéine A-IVb.1 (apoA-IVb.1) diminue la prise alimentaire. Auparavant unfed Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) larves nourries 10% de jaune d'oeuf avec 6,4 uM fluorescent C 16 analogique pendant 4 heures à 7 dpf consommé environ 30% moins de lipides que les larves de type sauvage (figure 4) 20.
Figure 4:. Représentant apport alimentaire Assay sauvage de type (WT) et Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) (Tg) larves ont été nourries 10% de jaune d'oeuf de poule avec 6,4 uM BODIPY FL C16 pendant 4 heures (Fed) ou traités en parallèle dans EM (à jeun). (A) Les larves ont été mises en commun (n = 10), les lipides ont été extraits et les extraits ont été déposés sur une plaque de CCM. (B) la fluorescence totale a été quantifiée, exprimée en unités arbitraires fluorescentes (AFU), normalisées pour la fluorescence de fond dans la fratrie à jeun par soustraction, et exprimée par rapport à WT. Tg larves surexprimant ApoA-IVb.1 ingère moins de lipides analogues marqués par fluorescence , comme indiqué par rapport à WT (test t apparié de Student, p <0,001; n = 9, 20 larves par expérience). La boîte représente les 25-75 e percentiles, et la médiane est indiquée. Les moustaches indiquent les 10-90 e percentiles. Reproduitavec la permission de Dis Modèle Mech 20. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les techniques décrites ici permettent aux chercheurs de traiter des larves de poisson zèbre avec une alimentation riche en lipides, visualiser le traitement des lipides alimentaires dans des larves vivantes, et de quantifier l'apport alimentaire des larves. Pour assurer le succès, une attention particulière devrait être accordée à plusieurs étapes critiques. œufs de poule commerciales varient; pour réduire au minimum la variabilité potentielle que nous effectuons tous les tests sur les oeufs organiques des poulets sans cage qui ne sont pas enrichies en acides gras oméga-3. Les taux d'alimentation plus faibles peuvent être observés dans les poissons de moins de 6 dpf avec le reste endogènes fournitures de jaune d'énergie, le poisson malsain, ou de poissons avec des mutations de développement qui entravent la prise alimentaire (ie, la mâchoire ou malformation intestinale, l' incapacité de nager correctement). Le laboratoire Farber effectue généralement des études d'alimentation à 6-7 jours après la fécondation (dpf) parce que les larves ne nécessitent pas de nourriture exogène jusqu'à ce que leurs magasins de jaune endogènes sont épuisées et le jaune déplétion permet une meilleure visualisation du système digestif. Alimentationà la température ambiante a également réduit considérablement le nombre de larves qui mangent. Défaut de larves d'écran pour la prise alimentaire et l'inclusion involontaire de larves unfed dans des expériences ultérieures peuvent confondre les résultats. En outre, il est important de protéger les analogues de lipides fluorescents, et tous les échantillons de larves nourries avec les analogues de la lumière, lorsque cela est possible de maintenir la fluorescence maximale et la sensibilité ainsi dosage. Enfin, si l'apport alimentaire sera mesuré, ne permettent pas l'alimentation et de la chasse (période de métabolisme post-alimentation) de dépasser un total de 4 heures, depuis le repas va commencer à être excrétée. Actuellement, le taux auquel le repas et des analogues fluorescents lipidiques associés sont excrétés est inconnue, mais la fluorescence peut persister dans tout le corps larvaire pendant au moins 2 jours après alimentation (JPO et SAF données non publiées).
Il existe plusieurs façons de modifier et dépanner les protocoles pour répondre aux questions expérimentales d'intérêt. L'alimentation riche en lipides peut être effectuée pendant diverses périodes de tIme: 1 h fournira un petit repas, tandis que 4 h remplira l'intestin avec une grande quantité de lipide. Toutefois, nourrir les larves plus de 6 heures est pas recommandé que le jaune et le EM ne sont pas préparés dans des conditions stériles et la prolifération bactérienne dans le jaune d'oeuf / émulsion blanche peuvent brouiller les résultats (c. -à- inflammation accrue, le profil de microbiote intestinal modifié). Larves peut être examiné immédiatement après le repas pour étudier les effets aigus de l'alimentation Larves immobilisée par un bref refroidissement ou l'anesthésie commence rapidement à nourrir à nouveau après le réchauffement, mais le refroidissement est la méthode préférable d'immobilisation sous forme de larves peuvent présenter des vomissements lors de l'anesthésie (observation non publiée SAF). En variante, les périodes de chasse peuvent être effectués après la charge afin de permettre le transport et le métabolisme des lipides alimentaires avant l'étude. Bien que les aliments sont généralement effectuées dans une solution de 5 ml de liposomes, les aliments ont été effectuées avec succès dans des volumes allant de 1 à 20 ml. diverses concentrationss de jaune d'oeuf peut être utilisé pour les aliments des larves; le laboratoire Farber effectue régulièrement des expériences avec 5% de jaune d'oeuf (1 ml de jaune d'oeuf ajouté à 19 ml EM), 0,5% de jaune d'oeuf, et 10% de jaune d'oeuf.
