Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

hyperpolariseret Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/54751
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1,2, 1, 3,4, 1,5,6, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Nuclear Medicine, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Chemistry, Technische Universität München, 3GE Global Research, 4Zentralinstitut für Medizintechnik der Technischen Universität München (IMETUM), Technische Universität München, 5Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, 6IDG Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München
* These authors contributed equally

Abstract

I de seneste årtier har nye metoder til tumor iscenesættelse, genopsætning, behandlingsrespons overvågning og gentagelse påvisning af en række forskellige kræftformer opstod i forbindelse med positronemissionstomografi state-of-the-art med 18 F-fluorodeoxyglukose ([18 F ] -FDG PET). 13C magnetisk resonans spektroskopisk imaging (13 CMRSI) er en minimalt invasiv billeddannelse metode, som tillader overvågning af metabolisme in vivo og i realtid. Som med enhver anden metode baseret på 13C kernemagnetisk resonans (NMR), det står over for den udfordring at lave termiske polarisering og et efterfølgende lavt signal-støj-forhold på grund af den relativt lave gyromagnetiske forhold på 13 C og dets lave naturlige forekomst i biologiske prøver. Ved at overvinde disse begrænsninger har dynamisk nukleare polarisering (DNP) med opløsning efterfølgende prøve nylig aktiveret almindeligt anvendte NMR og magnetisk resonans imaging (MRI) systemer til at måle, Undersøgelse, og image vigtige metaboliske veje i forskellige biologiske systemer. Et særligt interessante og lovende molekyle anvendt i 13 CMRSI er [1- 13C] pyruvat, som i de sidste ti år, har været meget anvendt til in vitro, præklinisk, og på det seneste, kliniske undersøgelser for at undersøge den cellulære energimetabolisme ved cancer og andre sygdomme. I denne artikel, vi skitsere teknik opløsning DNP brug af en 3,35 T præklinisk DNP hyperpolarisator og demonstrere dens anvendelse i in vitro-studier. En lignende protokol for hyperpolarisering kan anvendes for det meste i in vivo studier så godt. For at gøre dette har vi brugt lactatdehydrogenase (LDH) og katalyserede den metaboliske omsætning af [1- 13C] pyruvat til [1- 13C] lactat i en prostata carcinom-cellelinje, PC3, in vitro under anvendelse 13 CMRSI.

Introduction

I øjeblikket er den mest udbredte kliniske fremgangsmåde til tumor staging, genopsætning, behandlingsrespons overvågning, og fornyet påvisning af en lang række forskellige cancere er [18F] -FDG PET. 1 Men for nylig, flere nye og alternative tilgange er dukket op. En af disse metoder er 13 CMRSI. Denne teknik indebærer indførelsen af 13C-molekylet til en biologisk prøve, efterfulgt af minimalt invasiv MRI at vurdere metabolisme in vitro eller in vivo i realtid. Alligevel den største udfordring af 13. CMRSI, sammenlignet med de andre metoder, såsom [18F] -FDG PET eller computertomografi, er dens lave signal-til-støj-forhold.

NMR-signal er direkte proportional med niveauet af polarisation, et forhold af spin ½ kerner population forskel i to energitilstande til den samlede befolkning (figur 1A). Den polarisering er et produkt af the gyromagnetiske forhold (γ) af kernerne og den anvendte magnetiske feltstyrke over temperaturområdet. En typisk polarisering på 1 time kerner er i størrelsesordenen 0,001% til 0,005% ved 3 T, hvilket giver et relativt dårligt signal-støj-forhold. Dagens state-of-the-art MRI har været en vellykket billeddannelse metode kun på grund af den høje forekomst af 1H i biologiske prøver og den høje gyromagnetiske forhold af 1 H (y 1H = 42,576 MHz / T). Men observere andre kerner, såsom kul, er mere krævende. Det eneste stabile, magnetisk aktivt kul isotop, 13C, kun udgør 1,1% af alle kulstofatomer. Derudover gyromagnetiske forhold på 13C (γ 13C = 10,705 MHz / T) er fire gange lavere end for 1H, hvilket fører til en lavere afsløring effektivitet. Sammenfattende lav 13C overflod og lav γ 13C forårsage termiske målinger 13 C til opnåelse af 0,0176% af følsomheden af en 1H-NMR-måling in vivo.

Dynamisk Nuklear Polarisering

Fremgangsmåde til at overvinde den relativt ringe følsomhed på 13 C-målinger er DNP. Det blev oprindeligt beskrevet for metaller i 1953 af Albert W. Overhauser. I sin artikel, udtalte han: "Det er vist, at hvis den elektron spin resonans af ledningsforstyrrelser elektroner er mættet, vil kernerne blive polariseret i samme grad de ville være, hvis deres gyromagnetiske forhold var, at elektronens spin." 2 Senere det år, Carver og Slichter eksperimentelt bekræftet Overhauser hypotese 3. I 1958 Abragam og Proctor beskrevet denne effekt for elektroner i væsker og kaldte det den "solid effekt." Ved temperaturer under 4 K, elektron-spin-polarisering når næsten 100% og er mere end tre størrelsesordener højere end den nukleare-spin-polarisation (figur 1B) 4. Thans opstår, fordi gyromagnetiske forholdet mellem elektron (γ e = 28024,944 MHz / T) er tre størrelsesordener højere end de nukleare gyromagnetiske nøgletal. De svage interaktioner mellem elektroner og kerner, såsom Overhauser effekt, den faste retning indlæg virkning, og den termiske blanding virkning, tillade overførsel af polarisering fra elektron spins at kernespin ved hjælp mikrobølgebestråling med en frekvens tæt på den tilsvarende elektron paramagnetiske resonans (EPR) frekvens 5,6. DNP teori er blevet videreudviklet til at involvere flere elektroner og termisk blanding. Alligevel til dato ingen samlet kvantitativ teoretisk beskrivelse af DNP er offentliggjort 7,8.

figur 1
Figur 1: Forståelse Dynamic Nuclear Polarisation og hyperpolarisering. A) En skematisk sammenligning af spin befolkningi termisk ligevægt polarisering staten og den hyperpolariserede tilstand. B) Polariseringen er afhængig af temperatur. Polariseringen af en elektron (e -) når 100% under 1,4 K. DNP muliggør overførsel af polarisationen fra e til de 13 C-kerner, hvilket øger deres polarisation op til 10 5 fold. Klik her for at se en større version af dette tal.

At indføre DNP i studier af biologiske systemer, der anvender 13C NMR, efterfølgende opløsning hurtig prøve havde skal udvikles. 50 år efter Overhauser hypotese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. løst teknisk udfordrende spørgsmål om at bringe den hyperpolariserede frosne prøve i flydende tilstand med minimal hyperpolarisering tab 6. Opløsning DNP åbnede en ny forskningsområde kaldet 13 CMRSI, hvilket giver en ny metode til at undersøge og karakterisere forskellige sygdomstilstande 9,10. Som stabile bærere af en uparret elektron, en tritylgruppe radikal tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-yl) methyl-natriumsalt (OX063) eller (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl) oxy (TEMPO) anvendes sædvanligvis. Disse blandes med den ønskede 13C-mærkede molekyle og eksponeret for mikrobølgebestråling med en frekvens tæt på den tilsvarende EPR frekvens. Ved hjælp af denne teknik, kan polariseringen af 13 C kerner øges op til 37% 11. Dette resulterer i en 10 5 fold polarisering forbedring i forhold til den termiske ligevægt polarisering 11,12. Men så snart mikrobølgebestråling standses og / eller 13C-molekyle overføres til flydende tilstand, polarisationen henfalder med den langsgående relaksationstid (T1) af 13C kerne, blev polariseret. Såledesopfindelse af hurtige opløsningstider teknikker eller en senere teknik forkorte tiden før eksperimentel måling (dvs. injektion) er afgørende for biologiske anvendelser 13.

