Introduction
bağırsak diyet lipit işleme düzenleyen mekanizmalar, karaciğer karmaşık lipit sentezi ve lipoprotein metabolizmasını kontrol eder ve bu organların besin alımını kontrol etmek için merkezi sinir sistemi ile çalışmak nasıl tam olarak anlaşılamamıştır. Obezite, kalp-damar hastalıkları, diyabet ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının mevcut salgın hastalıklar ışığında bu biyoloji aydınlatmak için biyomedikal ilgi çekicidir. Hücre kültüründe Çalışmalar ve fareler diyet lipidler ve hastalık ve Zebra balığı (Danio rerio) arasındaki mekanik ilişkileri anlayışımız çoğunluğu sağladı bu çalışmayı tamamlamak için ideal bir model olarak ortaya çıkmaktadır.
Zebra balığı, yüksek omurgalılar 1,2 benzer gastrointestinal (Gİ) organları, lipid metabolizmasını ve lipoprotein ulaşım var hızla geliştirmek ve genetik uysal vardır. Larva zebrafish optik netlik in vivo çalışmalar kolaylaştırır, bir particulahücre dışı ortamın olarak GI sistemin çalışması için r avantajı (yani, safra, Mikrobiyota, endokrin sinyal) ex vivo. uyarınca, genetik, izlenebilir ve vesile birleştiren araştırma vücut ile Zebra balığı larvalarının görüntüleme yaşamak için modellemek için neredeyse imkansız bir diyet manipülasyonlar (yüksek yağ 3,4, kolesterol 5 ve -Karbonhidrat diyetler 6,7), ve kardiyovasküler hastalık 8 modelleri çeşitliliği, diyabet 9,10, karaciğer yağlanması 11-13 ve obezite 14-16, metabolik anlayışlar bir dizi sağlamak için ortaya çıkıyor.
Metabolik araştırma içine larva Zebra balığı geçiş önemli bir yönü zebrabalıkları ve Zebra balığı benzersiz güçlü istismar yeni testlerin gelişmesine diğer model hayvanlarda geliştirilen tekniklerin optimizasyonu olduğunu. Bu protokol teknikleri Lipi larva zebrafish beslemek için geliştirilmiş ve optimize edilmiş sunulurD-zengin yemek, hücre içi çözünürlük bütün vücut diyet lipit işleme görselleştirmek ve gıda alımını ölçün. o yağ ve kolesterol (lipidler ~ tavuk yumurtası,% 60 trigliserit kolesterol ~% 5 olduğu sarısı, ve% 35% 58 fosfolipit vardır oluşturan yüksek seviyede içerdiği tavuk yumurta sarısı lipit bakımından zengin bir yemek oluşturmak için seçildi ). Zebra balığı diyetler ve beslenme alayları laboratuarları 17 arasında standardize edilmemiştir olarak tavuk yumurta sarısı, tipik ticari zebrabalıkları Mikropellet gıdalar (~% 15 lipidler) ve belirli yağ asitleri türlerin bilinen yüzdeleri ile standartlaştırılmış bir yem olduğu avantajı daha fazla yağ sağlar. Ayrıca, yumurta sarısında Resim Floresan bir lipid analoglan ince katman kromatografisi yoluyla metabolizmasını araştırmak taşıma ve diyet lipidlerin 18 birikimini, hayati boya 3 ve karmaşık lipidlere kovalent eklenmesi ile, her iki hareket ederek lipid damlacıkları olarak resim hücresel bileşenleri görselleştirmek (TLC) 19 20 için sayısal bir tahlil sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoller Bilim Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Carnegie Institution (protokol no. 139) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvan hazırlanması
- 14 saat 28 ° C'de yetişkin ve larvaları korumak: 10 saat aydınlık: karanlık döngüsü. Kabuk serbest Artemia (decapsulated olmayan taramalarla, 14 dpf'e başlayarak) ve ticari mikropelletler ile günde iki kez yetişkin besleyin.
- Bu protokoller AB kökenli doğal yumurtlama tarafından toplanan 6-7 dpf larvaları kullanımı için optimize edilmiştir. Protokoller diğer yaştan ve her kökenden larvalar için modifiye edilebilir. eksojen yiyecek önce 6 dpf vermeyin.