Il y a des limites potentielles d'analogues de lipides fluorescents qui doivent être considérés. Lors du choix d'un analogue de lipide fluorescent, il est important d'examiner comment le lipide est traité physiologiquement et où le groupement fluorescent est sur la structure chimique du lipide lors de l'interprétation des résultats. Par exemple, les triglycérides sont décomposés en acides gras libres et du glycérol, et les esters de cholestérol en cholestérol et en acides gras libres, dans la lumière intestinale avant l'absorption. Par conséquent, si un triglycéride ou un ester de cholestérol analogue fluorescent est fourni dans le régime de la fluorescence observée dans le corps va suivre l'acide gras, de cholestérol libre, ou de glycérol que la fraction fluorescente est fixée à, et non le triglycéride ou ester de cholestérol d'origine. différent fluorescenanalogues t lipidiques étiquette structures cellulaires uniques, et ce fait doit être pris en considération lors de la sélection 3. À noter également, par rapport au métabolisme des acides gras natifs, l'addition d'un fragment BODIPY est à peu près équivalente à l'addition ~ 2-3 atomes de carbone à la longueur de la chaîne d'acides gras (FAS données non publiées).
Les techniques décrites ici constituent des progrès importants par rapport aux essais antérieurs décrits dans le domaine. Études Avant le développement de cet œuf de poulet jaune alimentation, deux manuscrits détaillés dans lesquels les larves ont été nourris alimenté œuf dur jaune d' oeuf 4,23. La technique décrite ici présente l'avantage que le jaune d'oeuf n'a pas besoin d'être cuit dur et de poudre avant l'utilisation et que le jaune d'oeuf en poudre a une demi-vie très courte en raison de son oxydation rapide. Liquide jaune d'oeuf peut également être préparé sous forme de liposomes qui acceptent facilement des analogues de lipides fluorescents pour la livraison diététique efficace. En variante, des lipides radiomarqués peuvent être utilisés pour Investigate métabolisme des lipides alimentaires et de mesurer l'apport alimentaire, mais les analogues de lipides fluorescents ne présentent pas les risques de sécurité liés à la radioactivité. Toutefois , si les chercheurs souhaitent utiliser des lipides radiomarqués, le laboratoire Farber a effectué des études pour vérifier que les lipides radiomarqués peuvent être incorporés dans, et alimenté avec succès, des liposomes 19. Les analogues de lipides fluorescents décrits ici ont été choisis parce qu'ils montrent le métabolisme très similaires à des lipides endogènes et radiomarqués, et étaient suffisamment lumineux pour faible et l'imagerie à haute puissance.
Précédant le développement de cette technique pour alimenter les analogues de lipides fluorescents pour les larves, pas d' autres méthodes sont disponibles pour visualiser le transport des lipides alimentaires et de l' accumulation in vivo. La visualisation directe des analogues de lipides fluorescents peut fournir un avantage sur l'utilisation des mesures indirectes de la physiologie, comme les lipides sériques. La mesure précise de l'apport alimentaire de poisson zèbre larvaire était aussi un long standing défi dans le domaine. La seule alternative était de culture paramécie, les étiqueter avec le traceur fluorescent lipophile 4- (4- (didécylamino) styryle) - N iodure -methylpyridinium (4-Di-10-ASP), permettent aux larves de se nourrir, et de mesurer la fluorescence la zone intra-abdominale avec un lecteur de plaque 24. Enfin, ces techniques ont l'avantage d'être applicable aux deux écrans à moyen débit ( par exemple, les écrans génétiques avant de traitement des lipides alimentaires), ainsi que des études d'imagerie à fort grossissement concentré (c. -à- génétique inverse, des études hypothèse motrices). À l'avenir, ces techniques peuvent être appliquées à phénotype et l'écran divers modèles de GI métabolique et la maladie chez le poisson zèbre.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
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