Der er tre store krav, at kandidaten molekylet har brug for at opfylde for en vellykket 13 CMRSI undersøgelser. Første, 13C kerne af interesse skal have en tilstrækkelig lang T1 (> 10 s). Valget af 13C-mærket er afgørende. Den bedste kandidat kerner er carbonatomer uden direkte kontakt med 1H-kerner via en binding. Det skal også metaboliseres hurtigt inden 2 - 3 i T 1 gange, hvilket resulterer i en nedstrøms metabolisk produkt med en signifikant forskellig kemisk skift fra det oprindelige stof. Blandingen Prøven skal også udgøre et amorft glas, når i en fast tilstand, således at den rumlige fordeling formindsker afstanden mellem elektronen og 13C, således at transfer af polarisering. Hvis kandidatmolekylet ikke danner amorfe glas naturligt, det skal være letopløseligt i en glassing middel, såsom glycerol eller dimethylsulfoxid 14. Disse krav medfører et relativt lille antal kandidatmolekyler. Men selv efter en vellykket opdagelsen af en egnet molekyle, udvikle en arbejdsgruppe protokol for hyperpolarisering kan være teknisk udfordrende 9,14,15.

I de seneste år har adskillige substrater været succesfuldt polariseret, såsom [1- 13C] pyruvat 12,16 - 36, [2- 13C] pyruvat 37, [1- 13C] ethylpyruvat 38, [1- 13C ] lactat 39, [1- 13C] fumarat 40 - 43 13C-bicarbonat 36,44,45, [1- 13C] natriumacetat 43,46 - 49, 13C-urea 6,36,50,51 , [5- 13C] glutamine 15,52,53, [1- 13C] glutamat 53,54, [1- 13 C] 2-oxoglutarat 55, [1- 13C] alanin og andre 14,56. En særlig interessant og almindeligt anvendte substrat til hyperpolarisering er [1- 13C] pyruvat. Det er almindeligt anvendt i prækliniske studier for at undersøge den cellulære energi-metabolisme i forskellige sygdomme 14,17,22. [1- 13 C] pyruvat opfylder alle krav til en vellykket hyperpolarisering, herunder en forholdsvis lang T 1 og hurtig transport over cellemembranen før senere at blive metaboliseret. Prækliniske studier med [1- 13 C] pyruvat øjeblikket oversat til klinikken 57.

Metabolisme af pyruvat

Det er velkendt, at der er en direkte sammenhæng mellem mutationer i et kræftceller 'DNA og ændringer i deres metaboliske veje. Allerede i 1920'erne, Otto Warburg Discovob- at der er en øget metabolisme af glucose og produktion af lactat i tumorer sammenlignet med raske væv 58 - 60 år. Efterfølgende forskellige vekslen i andre metaboliske veje, såsom pentose-phosphat pathway, tricarboxylsyrecyklen, oxidativ phosphorylering, og syntesen af ​​nukleotider og lipider, er blevet beskrevet.

Pyruvat er slutproduktet af glycolyse. I tumoren, det undergår anaerob glycolyse katalyseret af LDH 61 og reagerer med den reducerede form af coenzym nikotinamidadenindinukleotid (NADH), hvilket resulterer i lactat og den oxiderede form af coenzym (NAD +). Alternativt pyruvat undergår en transamineringsreaktion med glutamat til dannelse alanin, katalyseret af alanin transaminase (ALT). Begge reaktioner er let reversible. Pyruvat undergår også decarboxylering katalyseret af pyruvatdehydrogenase (PDH) til carbondioxid og acetyl-CoA, representing en irreversibel reaktion på dette trin. Vekslen i disse reaktionshastigheder kan knyttes til tumor stofskifte 17,21,22,25,62. De metaboliske veje er opsummeret i figur 2.

Figur 2
Figur 2: Diagram over væsentligste metaboliske reaktion af pyruvat. Pyruvat / lactat omdannelse katalyseres af LDH, og pyruvat / alanin omdannelse katalyseres af ALT. Pyruvat omdannes irreversibelt til acetyl-CoA og CO 2 ved PDH, og CO 2 er i et pH-afhængig ligevægt med bicarbonat 80. Klik her for at se en større version af dette tal.

Påvisningen af hyperpolariseret [1- 13C] pyruvat og dets metabolitter er tidligere blevet påvist i rotter hanart 37,63 - 65, lever 66, muskel, og nyre 62,67. En undersøgelse viste betydelige forskelle i lactat-til-alanin-forhold mellem den normale og fastede rottelever 66 og demonstrerede en stærkt forhøjet og hyperpolariserede [1- 13C] lactat niveau i leverkræft 68,69. Der er beviser for, at tumoren klasse kan identificeres i en transgen adenocarcinom af mus prostata (TRAMP) ved hjælp af hyperpolariseret [1- 13 C] pyruvat 22, med de hyperpolariserede laktatniveauer viser en høj korrelation med den histologiske kvalitet af de udskårne tumorer. Den alanin katalyseret fra pyruvat ved ALT er også blevet foreslået som en nyttig markør i rotte hepatocellulært carcinom 23.

Måling af pyruvat-lactat metabolisk flux har været anvendt til overvågning iskæmi 63,65,70 og som en reaktion på behandling med cytotoksisk kemoterapi 17,40, målrettede lægemidler <sup> 24,25,41, eller radioterapi 26 i dyremodeller. Det er også blevet anvendt til påvisning af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 respons i glioblastom og brystcancer musemodeller 25. Ændringer i pyruvat-metabolisme i hjernetumorer 26 og prostatacancer 24,71 er også blevet observeret efter behandling.

prostatacarcinom

Prostata karcinom er den dominerende kræft hos ældre mænd og den næsthyppigste kræft relateret til døden hos mænd verden over 72. Til dato, ingen pålidelige, ikke-invasive metoder er tilgængelige for en tidlig diagnose og karakterisering af prostatakræft 73,74, understreger det presserende behov for nye metaboliske billeddannende teknikker til at muliggøre stringent påvisning og iscenesættelse af patienterne. Prostatacarcinom blev anvendt som en model til at demonstrere mulighederne for opløsning DNP kombineret med 13 CMRSI i patients 57. Dette arbejde blev fortsat i en første kliniske forsøg, der anvender [1- 13C] pyruvat og 13 CMRSI til billeddannelse af prostatacancer, og det er netop er afsluttet (NCT01229618).

Motivationen bag dette arbejde var at illustrere mere detaljeret og for et bredere publikum anvendelsen af den 13 CMRSI metoden i et præklinisk indstilling med celler. Måling af LDH-katalyseret metabolisme af [1- 13 C] pyruvat til [1- 13 C] laktat in vitro i PC3 prostata karcinom cellelinje, viser vi den mulige anvendelse af opløsning DNP i in vitro-undersøgelser og tage fat på de afgørende skridt og udfordringer under eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøve Stock Solution Forberedelse

  1. Tilføj gadoterate meglumin (GadM, 0,5 mol / l) til koncentreret [1- 13C] pyrodruesyre at give en endelig koncentration på 1-mmol / L GadM. Tilføj trityl radikal tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-yl) - methyl-natriumsalt (OX063) til denne blanding til opnåelse af en slutkoncentration på 15 mmol / l. Vortex indtil fuldstændig opløsning.
    BEMÆRK: Denne stamopløsning forberedelse er designet til brug med en 3,35-T præklinisk DNP hyperpolariseringsapparat. Når der anvendes en 7-T klinisk hyperpolarisator er gadoterate meglumin ikke påkrævet, fordi, på et højere magnetisk felt, dens fordele er ubetydelige. Tilsætningen af ​​et gadolinium-baserede kontraststof forøger den opnåelige solid-state polarisering og også den polarisering sats. Men i flydende tilstand, kontrastmidlet forkorter T 1 relaksationstiden.