- Embriyo medya Tricaine (EM) ile larva, oda sıcaklığında (RT) (4 mg, 100 ml EM başına / ml Tricaine 4.2 mi) anestezisi.
Lipid zengin Yumurta Sarısı Feed 2. Hazırlık
- Hazırlayın ve tavuk yumurta sarılarını saklayın. 12 tavuk yumurtası sarısı ve beyaz ayırın. , Kısım 1 mi 1.5 içinde sarısı Havuz1 yıla kadar -80 ° C up ml tüpler ve mağaza (12 sarısı ~ 80 alikotları yapacaktır). beyazlar, mağaza havuz ve lipid-fakir, proteince zengin yem olarak kullanmak.
- İstenirse Hazırlama Floresan bir lipid analoğu (ler) Yumurta sarısı beslemesine eklenmesini sağlar.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, opak cam tüplerde, kısım (aşağıdaki nota çözücüler tartışmaya bakınız) / ml 0.1 ug% 100 etanol veya% 100 kloroform içinde alınan, toz haline getirilmiş Floresan bir lipid analoğu Askıya parafilm ile kaplayın ve saklayın. Nedeniyle organik çözücü, hızlı buharlaştırma, uzun süreli depolama için ~ 400 ul daha az kısım birimleri kullanmayın.
Not: bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edildiği takdirde, kloroform fazla N2 altında daha hızlı kurur, bir lipid analoğu olan büyük miktarlarda kullanılır. bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edilir ise, adım 2.2.4 lipozom besleme eklemeden önce kurutuldu ve yeniden süspansiyon haline olmak zorunda değildir, ancak toplam etanol konsantrasyonu 0 geçmemelidir.Lipozom besleme içinde% 1 etanol, potansiyel olarak karıştırıcı fizyolojik etkilerini önlemek için. - Floresan yağlı asit analoglan için: EM 20 ml% 5 yumurta şansı emülsiyonun toplam hacmi hazırlayın. Bu kaynaktan canlı konfokal görüntüleme ve gıda alımı deneylerinde ya da 1 ug / ml 6.4 uM 4,4-difloro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indasen bir son konsantrasyon (BODIPY Cı 16) 5 ml lik kısımlar halinde hazırlanması stereomikroskop görüntüleme için BODIPY C12. 1.5 ml'lik plastik tüp içine Floresan bir lipid analoğu istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun.
- Hemen tüpün tarafı aşağı akışı pipetleme 5 ul% 100 etanol içinde tekrar süspansiyon, 95 ul EM ekleyin ve iyice karıştırın.
Not: Karışım homojen görünmelidir; renkli lipit tüp tarafta kalır veya sıvı clumpy belirirse, lipit tamamen çözülmüş ve daha etanol gerektirir değil. fro tüp korumakbuz üzerinde m ışık ve mağaza. - Floresan kolesterol analog: Canlı görüntüleme çalışmaları için 5 mi% 0.5-5, yumurta sarısı, emülsiyon 2.4 ug / ml kolesterol bir son konsantrasyon hazırlar. 1.5 ml'lik plastik tüp içine kolesterol istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun.
- Hemen sonra, tüp iki aşağı akış pipetleme saflaştınldı H2O RT% 1 yağ asidi içermeyen BSA 85 ul karışımı ile RT% 100 etanol içinde 15 ul içinde süspanse Işıktan tüp korumak ve buz üzerinde saklayın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, opak cam tüplerde, kısım (aşağıdaki nota çözücüler tartışmaya bakınız) / ml 0.1 ug% 100 etanol veya% 100 kloroform içinde alınan, toz haline getirilmiş Floresan bir lipid analoğu Askıya parafilm ile kaplayın ve saklayın. Nedeniyle organik çözücü, hızlı buharlaştırma, uzun süreli depolama için ~ 400 ul daha az kısım birimleri kullanmayın.
- Yumurta Sarısı Lipozom Besleme hazırlayın.
- 50 ml konik tüp içinde EM yumurta sarısı bir çözülmüş kısım ekleyin. 1-2 dakika boyunca seyreltilmiş yumurta sarısı karışımını Vortex; Karışım, homojen bir emülsiyon olarak görünür.
- Yeni, taze 50 ml konik tüp protein holdingler kaldırmak ve toplamak için ince mesh süzgeç vasıtasıyla karışımı dökün.