2. Dyrkning af Cell Culture

    2 vækstområde. Brug F-12K-medium indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og opretholde cellerne ved 37 ° C i en fugtig atmosfære ved 5% CO2. Før opløsningen trin, fjernes mediet fra kulturen kolben.
    BEMÆRK: Hver celle linje kræver en særlig forberedelse protokol for celle formering. Rådfør kravene med cellelinje udbyder.

3. Forberedelse af cellerne for Experiment

  1. Fjern cellemediet og vask cellerne med ~ 10 ml phosphatpufret saltvand (PBS).
  2. Der tilsættes 5 ml trypsin til kolben og returnere de celledyrkningskolber til inkubatoren i 3 til 5 min.
  3. Tilføj ~ 5 ml F-12K-medium for at deaktivere trypsin.
  4. Tæl cellerne under anvendelse af en automatisk celletæller. Bland 10 pi af cellen opløsning med 10 pi af pletten opløsning. Bland godt med pipette og overføres 10 pi af blandingen i the kammer i et "tælle glas".
  5. Fjern og tælle cellerne i kolben (s). Overfør passende mængder indeholdende det ønskede antal celler (f.eks, 5 x 10 6 til 10 8) i plastflasker.
  6. Centrifuger cellerne ved 1200 xg i 5 min og kassér supernatanten.
  7. Resuspender cellerne i F-12K-medium indeholdende 10% FCS til et samlet volumen på 800 pi og overføre dem til en reaktion kop (2 ml). Anbring reaktionskop i en plastik hætteglas fyldt med varmt vand.

4. Opløsning Agent Forberedelse

BEMÆRK: Opløsningen middel er en væske, der anvendes til at opløse den hyperpolariserede prøve. I biologiske anvendelser, er opløsningen normalt udføres med H2O-baserede eller deuteriumoxid (D2O) -baserede buffere, såsom PBS eller tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), der indeholder 1 g / l ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).

  1. preparation på 20 mmol / L PBS-buffer
    1. Til fremstilling af 100 ml af opløsning middel, opløses 36 mg mononatriumphosphat (NaH 2 PO4), 247 mg af dinatriumphosphat (Na 2 HPO 4), og 10 mg EDTA i en opløsning af 20 mmol / l natriumhydroxid ( NaOH) i D 2 O. Bland korrekt, indtil fuldstændig opløsning.
      BEMÆRK: EDTA (1 g / l) sættes til bufferen for at udelukke eventuelle ferromagnetiske ioner, som kan ødelægge hyperpolarisering. NaOH anvendes til at neutralisere pyrodruesyre i en 1: 1 molforhold for at nå en pH på 7,4.

5. Variable Temperature Insert (VTI) Cooldown

  1. I DNP-NMR polarisator program hovedvinduet, klik på "Cooldown."
    BEMÆRK: Dette tænder vakuumpumpen og evakuerer VTI til ca. 5,0 mbar. Efterfølgende nåleventilen mellem VTI og det flydende helium reservoiret åbnes fuldt, så flydende helium at strømme ind i VTI. Flowet er regulated af nåleventilen at opretholde den optimale mængde flydende helium i VTI indtil den når helium Kogepunktet. Derefter VTI evakueret til næsten fuldstændig vakuum, og temperaturen når ca. 1,4 K. VTI er fyldt med flydende helium op til 65%. På dette tidspunkt instrumentet er klar til prøven indsættelse.

6. Prøveforberedelse og Insertion

  1. Med en mikropipette tilføje ~ 8 pi 13C-mærkede prøve stamopløsning i et plastbæger.
  2. Fastgør plastik kop til indsættelse stang og indlede prøven indsættelse processen ved at trykke på "Indsæt prøve" i programmets hovedvindue. Vælg "Normal prøve" og klikke på "Fortsæt".
    BEMÆRK: Under denne proces nåleventilen første lukker for at afbryde strømmen af ​​flydende helium i VTI, og trykket i VTI stiger derefter. prøveholderen inde i VTI hæves fra den flydende helium, indløbsventilenpå toppen af ​​VTI åbner, og en gasformig helium flow indføres fra indløbsventilen og være beskyttet mod forurening med fly fugt.
  3. Når du bliver bedt, skubbe indsættelse stang med vedlagte plastik kop ned i VTI. Sørg for at nå prøveholderen i bunden af ​​VTI. Ellers kan den gasformige helium skubbe prøven ud af VTI.
  4. Frigør og fjern indsættelse stang.
  5. Afslut proceduren ved at klikke på "Næste" i dialogvinduet. Proceduren Prøven indsættelse bør ikke tage mere end 10 s.
    BEMÆRK: Indløbsventilen lukker derefter, den gasformige helium flow afbrydes, prøveholder med prøven cup den er nedsænket i flydende helium, og nålen ventilen åbnes for at tillade flydende helium at strømme ind i VTI. Efter 5 - 10 minutter, er VTI afkøles til under 1,4 K, hvilket tillader alle de frie elektroner, der skal polariseres.
  6. Bekræft, at plastik kop med prøven blev indført korrekt i VTI ved at kontrollere that det ikke er fastgjort til indsætningsstaven eller skubbes ud fra VTI med helium gas. Klik derefter på "Finish".

7. Mikroovn Sweep (valgfrit)

BEMÆRK: En mikrobølgeovn sweep muliggør bestemmelse af den optimale mikrobølgefrekvens at maksimere hyperpolarisering hastigheden af de 13 C kerner i målforbindelsen.

  1. For at måle mikrobølge sweep, starte RINMR programmet, skriv "HYPERSENSENMR," og klik "Select Config" og "Do Microsweep."
  2. For at starte processen, skal du vælge fanen "kalibrere" på programmets hovedvindue.
  3. Klik på "Generer" og vælg begyndelsen og slutter frekvens (f.eks 94,100 GHz-94,200 GHz), frekvensen skridt størrelse (f.eks 20 MHz), magt (100 mW), og tiden (60 s). Klik på "Fortsæt", "Aktiver" og "Start".
    BEMÆRK: Med disse indstillinger, hyperpolariseringsapparatet først polariserer prøveni 60 s ved hjælp af en mikrobølgeovn frekvens på 94.100 GHz og en effekt på 100 mW. Så gælder det en 90 ° radio-frekvens (RF) puls og erhverver hyperpolariserede 13C signal ved hjælp af den indbyggede spektrometer. Disse trin gentages for hvert trin i den angivne frekvensområde. Til efterfølgende hyperpolarisering vælge mikrobølgeovnen frekvens med den maksimale signal amplitude målt.

8. Polarisering

  1. For at måle polarisering opbygning, start RINMR programmet, skriv "HYPERSENSENMR," og klik "Select Config" og "Fast Build-up."
  2. I DNP-NMR polarisator program hovedvinduet, klik på "polarisering" at indlede hyperpolarisering processen.
  3. Vælg den optimale mikrobølge frekvens (opnået under mikrobølge feje) og effekt (fx 100 mW) til prøven og klik på "Næste".
  4. Aktiver "Polarisering opbygning overvågning" og klik på "Finish".
  5. Polarisere prøven til> 95% (~ 60 min for [1- 13C] pyruvat).
    BEMÆRK: Under polariseringen, er mikrobølger ledes ind i VTI og til prøven, hvilket får 13C spins at flugte med de hyperpolariserede uparrede elektron spin. For at måle hyperpolarisering buildup, er RF pulser med en flip vinkel (FA) på 5 ° anvendes periodisk (f.eks hver 300 s), og det resulterende signal er plottet som en polarisering opbygning kurve.