- Darbe SONICAlipozom oluşturmak için RT'de: a dörtte inç konik mikrotip (6 W çıkış yoğunluğu her set arasında 5-10 sn duraklatma 5 kez (5 x 1 sn, 1 sn kapalı)) yumurta karışımını te. Sonikatör güç ayarları bağımlı enstrüman ve bu nedenle her enstrüman ve mikro uç için optimizasyon gerektirir.
Not: Sürekli kullanıma kadar homojenliği sağlamak için oda sıcaklığında lipozom karışımı sallayın.
- arzu edildiği takdirde, yumurta sarısı lipozomlara Floresan bir lipid analoğu ekleyin. Hemen Sonikasyon sonrasında, lipozomlar içine dahil 30 saniye boyunca yüksek hızda lipozom karışımı ve girdap içine hazırlanmış lipid pipetleyin. folyo tüp sararak ışıktan karışımı korumak ve oda sıcaklığında sallanan devam ediyor.
3. Besleme Paradigma
- Besleme için Larva hazırlayın.
- beslenme engelleyebilir belirgin morfolojik kusurlar için besleme, ekran larva başlamadan önce. 60 mm x 15 mm Petri kapları veya 6 veya 12-kuyu pla Transfer larvalarıTES EM asgariye düşürmek ve hazırlanan lipozom çözeltisi, 5 ml ile değiştirin.
- Gerekirse, EM 5 mi EM ve / veya 5 mi% 5 yumurta akı için beslenmemiş kontrol larvaları transferi ve paralel olarak tedavi.
- Yavaşça flüoresan lipid analogları varsa ışıktan korumak için devam ederken gıda alımını teşvik etmek için yem boyunca kuluçkaya rocker larvaları (30 rpm'de 29-31 ° C) sallayın. Larvalar ihtiyacı ışığa maruz kalması durumunda, bir renkli cam inkübatör kapaklı maruziyeti en aza indirmek.
- besleme süresinin sonunda, EM 3 kez özgürce yüzme larva durulayın.
Not: Larva besleme sırasında herhangi bir noktada lipozomlar alıcı başlayabilir. bu larvalar aynı anda beslenme başlaması önemlidir ise, gıda alımı için ekran besleme 1 saat sonra (3.4) ve beslemeyi tamamlamak için yumurta sarısı emülsiyonu ile besleme başlamıştır tek larvaları dönün. - az sayıda gıda alımı için bu noktada larvaları Ekran ea olmayabilirt (genellikle ~% 0-5). Onlar beslenen olmadığını belirlemek için buz üzerinde bir metal blok üzerinde anestezi ya da hafif soğutulmuş olan larva bağırsak inceleyin: lipozomlar tüketilen larva karanlık bir bağırsak (Şekil 1) sahip olacaktır.
- Hemen gıda alımı için görüntü veya işlem larvaları. Alternatif olarak, bir yerde taze EM larva ve 28 ° C'de inkübe metabolik işleme oluşmasına izin vermek.
Canlı Görüntüleme Larva Montaj 4.
- Montaj Medya hazırlayın.
- % 3 metil selüloz: -20 ° C 'de yıllık yakın kaynama EM, girdap, 4 ° C'de 2-3 gün tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında kaya ve mağaza 25 ml 0.75 g metil selüloz ekleyin. 4 ° C'de dondurma ve eritme işlemlerine ait döngülerin tekrar hava kabarcıkları kaldırır. larva montaj sırasında buz üzerinde% 3 metil selüloz saklayın.
- % 1.2 düşük montaj agaroz için: 0.3 g ilave 25 ml EM agaroz düşük eritmek ve 2 ml t içine kaynatın, kısım getirerek çözmekUBE ve sıcaklıkta bir blok üzerinde 26-28 ° C'de muhafaza. Kullanılmayan tam bölünen miktarları, oda sıcaklığında saklandı veya -20 ° C ve kullanım sırasında tekrar kaynatılır edilebilir. Agaroz larvalarının maruz ya da ısıtmalı aşırı olabilir önce işlemek için yeterli serin olduğundan emin olun.
- Düşük büyütme, orta hacimli canlı görüntüleme için, buz üzerinde metal bir blokta bir doku üzerinde bir cam slayt yerleştirin ve slayt soğumasını bekleyin. yapıştırılmış bir balıkçı satırı poker kullanarak,% 3 metil selüloz üzerine larva transferi, slayt üzerine (buz üzerinde 4 ° C'de muhafaza edilmiştir)% 3 metil selüloz bol miktarda uygulayın (0.41 mm çapında misina bir cam kılcal tüp sonu) bu metil selüloz seyreltilebilir olmayan (böylece aşırı EM drenaj) ve istenen şekilde larva konumlandırmak için troth oluşturun.
- kısa vadeli (<20 dk), bir dik yağ emersion amacı ile yüksek büyütmeli canlı görüntüleme, yöntem barınağa lamel ile larva monte edin.
- siyanoakrilat bazlı tutkal (Superglue) kullanınBir cam slayt bir ucuna aa 22 mm x 30 mm'lik bir örtücü cam ekleyin. lamel bitişik slaytta% 3 metil selüloz ince bir çizgi koymak ve geniş bir delik Pasteur pipetiyle slayt larva transfer etmek için bir poker kullanın. o metil selüloz sulandırmak olmayacak şekilde aşırı EM çıkarın.
- Bir poker kullanarak, yavaşça lamel yanında başlarını (sağ görüntü safra kesesi kadar yan, yukarı karaciğer daha fazla görüntüye sol taraf) onların yüzüne metil selüloz içinde larva yerleştirin.
- nazikçe ikinci lamel köşelerinde ve spot superglue larvaları köprü monte lamel lamel ve slayt diğer bir kenarını yerleştirin. Bu adım sırasında veya bu larvalar yaralanmamış kalırken görüntüleme böylece amacı ile aşırı baskı uygulamak etmemeye dikkat edin.
- Uzun vadede, dik daldırma amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz larva monte edin. agaroz sonra aktarmak% 1.2 düşük eriyik küçük bir kana bir larva ekleBir petri agaroz küçük bir hacme larva.
- Hızla Agaroz katılaşır önce poker ile larva yerleştirin. Agaroz 2-3 dakika kurumasını ve kurumasını önlemek için taze EM ile tam agaroz kapsayacak şekilde izin verin.
- Uzun vadede, ters amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz bir cam alt çanak larvalarını monte edin.
- Buz üzerinde bir metal blok soğutun. Aşırı soğutma ve larva donmayı önlemek için bir doku ile ayrılmış metal blok üzerinde çanak yerleştirin. çanak bir larva transferi ve bir doku ile fitilleme ile EM kaldırın.
- larva üstünde 28 ° C düşük erime agaroz (% 1.2) bir damla yerleştirin ve hemen bir poker (aşağı en iyi görüntüye sol tarafında karaciğer, safra kesesi aşağı görüntüye sağ tarafı) ile yerleştirin. Soğuk bloktan çanak çıkarın 2-3 dk kurumasını bekleyin ve agaroz kapsayacak şekilde taze EM yeterli hacim kazandırmak (~ 2-5 ml).
5. Gıda Alımıtahlil
- 6.4 uM BODIPY C16 ihtiva eden bir yumurta şansı lipozom Beslemenin sonunda, plastik bir 1,5 ya da 2 ml tüp içinde 10 yıkanmıştır larva az havuz EM çıkarın ve donma ek. örnekler birkaç ay boyunca ışıktan korunan -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Not: Eğer mümkünse, birden çoğaltır toplamak. (Kullanılan aynı kavrama ideal olarak larva) arka lipit floresan normalleştirmek için bu adımda beslenmemiş larvaları toplamak için önemlidir. - Modifiye Bligh-Dyer lipit çıkarma 3,21 gerçekleştirin.
- Buz üzerinde örnek (2 O kullanılabilir Alternatif olarak arıtılmış, lH), 100 | il homojenizasyon tamponu (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) ekleyin. (: 1 sn kapalı 1 sn 5 sn toplam) bir mikrotip sonikatör ile buz üzerinde homojenize. Bu larvaların tamamen homojenize olup olmadığını kontrol edin; değilse, tekrarlayın. 13 ml'lik atılabilir bir camdan yapılmış bir kültür tüpüne transfer (diğer cam tüpler kullanılabilir).