9. Opløsning

  1. Når polariseringen når> 95%, initiere opløsning ved at klikke på "Opløsning" i DNP-NMR polarisator program hovedvinduet.
  2. Vælg opløsningsprocessen fra drop-down menuen og klik på "Næste".
    BEMÆRK: polarisator gør det muligt at definere den ønskede opløsningsprocessen ved at vælge timingen af ​​jagter gas.
  3. Indlæs ~ 5 ml af opløsningen middel gennem den øverste ventil i en opvarmet beholder i than opløs del af polarisatoren. Beregn det nøjagtige volumen af ​​opløsningen middel behov ved hjælp følgende ligning:
    ligning 1
    hvor V DA er den ønskede mængde af opløsning agent, m PA, m OX063, og m Gad er masserne af pyruvat, OX063 og gadoterate meglumin henholdsvis sat til prøven stamopløsning.
  4. Placer opløsningen pind i den aktive position over indløbsventilen.
    BEMÆRK: Dette gør det muligt for instrumentet at forbinde dens opløsning instrumentering til prøven kop i VTI.
  5. Klik på "Afslut" for at starte opløsningsprocessen.
    BEMÆRK: opløsning middel under tryk til 3 bar med helium gas og opvarmes derefter til 200 ° C, hvilket bevirker en stigning i trykket. Når trykket når 10 bar, nåleventilen lukker for at afbryde strømmen af ​​flydende helium i VTI. prøveholderen hæver koppenfra den flydende helium. Opløsningen stick sænkes ned i VTI og forbundet til prøvekop. Det konditionerede opløsning middel er skubbet af det tryk, som resulterer fra varmesystemet beholder indeholdende opløsningen puffer og heliumgas gennem opløsningen stick til skålen, hvilket medfører en hurtig opløsning af prøven. Opløsningen strømmer så ud i indsamling kolben via plastrør. Opløsningen stick med vedlagte bæger derefter hævet fra VTI.
  6. Flyt opløsningen stick med vedlagte kop til "rengøring" position og afslutte processen ved at klikke på "Finish".

10. Påvisning af 13C hyperpolariseret Signal

  1. 13C metabolisk resonansspektroskopi in vitro
    1. Bland 200 pi af 20-mmol / l opløst hyperpolariserede prøve fra indsamling kolbe med 800 pi af cellen opløsning.
      BEMÆRK: Den resulterende endelig koncentrationaf [1- 13C] pyruvat er 4 mmol / l.
    2. Bland suspensionen brønd med en mikropipette og overførsel ~ 600 pi i en 5-mm NMR-rør.
    3. Sæt 5 mm NMR-rør ind i 1-T NMR-spektrometer. I hovedvinduet af softwaren, klik på "Kør" for at starte målingen, anvender serie af hundrede 10 ° RF pulser hver 3 s.
      BEMÆRK: Den tid mellem indledende blanding af den hyperpolariserede prøve med cellerne og starten af ​​erhvervelsen spektroskopiske. Sørg for, at blandingen procedure ikke overskrider 30 s for at minimere polarisering tab.
  2. 13C metabolisk magnetisk resonans imaging
    1. At bygge en beholder til in vitro-eksperimenter ved hjælp af MRI spektrometer, tage en 5 ml sprøjte og slutte den til et kateter (d = 1,2 mm), der er lang nok til at nå fra spektrometer er iso-centrum til tilgængelige område af spektrometer.
    2. Fyld in vitro beholder med the celle opløsning af den ønskede koncentration til forsøget (fx 10 8) eller med en enzymatisk opløsning.
    3. Placer en in vitro beholder ved isocentret af MRI magnet. Placer en 13C-retmodtager spole på beholderen. Placer en koncentreret 13 C-mærket kalibrering fantom (f.eks 10-mol / L 13 C-urea) i nærheden.
    4. Indsæt "in vitro beholder" nær iso-centrum af NMR scanneren.
    5. Kør scannerens standard 3-plane lokaliseringssekvens og justere in vitro beholderens position til iso-center, efter behov.
    6. Kør en 1H T2-vægtet "anatomisk" sekvens dækker in vitro container lokalisering. Brug følgende indstillinger: 2D spin-ekko med aksial orientering, gentagelse tid (TR) = 2.000 ms, ekkotid (TE) = 20 ms, skivetykkelse = 1 mm, synsfelt dækker in vitro containeren, og16 ekkoer pr excitation. Sørg for, at feltet afstandsstykker sker på protoner under dette trin.
    7. I de anatomiske billeder, skal du vælge 5 sammenhængende skiver centreret om området af interesse. Ordinere en 13C erhvervelse spektroskopiske kalibrering dækker de udvalgte anatomiske skiver. Brug følgende indstillinger: 2D Block-Siegert kalibreringssekvens med aksial orientering 12 x 12 centric kodet, TR = 1.000 ms, skivetykkelse = 5 mm, synsfelt matchende anatomiske billeder, antal scanninger (NS) = 64, båndbredde = 5000 Hz, og FA = 90 °.
    8. Vælg 13C spektroskopiske kalibreringssekvens (yderligere oplysninger, se Schulte et al. 2011) 75 fra puls sekvens biblioteket. Download puls sekvens til scanneren fra computeren ved at klikke på "Download". Klik på "Spectra Prescan" for at køre den spektroskopiske præscanning. I spektret størrelsesorden plot, justere top fra 13C kalibrering fantom til center af scanneren frekvens. Sæt receiveren gevinster til det maksimale. Klik på "Start" for at køre 13C spektroskopiske kalibreringssekvens. Bemærk den rapporterede sende gevinst og centreret frekvens.
    9. Indstil en 13C kemisk skift imaging (CSI) erhvervelse dækker de udvalgte anatomiske skiver. Brug følgende indstillinger: 2D ekko-plane spektroskopisk imaging (EPSI) med aksial orientering 12 x 12 centric kodet, TR = 400 ms, skivetykkelse = 5 mm, synsfelt matchende anatomiske billeder, NS = 300, og båndbredde = 5000 Hz .
      BEMÆRK: EPSI prøver en enkelt linje i k-rummet flere gange efter en RF excitation at erhverve både rumlig og spektral information på samme tid. For mere information om erhvervelse teknikker, se artiklen af Durst et al. 2015 76.
    10. Download 13C CSI sekvens og køre spektroskopiske prescan. Juster scanner frekvens og overføre gevinsten som angivet af kalibreringen sekvensproduktion.
    11. Efter den hyperpolariserede opløsning aflejres i samlingen kolbe, udarbejder ~ 3 mL i en sprøjte og derefter injicere den ind i kateteret forbundet til in vitro beholderen. Start købet. Efter købet er færdig, skal du gemme den rå datafil til efterfølgende genopbygning.