Not: kloroform tehlikelidir; Tüm takip eden lipit eski yerineBir kimyasal kaput oda sıcaklığında çekiş adımlar. - (: Metanol kloroform) 2: Kullanılan homojenizasyon tamponu her 100 ul için 1 375 ul ekleyin. Vortex 30-60 sn, kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu başına kloroform ve vorteks 30 sn 125 ul ekleyin, 10 dakika inkübe edilir.
- 200 mM Tris pH 125 ul ekle 7,5 kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu (ışıktan korunan 2,000 x g, 5 dakika, RT) vorteks 30 saniye ve santrifüj başı. Dikkatle santrifüj örnekleri kaldırın. Bir üst faz sulu bir larva kalıntılardan bir arayüz, ve bir alt organik faz (lipidler içerir) olarak iki faza ayrılır.
- temiz bir cam pipet ile alt organik fazı toplamak ve temiz bir 13 ml'lik cam tüp içine aktarın.
Not: arayüzde sulu fazı ve larva enkaz önlemek için özen gösterin; kirlenme meydana gelirse, santrifüj adımı ve hatırlamak tekrarlayın. Üst, sulu faz atın; o kaldırmak ve bu atmak yararlı olabilirOrganik fazı toplama önce aşaması. Örnek 1 aya kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir. - ışıktan koruyarak, vakum altında organik faz (0.12 atm) kurutun. lipid çözünürlüğü azaltacaktır gibi sıvı buharlaştırılarak sonra numuneleri kuru devam etmeyin. 2'de lipitleri tekrar süspansiyon: buz üzerinde ve mağaza: 1 (metanol kloroform). kloroform uygun hacmi: metanol çözeltisi kullanılan algılama yöntemine bağlı olarak değişir; düşük başlangıç ve gerektiği gibi sulandırmak devam ediyor. Genel kural 10 havuza larva için 10 ul kullanmaktır.
- Buz üzerinde örnek (2 O kullanılabilir Alternatif olarak arıtılmış, lH), 100 | il homojenizasyon tamponu (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) ekleyin. (: 1 sn kapalı 1 sn 5 sn toplam) bir mikrotip sonikatör ile buz üzerinde homojenize. Bu larvaların tamamen homojenize olup olmadığını kontrol edin; değilse, tekrarlayın. 13 ml'lik atılabilir bir camdan yapılmış bir kültür tüpüne transfer (diğer cam tüpler kullanılabilir).
- Bir kanalize TLC plaka üzerine eşit aralıklı aralıklarla tüm numune hacimleri nokta ve rutin biyomoleküler görüntüleme (örneğin, bir floresan plaka okuyucu) için kullanılan bir lazer tarayıcı ile plaka tarayın. 510-665 nm 500-650 nm ve maksimum emisyon bir maksimum eksitasyon sahip maddeler listesine dahil Floresan bir lipid analoglan için, 520 nm'lik bir emisyon toplama 488 nm lazer ve kullanımı.
- görüntüleme yazılımı ile her noktada toplam floresan ölçmek.
Not: Doğal eşleştirilmiş, beslenmemiş larva örneklerin floresan çıkarılarak arka plan lipit floresan meydana Doğru.
- görüntüleme yazılımı ile her noktada toplam floresan ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
29-31 ° C'de bir rocker verildiğinde, sağlıklı larvaların (≥95%) çoğunluğu 1 saat içinde yemek. yumurta sarısı emülsiyonu tüketen üzerine, larva bağırsak rengi koyulaşır. Çok koyu bağırsaklar 2 saat (Şekil 1) görülebilir. Larvalar beslenmemiş ya da beslemek için başarısız olursa, bağırsak açık kalır. Larva beslenen yumurta beyazı sergi renkli karartmak değil şişmiş bağırsak lümen.
Şekil 1:. Gıda Alımı için Larva tarama Yabani tip 6-dpf'e larvaları 2 saat EM% 5 yumurta sarısı ile beslenen ya da beslenmemiş kontrolleri elde etmek EM paralel olarak tedavi edildi. Stereoskop üzerinde 10X görüntülü zaman yumurta sarısı tüketilen beslenen larvalar koyu bağırsakları varken beslenmemiş larvaları açık bağırsakları var. Ölçek çubukları 0.1 mm temsil etmektedir.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Floresan bir lipid analogları ile besleme sistemik taşıma ve diyet lipid hücre içi birikiminin görselleştirme izin verir. 8 hr-yalın yöntem ve dik bir amaç ile görüntülenmiş lamel (Şekil monte için floresan sinyal 6.4 uM floresan C 16 analog larva beslenen% 5 yumurta sarısı sindirim organlarının (bağırsak, karaciğer, pankreas ve) boyunca mevcut 2) 3.
Şekil 2:. 6 DPF larva Floresan Lipid Analogları görselleştirme Diyet Lipit Ulaşım Temsilcisi kompozit görüntü (sağa dönük kafa) 8 saat C 16 6.4 uM BODIPY FL ile EM% 5 yumurta sarısı ile beslenen. Larvalar yalın-yöntem lamel ile% 3 metil selüloz monte ve dik 63x ile görüntülendi argon lazer ile tek bir foton konfokal mikroskop yağ daldırma objektif. Ölçek çubukları 20 uM temsil etmektedir. Karaciğer, L; bağırsak, I; pankreas, P, safra kesesi, GB; Dev Bio 3 izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bunların farklı kompleks lipidler (örneğin, trigliseridler, kolesterol esterleri, fosfolipidler) metabolize çünkü çeşitli lipid analoglan hücresel yapıların benzersiz kümesinin görselleştirme sağlar. Aşağıdaki 4-8 saat, beslemeleri floresan C 16 ve C 12 analogları lipid damlacıkları, floresan FL C 5 etiket lipid damlacıkları, karaciğer ve pankreas kanallarının, hücre zarının ve arteriyel ağları ve floresan C 2 analog hepatik ve pankreatik kanalları ve hücresel etiketleri etiket membranlar (Şekil 3) 3.
ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 ">
Şekil 3:. Farklı Floresan bir lipid analoglan Etiket benzersiz Hücresel Organlar larvaların Örnek kompozit görüntüler 4-8 saat (6 dpf) için C, 16 ° C, 12 ° C 5 veya C2-6,4 uM BODIPY FL ile EM içinde% 5 yumurta sarısı beslenen . C16 analog enterositler lipid damlacıkları (LD) gözlenmiştir, bağırsak lümeninde enterosit LD ve bağırsak lümeninde ve C2 analog C12 ve 5 analoglan. Larva yalın-yöntem lamel% 3 metil selüloz monte edilir ve bir argon lazer ile tek foton konfokal mikroskop dik 63X yağa batırılmış objektif ile görüntülendi. Ölçek çubukları 20 mikron temsil etmektedir. İlaç Discov Bugün Dis Modelleri 22 izniyle."_blank> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
larva gıda alımı tahlil nasıl genetik mutasyonlar, transgenik gen aşırı ekspresyonu araştırmak için geliştirilen ve / veya eksojen tedavi larva gıda alımını etkiler. Larva tüketilen gıda miktarını belirtmek için bir floresan lipid analog ile çivili bir lipit bakımından zengin bir yemek beslenir. Beslenmemiş larvaları Floresan bir lipid analoğu tespit edilebildiği de duyarlılığı artırmak, larvaları, bu eşiğe miktarının normale paralel olarak toplanır. Bu deney, Apolipoprotein A-IVb.1 (apoA-IVb.1) gıda alımını azaltır ve aşın göstermek için kullanılmıştır. Daha önce beslenmemiş Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) larva 7 dpf'e 4 saat 6.4 uM floresan C 16 analog% 10 yumurta sarısı ile beslenen (Şekil 4) 20 vahşi tip larva yaklaşık% 30 daha az lipidler tüketti.