11. data Genopbygning

  1. Påfør en af ​​de to beskrevne kinetiske modeller til at analysere de indsamlede data.
    1. I den første metode til at beskrive LDH kinetik, kinetisk værdi (k), sammenligne summen af lactat signal (M LAC) til signalet for alle hyperpolariserede molekyler (M x) 21,77.
      ligning 2
    2. I anden metode, måle laktat og pyruvat signaler over tid og passer disse til en kinetisk model 17,25,71. For at løse den metaboliske kurs, k PA → LAC, og den effektivesignal henfald på laktat, r LAC, bruge følgende lineære differentialligninger ved hjælp af to-site udveksling forskellen model, hvilket giver for lactat:

      ligning 3

Bemærk: Den effektive laktat signal henfald rate r LAC er afhængig af laktat langsgående afslapning tid (T 1, LAC), det modsatte metaboliske vekselkursen fra laktat til pyruvat k LAC → PA, den anvendte FA og TR, og signalet intensiteten af pyruvat (M PA) og laktat (M LAC), under hensyntagen til den irreversible signal reduktion efter hver efterfølgende excitation:

ligning 4

Derfor r LAC resulterer i en enkelt, uadskillelige løbetid signal forfald. Eftersom det er muligt at korrigere for than vende vinkel og gentagelse tid, og selv om der er en flux LAC → PA, antager vi, at kursen fra laktat til pyruvat (k LAC → PA) ikke behøver at indgå i beregningen, baseret på resultaterne af Harrison et al. 2012 78. Deres resultater viser, at k LAC → PA ikke spiller så afgørende en rolle som man kunne antage. Denne tilstand gør det muligt for T 1 afslapning tid af laktat skal kvantificeres. Denne model er uafhængig af pyruvat administration til målingen, som, i tilfælde af in vitro-forsøg, er ikke afgørende og kan ignoreres. Det betyder dog, spiller en vigtig rolle for in vivo målinger 79.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaterne af "mikrobølge sweep" er illustreret i figur 3. Det viser, at den optimale mikrobølgefrekvens for [1- 13C] pyruvat prøve er på 94,156 GHz for den lokale 3.35-T hyperpolarisator. Alle følgende hyperpolarisering eksperiment (n = 14) blev udført under anvendelse denne mikrobølgefrekvens med en effekt på 100 mW. Den mikrobølgebestråling blev påført i 60 til 80 min, hvilket fører til en solid-state hyperpolarisering højere end 90%. Resultaterne er vist i figur 4. Den hyperpolariserede [13C] pyruvat blev blandet med 5 x 10 6 (n = 2), 10 7 (n = 2), 2 x 10 7 (n = 1), 3 x 10 7 (n = 2), 4 × 10 7 (n = 1), 6 x 10 7 (n = 2), 8 × 10 7 (n = 2), 10 8 (n = 1) i prostatacancer-cellelinie PC3.

De resulterende data er sammenfattet i figur 5 figur 6. Erhvervede data med spektrale og tidsmæssig opløsning er vist i figur 5A-D og figur 6A-D, med kun en tidsmæssig opløsning for hvert molekyle observeret (figur 5E-H og figur 6E-H), og med kun en spektral opløsning (fig 5I -L og Figur 5I-L). Vi har observeret tre store hyperpolariserede signaler, der repræsenterer [1- 13C] pyruvat, [1- 13C] pyruvat-hydrat, og [1- 13C] lactat, med kemiske skift ved 173 ppm, 181 ppm og 185 ppm, omtrent relativ til trimethylsilyl propansyre (TMSP) ved pH 7,4 og temperatur 20 ° C. Signal- forhold mellem de tre nedbrydningsprodukter er opsummeret i tabel 1. Dataene viser en klar sammenhæng mellem lactat signal, og antallet af celler til stede i prøven (figur 7). Men resultaternefra eksperimenterne med mindre end 2 × 10 7 celler udviser signifikant afvigelse, sandsynligvis på grund af et lavt signal-til-støj-forhold. Derfor foreslår vi, at bruge flere celler end dette til yderligere forsøg. Når den relative lactat signal (kinetisk værdi) normaliseres med antallet af celler (figur 8), det klart viser lignende optagelse og metabolisme i hele alle cellerne. Der er imidlertid en tendens til faldende lactatproduktion per celle med et stigende antal celler. Vi mener, at en af ​​årsagerne til reduceret celle metabolisk aktivitet er en meget høj koncentration af celler i en meget lille volumen, hvilket resulterer i forøget viskositet af prøven. Resultaterne af to-site udveksling differential model er opsummeret i tabel 2 og vist i figur 9. Dataene følger en tendens svarende til den tidligere model: øget k PA → LAC med et stigende antal celler. Men denne model resulteres i en stejlere stigning af kinetikken med antallet af celler. Når den metaboliske kurs k PA → LAC er normaliseret til antallet af celler, kan vi igen se en klar tendens med faldende k PA → LAC med et stigende antal celler (figur 10).

Figur 11 viser muligheden for tilsætning af rumlig lokalisering til eksperimentet. Det viser en fantom injiceret med 80 mmol / l hyperpolariserede [1- 13C] pyruvat siden af en 10 mol / L 13 C-urinstof fantom. Teknikken gør det muligt at opnå et spektrum med tidsmæssig og særlig beslutning (figur 11A) eller af signalet forfald af de valgte metabolit signaler i tiden (figur 11B). Spektrene i tidsdomænet kan også summeres at modtage et bedre signal-til-støj-forhold (figur 11C). Den særlige opløsning tillader valget af den ønskede frekvens region of 13C-spektret tilhører visse metabolitter, såsom [1- 13C] pyruvat (figur 11D), [1- 13C] pyruvat hydrat (figur 11E), eller henvisning 13C-urea (figur 11F). Det kan co-registreret med en 1H billede. Pulsen sekvens anvendte (EPSI) muliggør erhvervelsen af ​​et billede af hele skive hver 4,9 s. Sammenfattende kan denne teknik give data med en rumlig, tidsmæssig og spektral opløsning for enhver metabolit.

Figur 2
Figur 3: Resultater af en Microwave Sweep med [1- 13 C] pyruvat på Local 3.35-T hyperpolariseringsapparatet. Resultatet af målingerne er bestemmende den optimale mikrobølgefrekvens at maksimere hyperpolarisering på 13 C kerner i målforbindelsen af [1- 13C] pyruvat. Mikrobølge sweep har en form af et EPR absorptionspektrum. Formen og adskille toppene er baseret på den radikale anvendes (i dette tilfælde, trityl radikal), og den største indflydelse har en solid virkning og termisk blanding. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 4: Solid State Polarisering Ophobning af en [1- 13 C] pyruvat Prøve. Et gennemsnit på n = 13 solid-state polarisering buildups med fejlen repræsenteret ved standardafvigelsen målt hver 300 s for op til 4.500 s. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 5: Resultater af 13C NMR spektroskopi til Antal Celler (5 x 10 6 til 3 x 10 7 celler). De indsamlede data plottet med spektral og tidsmæssig opløsning (AD), afbildet med tidsopløsning kun for [1- 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, og [1- 13 C] laktat (EH), og plottet med spektral opløsning kun, opsummering alle tidsskridt (IL). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 6: Resultater af 13C NMR spektroskopi til Antal Celler (4 x 10 7 til 1 x 10 8 celler). De indsamlede data plottet med spektral og tidsmæssig opløsning ( 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, og [1- 13 C] laktat (EH), og plottet med spektral opløsning kun, opsummering alle tid skridt (IL). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 7: Resultater af Simple Metabolit Ratio Kinetic Modeling. Data repræsenterer forholdet af [1- 13C] lactat signal til summen af [1- 13C] pyruvat, [1- 13C] pyruvat-hydrat, og [1- 13C] lactat versus antallet af celler i eksperimenter. Fejlen repræsenterer standardafvigelsen. Please klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 8: Resultater af Simple Metabolit Ratio Kinetic Modeling normaliseret til Antal Celler. Dataene repræsenterer forholdet mellem [1- 13C] lactat signal til summen af [1- 13C] pyruvat, [1- 13C] pyruvat-hydrat, og [1- 13C] lactat normaliseret til antallet af celler versus antallet af celler i forsøgene. Fejlen repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 9: resultaterne af de to-site Exchange Differential Model. De data Repr ESENT den metaboliske vekselkurs (k PA → LAC) versus antallet af celler i forsøgene. Fejlen repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 10: Resultater af To stedet Exchange Differential Model normaliseret til Antal Celler. Dataene repræsenterer den metaboliske kurs (k PA → LAC) normaliseret til antallet af celler versus antallet af celler i forsøgene. Fejlen repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

ent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 11: Resultat af Magnetic Resonance Imaging af den hyperpolariserede [1- 13 C] pyruvat Probe. A) Spektret erhvervet over hele skive og alle tidsskridt. B) Den henfald af [1- 13C] pyruvat og [1- 13C] pyruvat hydrat signal over tid. Det tredje signal er 10 M 13 C-urinstof lokalisering reference. C) Spektret erhvervet fra hele rumlig og tidsmæssig opløsning. D) Det 1H billede overlejret med 13C billedet af den summerede [1- 13 C] pyruvat signal over alle tidsskridt. E) Det 1H billede overlejret med 13C billedet af den summerede [1- 13 C] pyruvat hydrat signal over alle tidsskridt. F) Det 1H billede overlejret med <sup> 13C billede af den summerede 13C-urea signal over alle tidsskridt (reference). 13C-signal i CE normaliseres til det maksimale af signalet af den specifikke metabolit. Klik her for at se en større version af dette tal.