Şekil 4:. Örnek gıda alımını Deneyi, vahşi tipteki (WT) ve TG (HSP70: apoA-IVb.1: MCherry) (Tg) larvaları ile beslenen% 10 tavuk yumurtası sarısı 4 saat (Fed) ya da 6.4 uM BODIPY FL C16 ile EM (beslenmemiş) paralel olarak işlemden geçirildi. (A) Larvalar (n = 10) bir araya getirilmiş, lipitler ekstre edildi ve ekstraklar, bir TLC plakası üzerinde tespit edildi. (B) Toplam floresan ölçüldü, çıkarma ile beslenmemiş kardeşlerinde eşiğe normalize keyfi floresan birimlerinin (AFU), ifade ve WT göre ifade edilmiştir. WT ile karşılaştırılarak gösterildiği gibi ApoA-IVb.1 az floresan etiketli lipid analoglan yemek aşırı ifade Tg larvaları (Student t-testi, p <0.001 eşleştirilmiş n = 9, deney başına 20 larva). Kutu 25-75 inci yüzdelik temsil eder ve medyan gösterilir. Bıyık 10-90 inci yüzdelik göstermektedir. yayımlanmaktadırDis Modeli Mech 20 izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan teknikler araştırmacılar, bir lipit bakımından zengin yem ile larva Zebra balığı tedavi canlı larva diyet lipit işleme görselleştirmek ve larva besin alımını ölçmek için izin verir. başarı sağlamak için, özel dikkat birkaç kritik adımlar verilmelidir. Ticari tavuk yumurtası değişir; Potansiyel değişkenliği en aza indirmek için biz omega-3 yağ asitleri için zenginleştirilmiş değil kafes ücretsiz tavuk organik yumurta tüm testleri gerçekleştirmek. Düşük besleme oranları daha genç 6 gıda alımını (yani, çene ya da bağırsak malformasyon, düzgün yüzmek için yetersizlik) engelleyen gelişimsel mutasyonlar ile endojen sarısı enerji kaynaklarını, sağlıksız balık veya balık kalan dpf'e balık görülebilir. endojen sarısı mağazaları bitkin ve sarısı tükenmesi sindirim sisteminin daha iyi görselleştirme sağlar kadar larvaları eksojen gıda gerekmez çünkü Farber laboratuvar genellikle 6-7 gün sonra döllenme (dpf) de beslenme çalışmaları gerçekleştirir. beslemeOda sıcaklığında, aynı zamanda önemli ölçüde yemek larvaların sayısını azaltır. gıda alımı ve sonuçları yanıltabilecek sonraki deneylerde beslenmemiş larvaların kasıtsız dahil edilmesi için ekran larva Başarısızlık. Buna ek olarak, maksimum floresans ve böylece deney hassasiyetini korumak mümkün ışıktan Floresan bir lipid analoglan ve analoglan ile beslenen bütün larva örnekleri korumak için önemlidir. besin alımı ölçüleceği Son olarak, yemek atılır başlayacak beri yem ve kovalamaca (post-besleme metabolizma dönemi), 4 saat olmak üzere toplam aşmak için izin vermez. Şu anda, yemek ve ilgili floresan lipit analogları atılır hangi oran bilinmemektedir, ancak floresan en az 2 gün sonrası yem (JPO ve SAF yayınlanmamış veri) için larva vücuda devam edebilir.
değiştirmek ve ilgi deneysel soruları cevaplamak için protokolleri gidermek için çeşitli yollar vardır. lipid bakımından zengin besleme t çeşitli süreler için gerçekleştirilebilirime: 4 saat lipid büyük miktarda bağırsak dolduracak ise 1 saat, küçük bir yemek sağlayacaktır. Ancak, uzun 6 saat daha larvaları besleme sarısı olarak tavsiye edilmez ve EM sonuçlarını yanıltabilecek steril koşullarda ve yumurta sarısı / beyaz emülsiyon içinde bakteriyel aşırı çoğalma (yani, artan inflamasyon, değişmiş bağırsak Mikrobiyota profili) hazır değildir. Larva hızla yeniden ısıtmadan sonra yeniden beslenen başlar kısa soğutma veya anestezi ile hareketsiz yem Larva akut etkilerini araştırmak için beslendikten sonra hemen muayene edilebilir, ancak soğutma anestezi üzerine emesis sergileyebilir larva olarak immobilizasyon tercih edilen yöntem (SAF yayınlanmamış gözlem) 'dir. Alternatif olarak, takip süreleri çalışmadan önceki beslenme lipidlerin taşıma ve metabolizması için izin vermek için besleme sonra gerçekleştirilebilir. Beslemeler genellikle 5 mi lipozom çözeltisi içinde gerçekleştirilmektedir, ancak besleme başarıyla 1 ila 20 ml arasında değişen hacimlerde gerçekleştirilmiştir. çeşitli konsantrasyonlardaYumurta sarısı s larva beslemeler için kullanılabilir; Farber laboratuvar rutin% 5 yumurta sarısı (1 ml yumurta sarısı 19 ml EM eklenen),% 0.5 yumurta sarısı, ve% 10 yumurta sarısı ile deneyler yapar.