Mobilnummer
5 x 10 6 (n = 2) 10 7 (n = 2) 2 × 10 7 (n = 1) 3 × 10 7 (n = 2) 4 × 10 7 (n = 1) 6 × 10 7 (n = 2) 8 × 10 7 (n = 2) 10 8 (n = 1)
[1- 13C]
pyruvat 		92.9 ± 1.4 91,7 ± 1,0 86.7 77,5 ± 2,7 76 69,7 ± 0,5 65,9 ± 3,7 42,9
[1- 13C]
pyruvat hydrat 		6,8 ± 1,2 6,7 ± 1,6 9.5 10,1 ± 1,8 8.9 7,7 ± 1,5 10,4 ± 0,2 13.4
[1- 13C]
laktat 		0,3 ± 0,3 1,6 ± 0,6 3.8 12,4 ± 4,5 15.1 22,5 ± 1,1 23,7 ± 3,5 43,7

Tabel 1: det relative forhold af Hyperpolariserede metabolitter med Respekt til de forskellige Antal Celler.

Mobilnummer 5 x 10 6 (n = 2) 10 7 (n = 2) 2 × 10 7 (n = 1) 3 × 10 7 (n = 1) 4 × 10 7 (n = 1) 6 × 10 7 (n = 2) 8 × 10 7 (n = 2) 10 8 (n = 1) k PA → LAC [* 10 -4] 0,924 ± 0,870 4,984 ± 1,19 15,135 36,289 58,904 112,174 ± 10,491 114,3 ± 37,059 349,234

Tabel 2:Resultaterne af de to-site Exchange Differential Model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

13 CMRSI med hyperpolariserede prober er en lovende metode til at overvåge metabolisme i realtid in vitro og in vivo. Et meget vigtigt aspekt, når der anvendes denne eksperimentelle fremgangsmåde er den rigtige standardisering, især hvad angår in vitro eksperimenter. Først skal gøres korrekt og konsekvent at opnå den samme koncentration af hyperpolariseret materiale i hvert eksperiment fremstillingen af ​​prøven. Dette kræver en præcis vejning af både prøven for at være hyperpolariserede og bufferen. Hvis koncentrationen ikke er korrekt, er den endelige pH af opløsningen er ikke præcis, hvilket kan have indflydelse på T 1 og cellernes respons. Det er også afgørende at håndtere cellerne så ensartet som muligt. Cellerne bør altid være forberedt på en sådan måde, at der er en minimal forsinkelse mellem cellehøst og den efterfølgende eksperiment for at minimere varigheden af ​​tid cellerne holdes på et meget højt concentration og lav lydstyrke. Variation i udarbejdelsen celle-protokollen, som en anden forberedelse gange eller temperaturer, kan resultere i betydelige variationer i de opnåede data. Blandingen af ​​prøven med cellerne bør også standardiseres. Det er vigtigt at måle tiden mellem tilsætninger af sporstoffet til cellesuspensionen og begyndelsen af ​​målingen, fordi dette kan variere; under dataanalyse, bør dette overvejes.

Det korrekte valg af dataanalyse og kinetisk modellering er afgørende i fortolkningen af ​​de indsamlede data. Den simple model er velegnet til en lineær envejs reaktion med en konstant kurs på to metabolitter. Som beskrevet i indledningen, pyruvat gennemgår flere enzymatiske reaktioner og, endnu vigtigere, det undergår også en ikke-enzymatisk reversible-udbytningsreaktion med pyruvat hydrat. Denne reaktion spillet en afgørende rolle i eksperimenterne, og dens virkning er godt demonstreret in eksperimentet med 8 × 10 7 celler. Skønt Tabel 1 angiver, at pyruvat hydrat relative koncentration ligner andre eksperimenter, når nøje undersøgt i figur 6D, viser en meget højere pyruvat hydrat signal ved begyndelsen af eksperimentet sammenlignet med de andre eksperimenter. Men når den tidsmæssige opløsning er opsummeret, er denne vigtige information tabt og forårsager en fejl i genopbygningen af ​​dataene. På den anden side, den to-site udveksling forskellen model er en mere robust og præcis beskrivelse af kinetikken idet det omfatter den tidsmæssige opløsning i beregningen. Det omfatter således ikke-enzymatisk udveksling med pyruvat hydrat, selv om det hurtigt udveksler med pyruvat under målingen.

Der er forskellige billeddannende strategier at vælge mellem at observere den hyperpolariserede signal eller til at spore metabolismen af ​​en hyperpolariseret molekyle i preclinical og kliniske undersøgelser. Durst et al. demonstrerede fordele og ulemper ved forskellige puls sequnces 76. Den frie induktionshenfald kemisk skift imaging (FIDCSI) sekvens er relativt robust, men har begrænset anvendelse til multi-slice og tidsligt løst billeddannelse. Echo-plane spektroskopiske imaging (EPSI) er robust for gradient spørgsmål og off-resonans effekter, men det er udsat for genopbygning artefakter. Den iterative spaltning af vand og fedt med ekko asymmetrisk og mindste kvadraters estimation (IDEAL) 81, spiral kemiske skift imaging (ISPCSI), puls sekvens 35, og spiral kemiske skift imaging (SPCSI) har høj kodning effektivitet, men er følsomme over for B 0 inhomogenitet. Valget af sekvensen afhænger af scanner egenskaber, biologiske spørgsmål, og systemet, der undersøges.

Der er mange krav, der skal opfyldes for vellykket hyperpolarisering. Men ther er også flere begrænsninger, som den hyperpolariserede 13 CMRSI teknik er i dag står over for. Den primære og uforanderlig begrænsning er T 1 relaksationstid af 13C kerne i molekylet, som definerer mængden af påviseligt signal til rådighed på det pågældende måletidspunktet. Signalet sænkes med hver RF excitation, der forårsager et tab af hyperpolarisering signal gentagne gange under dataopsamling. En anden begrænsning er den relativt lange tidsrum, der kræves til at hyperpolarisere et molekyle. Dette tager typisk fra 30 til 90 min.

I sammenligning med andre teknikker til molekyle billeddannelse, såsom [18F] -FDG PET, går hyperpolariserede 13 CMRSI ikke kræve tumorer med forhøjede glycolytiske metaboliske veje og derfor øget glucose forbrug. Teknikken viser en reel metabolisk flux i realtid. På den anden side, [18F] -FDG PET ikke giver direkte information ommetabolisme men kun indirekte oplysninger om akkumulering i metabolisk aktive område. Dette kan medføre et falsk negativt resultat, hvor tumoren synes at være metabolisk inaktive men er faktisk ved hjælp af forskellige metaboliske veje, såsom glutaminolysis, som kulstof kilde til spredning.