dikkate alınması gereken floresan lipid analoglarının potansiyel sınırlamalar vardır. Bir floresan lipit analog seçerken sonuçları yorumlarken floresan kısmı lipid kimyasal yapısına nasıl lipit fizyolojik işlenir ve nerede dikkate almak önemlidir. Örneğin, trigliseridleri, emilmeden önce bağırsak lümeninde, serbest kolesterol ve yağ asitleri serbest yağ asitleri ve gliserol, ve kolesterol esterleri ayrılır. floresan trigliserid veya kolesterol ester analogu diyet verilmiştir, bu nedenle vücutta floresans floresan kısım, orijinal trigliserid veya kolesterol ester bağlı olduğu yağ asidi, serbest kolesterol, ve gliserol izler. farklı flüoresant lipit analogları benzersiz hücresel yapılar etiket ve bu gerçeği seçiminde 3 sırasında dikkate alınmalıdır. Ayrıca Not, yerli yağ asitlerinin metabolizması ile karşılaştırıldığında, bir BODIPY kısmının eklenmesi yağ asidi zincir uzunluğuna (SAF yayınlanmamış veri) için ~ 2-3 karbon eklemeye eşdeğerdir.
Burada açıklanan teknikler alanında açıklanan önceki deneyleri üzerinde önemli gelişmeler göstermektedir. Larvalar desteklenmektedir beslenen edildiği bu tavuk yumurta sarısı yem gelişimine önce, iki el yazması detaylı çalışmalar haşlanmış yumurta 4,23 sarısı. Burada anlatılan teknik, yumurta sarısı nedeniyle hızlı bir oksidasyonuna sabit bu toz yumurta sarısı, çok kısa bir yarı-ömrü vardır kaynatılmış ve kullanımdan önce tozu olması gerekmez avantajını sunar. Sıvı yumurta sarısı, aynı zamanda hali hazırda etkili bir diyet teslimat için Floresan bir lipid analoglan kabul lipozomlar gibi hazırlanabilir. Seçenek olarak ise, radyo-etiketli lipitlerin inves için kullanılabilirdiyet lipid metabolizmasını araştırılmazsa ve gıda alımını ölçmek, ancak floresan lipit analogları radyoaktivite ile ilişkili güvenlik tehlikelerini sunmazlar. Araştırmacılar radyoaktif işaretli lipidlerin kullanmak isteyen, ancak eğer Farber laboratuar radyoetiketli lipidler dahil edilebilir olduğunu doğrulamak için çalışmalar yapıldı ve başarıyla beslenen, 19 lipozomlar etti. Burada açıklanan floresan lipit analogları onlar endojen ve radyoaktif işaretli lipidler çok benzer metabolizmasını gösterir çünkü seçilen ve alçak ve yüksek güç görüntüleme için yeterince parlak idi.
Larvalarına karşı Floresan bir lipid analoglan beslemek için bu tekniğin geliştirilmesi da öncelikle, herhangi bir diğer yöntemler, in vivo olarak, diyet yağ taşıma ve birikimini görselleştirmek için kullanılabilir. Floresan lipit analoglarının doğrudan görselleştirme serum lipit gibi fizyoloji dolaylı önlemler kullanarak üzerinde bir avantaj sağlayabilir. Larva zebra balığı gıda alımının doğru ölçülmesi ayrıca uzun STA oldualanına meydan nding. Larvalar beslemek için izin N -methylpyridinium iyodür (4-Di-10-ASP), ve floresan ölçmek - tek alternatif floresan lipofilik izleyicinin 4- (4- (didecylamino) stiril) ile etiketlemek, kültür paramecia'nın oldu bir plaka okuyucu 24 ile karın içi alan. Son olarak, bu teknikler hem orta verimli ekranlar (diyet lipit işleme, yani ileri genetik ekranlar) yanı sıra odaklanmış yüksek büyütme görüntüleme çalışmaları için geçerli olma avantajına sahip (yani, genetik, hipotez odaklı çalışmaları ters). Gelecekte, bu teknikler fenotipe uygulanabilir ve zebrabalıkları Metabolik ve GI bozuklukları çeşitli modeller ekran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M.
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