Som konklusion kan opløsning DNP bruges i en lang række applikationer til at studere et ubegrænset liste over sygdomme (såsom diabetes) 82, måle pH 15,36,45, eller overvåge metaboliske ændringer i forskellige former for kræft. Disse målinger kan udføres på forskellige niveauer, fra in vitro celle eksperimenter, gennem prækliniske studier med dyremodeller (såsom mus, rotter, kaniner, grise og hunde), til nylige humane kliniske undersøgelser 57. De fremtidige kliniske anvendelser vil indslag en meget kraftfuld og noninvasive diagnostisk redskab, der ikke blot kunne detektere og lokalisere sygdommen, men også tillade observation af behandlingenrespons i realtid 83.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901 GE Healthcare/Agilent Technologies 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon Magritek 1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 7789-20-0
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic Sigma Aldrich 7558-80-7
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 1310-73-2
Disodium edetate Sigma Aldrich 6381-92-6
Pyruvic acid - 13C1 Cambridge Isotopes Laboratories CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L) Guerbet gadoterate meglumine  
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) GE Healthcare trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line ATCC CRL1435
F-12K medium  ATCC 30-2004
Fetal Bovine Serum ATCC SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1x ATCC 30-2101
Sample plastic cup Oxford Instruments
Trypan blue Bio-Rad 145-0013-MSDS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohren, E. M., Turkington, T. G., Coleman, R. E. Clinical applications of PET in oncology. Radiology. 231 (2), 305-332 (2004).
  2. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  3. Carver, T. R., Slichter, C. P. Polarization of Nuclear Spins in Metals. Phys. Rev. 92 (1), 212-213 (1953).
  4. Abragam, A., Proctor, W. G. Spin Temperature. Phys. Rev. 109 (5), 1441-1458 (1958).
  5. Abragam, a, Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Reports Prog. Phys. 41 (3), 395-467 (2001).
  6. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  7. Shimon, D., Hovav, Y., Feintuch, A., Goldfarb, D., Vega, S. Dynamic nuclear polarization in the solid state: a transition between the cross effect and the solid effect. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (16), 5729-5743 (2012).
  8. Serra, S. C., Rosso, A., Tedoldi, F. Electron and nuclear spin dynamics in the thermal mixing model of dynamic nuclear polarization. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (38), 13299-13308 (2012).
  9. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Brindle, K. M. Biomedical applications of hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55 (4), 285-295 (2009).
  10. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Chen, A., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Hyperpolarized 13C metabolic imaging using dissolution dynamic nuclear polarization. J. Magn. Reson. Imaging. 36 (6), 1314-1328 (2012).
  11. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  12. Golman, K., in't Zandt, R., Thaning, M. Real-time metabolic imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (30), 11270-11275 (2006).
  13. Comment, A., Rentsch, J., et al. Producing over 100 ml of highly concentrated hyperpolarized solution by means of dissolution DNP. J. Magn. Reson. 194 (1), 152-155 (2008).
  14. Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magn. Reson. Med. 66 (2), 505-519 (2011).
  15. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magn. Reson. Med. 60 (2), 253-257 (2008).
  16. Chen, A. P., Albers, M. J., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magn. Reson. Med. 58 (6), 1099-1106 (2007).
  17. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
  18. Schroeder, M. A., Swietach, P., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovasc. Res. 86 (1), 82-91 (2010).
  19. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Tropp, J., Pfefferbaum, A., Spielman, D. M., Mayer, D. Cerebral dynamics and metabolism of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate using time-resolved MR spectroscopic imaging. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (13), 1734-1741 (2010).
  20. Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Res. 66 (22), 10855-10860 (2006).
  21. Park, I., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C magnetic resonance metabolic imaging: application to brain tumors. Neuro. Oncol. 12 (2), 133-144 (2010).
  22. Albers, M. J., Bok, R., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Res. 68 (20), 8607-8615 (2008).
  23. Yen, Y. -F., Le Roux, P., et al. T(2) relaxation times of (13)C metabolites in a rat hepatocellular carcinoma model measured in vivo using (13)C-MRS of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 23 (4), 414-423 (2010).
  24. Dafni, H., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopic imaging informs on hypoxia-inducible factor-1 and myc activity downstream of platelet-derived growth factor receptor. Cancer Res. 70 (19), 7400-7410 (2010).
  25. Ward, C. S., Venkatesh, H. S., et al. Noninvasive detection of target modulation following phosphatidylinositol 3-kinase inhibition using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res. 70 (4), 1296-1305 (2010).
  26. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magn. Reson. Med. 65 (2), 557-563 (2011).
  27. Johannesson, H., Macholl, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Dynamic Nuclear Polarization of [1-13C]pyruvic acid at 4.6 tesla. J. Magn. Reson. 197 (2), 167-175 (2009).
  28. Durst, M., Koellisch, U., et al. Bolus tracking for improved metabolic imaging of hyperpolarised compounds. J. Magn. Reson. 243, 40-46 (2014).
  29. Khegai, O., Schulte, R. F., et al. Apparent rate constant mapping using hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 27 (10), 1256-1265 (2014).
  30. Sogaard, L. V., Schilling, F., Janich, M. A., Menzel, M. I., Ardenkjaer-Larsen, J. H. In vivo measurement of apparent diffusion coefficients of hyperpolarized (1)(3)C-labeled metabolites. NMR Biomed. 27 (5), 561-569 (2014).
  31. Aquaro, G. D., Frijia, F., et al. 3D CMR mapping of metabolism by hyperpolarized 13C-pyruvate in ischemia-reperfusion. JACC. Cardiovasc. Imaging. 6 (6), 743-744 (2013).
  32. Menzel, M. I., Farrell, E. V., et al. Multimodal assessment of in vivo metabolism with hyperpolarized [1-13C]MR spectroscopy and 18F-FDG PET imaging in hepatocellular carcinoma tumor-bearing rats. J. Nucl. Med. 54 (7), 1113-1119 (2013).
  33. Schilling, F., Duwel, S., et al. Diffusion of hyperpolarized (13) C-metabolites in tumor cell spheroids using real-time NMR spectroscopy. NMR Biomed. 26 (5), 557-568 (2013).
  34. Schulte, R. F., Sperl, J. I., et al. Saturation-recovery metabolic-exchange rate imaging with hyperpolarized [1-13C] pyruvate using spectral-spatial excitation. Magn. Reson. Med. 69 (5), 1209-1216 (2013).
  35. Wiesinger, F., Weidl, E., et al. IDEAL spiral CSI for dynamic metabolic MR imaging of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Magn. Reson. Med. 68 (1), 8-16 (2012).
  36. Wilson, D. M., Keshari, K. R., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. J. Magn. Reson. 205 (1), 141-147 (2010).
  37. Schroeder, M. A., Atherton, H. J., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  38. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., et al. Metabolic imaging in the anesthetized rat brain using hyperpolarized [1-13C] pyruvate and [1-13C] ethyl pyruvate. Magn. Reson. Med. 63 (5), 1137-1143 (2010).
  39. Chen, A. P., Kurhanewicz, J., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magn. Reson. Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
  40. Witney, T. H., Kettunen, M. I., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-(13)C]pyruvate and. Br. J. Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
  41. Bohndiek, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to a vascular disrupting agent using hyperpolarized (13)C magnetic resonance spectroscopy. Mol. Cancer Ther. 9 (12), 3278-3288 (2010).
  42. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (47), 19801-19806 (2009).
  43. Jensen, P. R., Peitersen, T., et al. Tissue-specific short chain fatty acid metabolism and slow metabolic recovery after ischemia from hyperpolarized NMR in vivo. J. Biol. Chem. 284 (52), 36077-36082 (2009).
  44. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
  45. Scholz, D. J., Janich, M. A., et al. Quantified pH imaging with hyperpolarized 13C-bicarbonate. Magn. Reson. Med. 73 (6), 2274-2282 (2015).
  46. Koellisch, U., Gringeri, C. V., et al. Metabolic imaging of hyperpolarized [1-(13) C]acetate and [1-(13) C]acetylcarnitine - investigation of the influence of dobutamine induced stress. Magn. Reson. Med. 74 (4), 1011-1018 (2015).
  47. Koellisch, U., Laustsen, C., et al. Investigation of metabolic changes in STZ-induced diabetic rats with hyperpolarized [1-13C]acetate. Physiol. Rep. 3 (8), (2015).
  48. Jensen, P. R., Meier, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Duus, J. O., Karlsson, M., Lerche, M. H. Detection of low-populated reaction intermediates with hyperpolarized NMR. Chem. Commun. (34), 5168-5170 (2009).
  49. Koelsch, B. L., Keshari, K. R., Peeters, T. H., Larson, P. E. Z., Wilson, D. M., Kurhanewicz, J. Diffusion MR of hyperpolarized 13C molecules in solution. Analyst. 138 (4), 1011-1014 (2013).
  50. Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10435-10439 (2003).
  51. von Morze, C., Larson, P. E. Z., et al. Imaging of Blood Flow Using Hyperpolarized [(13)C]Urea in Preclinical Cancer Models. J. Magn. Reson. Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
  52. Chiavazza, E., Kubala, E., et al. Earth's magnetic field enabled scalar coupling relaxation of 13C nuclei bound to fast-relaxing quadrupolar 14N in amide groups. J. Magn. Reson. 227, 35-38 (2013).
  53. Jensen, P. R., Karlsson, M., Meier, S., Duus, J., Lerche, M. H. Hyperpolarized amino acids for in vivo assays of transaminase activity. Chem. - A Eur. J. 15 (39), 10010-10012 (2009).
  54. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Detection of tumor glutamate metabolism in vivo using 13C magnetic resonance spectroscopy and hyperpolarized [1-13C]glutamate. Magn. Reson. Med. 66 (1), 18-23 (2011).
  55. Chaumeil, M. M., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized [1-13C] glutamate: a metabolic imaging biomarker of IDH1 mutational status in glioma. Cancer Res. 74 (16), 4247-4257 (2014).
  56. Keshari, K. R., Wilson, D. M. Chemistry and biochemistry of 13C hyperpolarized magnetic resonance using dynamic nuclear polarization. Chem. Soc. Rev. 43 (5), 1627-1659 (2014).
  57. Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Transl. Med. 5 (198), (2013).
  58. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  59. Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. {Ü}ber den Stoffwechsel von Tumoren im K{ö}rper. Klin. Wochenschr. 5 (19), 829-832 (1926).
  60. Barnes, A. B., De Paepe, G., et al. High-Field Dynamic Nuclear Polarization for Solid and Solution. Biological NMR. Appl. Magn. Reson. 34 (3-4), 237-263 (2008).
  61. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Gatter, K. C., Harris, A. L. Pyruvate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase expression in non small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia. 7 (1), 1-6 (2005).
  62. Golman, K., Petersson, J. S. Metabolic Imaging and Other Applications of Hyperpolarized 13C1. Acad. Radiol. 13 (8), 932-942 (2016).
  63. Golman, K., Petersson, J. S., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magn. Reson. Med. 59 (5), 1005-1013 (2008).
  64. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Jeffrey, F. M., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  65. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia NMR detection of hyperpolarized 13CO2 and H13CO3-. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  66. Hu, S., Chen, A. P., et al. In vivo carbon-13 dynamic MRS and MRSI of normal and fasted rat liver with hyperpolarized 13C-pyruvate. Mol. imaging Biol. MIB Off. Publ. Acad. Mol. Imaging. 11 (6), 399-407 (2009).
  67. Kohler, S. J., Yen, Y., et al. In vivo 13 carbon metabolic imaging at 3T with hyperpolarized 13C-1-pyruvate. Magn. Reson. Med. 58 (1), 65-69 (2007).
  68. Hu, S., Lustig, M., et al. 3D compressed sensing for highly accelerated hyperpolarized (13)C MRSI with in vivo applications to transgenic mouse models of cancer. Magn. Reson. Med. 63 (2), 312-321 (2010).
  69. Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
  70. Schroeder, M. A., Cochlin, L. E., Heather, L. C., Clarke, K., Radda, G. K., Tyler, D. J. In vivo assessment of pyruvate dehydrogenase flux in the heart using hyperpolarized carbon-13 magnetic resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (33), 12051-12056 (2008).
  71. Zierhut, M. L., Yen, Y. -F., et al. Kinetic modeling of hyperpolarized 13C1-pyruvate metabolism in normal rats and TRAMP mice. J. Magn. Reson. 202 (1), 85-92 (2010).
  72. Dennis, L. K., Resnick, M. I. Analysis of recent trends in prostate cancer incidence and mortality. Prostate. 42 (4), 247-252 (2000).
  73. Jambor, I., Borra, R., et al. Functional imaging of localized prostate cancer aggressiveness using 11C-acetate PET/CT and 1H-MR spectroscopy. J. Nucl. Med. 51 (11), 1676-1683 (2010).
  74. Presti, J. C. J., Hricak, H., Narayan, P. A., Shinohara, K., White, S., Carroll, P. R. Local staging of prostatic carcinoma: comparison of transrectal sonography and endorectal MR imaging. AJR. Am. J. Roentgenol. 166 (1), 103-108 (1996).
  75. Schulte, R. F., Sacolick, L., et al. Transmit gain calibration for nonproton MR using the Bloch-Siegert shift. NMR Biomed. 24 (9), 1068-1072 (2011).
  76. Durst, M., Koellisch, U., et al. Comparison of acquisition schemes for hyperpolarised (1)(3)C imaging. NMR Biomed. 28 (6), 715-725 (2015).
  77. Janich, M. A., Menzel, M. I., et al. Effects of pyruvate dose on in vivo metabolism and quantification of hyperpolarized (1)(3)C spectra. NMR Biomed. 25 (1), 142-151 (2012).
  78. Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13 C NMR. NMR Biomed. 25 (11), 1286-1294 (2012).
  79. Gómez Damián, P. A., Sperl, J. I., et al. Multisite Kinetic Modeling of (13)C Metabolic MR Using [1-(13)C]Pyruvate. Radiol. Res. Pract. 2014, (2014).
  80. Talbot, J. -N., Gutman, F., et al. PET/CT in patients with hepatocellular carcinoma using [(18)F]fluorocholine: preliminary comparison with [(18)F]FDG PET/CT. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 33 (11), 1285-1289 (2006).
  81. Reeder, S. B., Pineda, A. R., et al. Iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation (IDEAL): application with fast spin-echo imaging. Magn. Reson. Med. 54 (3), 636-644 (2005).
  82. Laustsen, C., Ostergaard, J. A., et al. Assessment of early diabetic renal changes with hyperpolarized [1-(13) C]pyruvate. Diabetes. Metab. Res. Rev. 29 (2), 125-129 (2013).
  83. Serrao, E. M., Brindle, K. M. Potential Clinical Roles for Metabolic Imaging with Hyperpolarized [1-(13)C]Pyruvate. Front. Oncol. 6, 59 (2016).

Tags

Cancer Research hyperpolarisering DNP, NMR magnetisk resonansspektroskopi magnetisk resonans imaging MRI, LDH pyruvat lactat prostatisk carcinom
hyperpolariseret<sup&gt; 13</sup&gt; C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy og Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, … More

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, K. A., Topping, G., Hundshammer, C., Feuerecker, B., Gómez, P. A., Pariani, G., Schilling, F., Glaser, S. J., Schulte, R. F., Menzel, M. I., Schwaiger, M. Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54751, doi:10.3791/54751 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter