Abstract
過去数十年間では、腫瘍の病期分類、再病期決定、治療応答のモニタリング、および種々の癌の再発を検出するための新しい方法は、18 F-フルオロ（[18 Fと最先端の陽電子放射断層撮影法に関連して出現しています] -FDG PET）。 13 C核磁気共鳴分光イメージング（13 CMRSI）は、 インビボ及びリアルタイムでの代謝のモニタリングを可能にする低侵襲イメージング法です。 13 C核磁気共鳴（NMR）に基づく他の方法と同様に、それが原因13 C及び低天然存在度の比較的低い磁気回転比で低熱分極とそれに続く低い信号対雑音比の挑戦に直面しています生物学的サンプル。これらの制限を克服することにより、後続のサンプルの溶解との動的核分極（DNP）は、最近、一般に有効測定するNMR及び磁気共鳴イメージング（MRI）システムを使用してい様々な生物学的システムでは、研究、および画像鍵代謝経路。過去10年間に、広く細胞のエネルギー代謝を調査するために、インビトロ 、前臨床に使用される、および、より最近では、臨床試験されている、13 CMRSIある[1- 13 C]ピルビンで使用特に興味深く有望な分子癌および他の疾患インチこの記事では、我々は3.35 T前臨床DNPの超偏極を用いて、溶解DNPの技術の概要を説明し、in vitro試験におけるその使用法を示します。過分極のための同様のプロトコルは、同様のインビボ研究においてほとんどの部分に適用することができます。そうするために、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）を使用し、13 CMRSIを使用して、in vitroでの前立腺癌細胞株、PC3、中[1- 13 C]乳酸に[1- 13 C]ピルビン酸の代謝反応を触媒しました。
Introduction
現在、癌の広範囲の腫瘍病期分類、再病期決定、治療応答のモニタリング、及び再発の検出のために最も広く使用されている臨床的方法は、[18 F] -FDG PETです。 1しかし、最近、いくつかの新規および代替的なアプローチが出現しています。これらの方法の一つは、13 CMRSIです。この技術は、リアルタイムで、インビトロまたはインビボでの代謝を評価するために、低侵襲MRI続いて生物学的サンプル中に13 C-分子の導入を含みます。それにもかかわらず、そのような[18 F] -FDG PET又はコンピュータ断層撮影のような他の方法と比較して13 CMRSIの最大の課題は、低い信号対雑音比です。
NMR信号は、分極レベル、総人口の2つのエネルギー状態のスピン半核集団差の比（ 図1A）に正比例します。偏光は目の製品です。電子原子核の磁気回転比（γ）と温度に対する印加磁界の強さ。 1 H核の典型的な分極は、比較的低い信号対雑音比を与える3 Tに0.005％、0.001％程度です。今日の最先端のMRIのみによる生体試料中の1 Hの高い豊かさと1 H（γの1H = 42.576 MHzで/ T）の高い磁気回転比に成功したイメージング方法でした。しかし、炭素などの他の核を、観察、より厳しいあります。唯一の安定した、磁気的に活性な炭素同位体、13 Cは、すべての炭素原子のわずか1.1％を占めます。また、13 C（γ13C = 10.705 MHzで/ T）の磁気回転比は低い検出効率につながる、1 Hのそれよりも4倍低いです。要約すると、低い13 Cの存在量および低いγ13Cは熱13 C測定値が1の感度の0.0176％に達成させin vivoでの H-NMR測定。
動的核分極
13 C測定の比較的低い感度を克服するための方法は、DNPです。もともとはアルバートW.オーバーハウザーによって1953年に金属について説明しました。彼の記事では、彼は述べた： "伝導電子の電子スピン共鳴が飽和している場合、核はその磁気回転比は、電子スピンのことであった場合、彼らは次のようになり、同じ程度に偏光されることが示されている。「2その後その年、カーバーとスリクターは、実験的にオーバーハウザーの仮説3を確認しました 。 1958年、Abragamとプロクターは、液体中の電子のためにこの効果を説明し、それを名前の「固体効果。」 4 K以下の温度で、電子スピン分極は、ほぼ100％に達し、核スピン分極（ 図1B）4以下の大きさより3桁高いです。 T電子の磁気回転比（γE = 28024.944 MHzの/ T）は、核磁気回転比よりも三桁であるため、彼が発生します。電子は、対応する電子に近い周波数でマイクロ波照射を使用して、核スピンへスピンから、このようなオーバーハウザー効果、固体効果、クロス効果、及び熱混合効果として電子と原子核との間の弱い相互作用は、偏光の転送を可能にします常磁性共鳴（EPR）周波数5,6。 DNPの理論は、さらにより多くの電子および熱混合が関与するために開発されました。それにもかかわらず、現在までに、DNPの統一定量的な理論的な説明は7,8を公開されていません。
図1：動的核分極および過分極を理解します。スピン人口のA）は概略比較熱平衡偏光状態と過分極状態インチB）偏光は、温度に依存しています。電子（E - ）の偏光は100％1.4 KでDNPの下に到達した電子から10 5倍までの彼らの偏光を増加させる13 C核に分極の転送を可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
13 C NMRを用いて、生物学的システムの研究にDNPを導入するために、その後の迅速なサンプルの溶解を開発する必要がありました。オーバーハウザーの仮説、月H. Ardenkjaer-ラーセンら後の50年。最小限の過分極損失6で液体状態に過分極凍結サンプルをもたらす技術的に困難な問題を解決しました。解散DNPは13 CMRSと呼ばれる新しい研究分野を開きました私は、種々の疾患状態9,10を調査し、特徴づけるための新しい方法を提供します。不対電子のように安定したキャリア、トリチルラジカルトリス（8-カルボキシ-2,2,6,6-テトラ（ヒドロキシエチル）-benzo- [1,2-4,5]ビス - （1,3） -dithiole -4-イル）メチルナトリウム塩（OX063）または（2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イル）オキシル（TEMPO）は、通常使用されます。これらは、所望の13 C標識された分子と混合し、対応するEPR周波数に近い周波数でマイクロ波照射に曝露されます。この技術を用いて、13 C核の分極を37〜11％まで増加させることができます。これは、熱平衡偏光11,12に比べて10 5倍の偏光強化につながります。しかし、マイクロ波照射が停止され、及び/又は13 C-分子は液体状態に転送されるとすぐように、偏光を偏光された13 C核の縦緩和時間（T 1）で減衰します。このように、迅速な溶解技術の発明または実験測定までの時間を短縮し、後続の技術（ すなわち、注射）は、生物学的なアプリケーション13のために重要です。
候補分子が成功した13 CMRSIの研究のために満たすために必要な三つの主要な要件があります。まず、目的の13 C核が十分に長いT 1（> 10秒）を有していなければなりません。 13 C-標識の選択は非常に重要です。最良の候補核が結合を介して 1 H-核と直接接触を持つ炭素です。元の物質と有意に異なる化学シフト下流代謝産物を生じ、3 T 1回-それはまた、急速に2内に代謝される必要があります。空間分布は、トランスを可能にする電子と13 Cとの間の距離を減少するように試料混合物は、固体状態で場合非晶質ガラスを形成しなければなりません偏光のFER。候補分子は、自然に非晶質ガラスを形成しない場合、それは、例えばグリセロールまたはジメチルスルホキシド14として、ガラス化剤中に高度に可溶性である必要があります。これらの要件は、候補分子が比較的少数で生じます。しかし、適切な分子の発見に成功した後、過分極のための作業プロトコルを開発することが9,14,15技術的に挑戦することができます。
36、[2- 13 C]ピルビン酸37、[1- 13 C]ピルビン酸エチル38、[1- 13 C -近年では、いくつかの基板には、[1- 13 C]ピルビン酸12,16として、正常に偏しています]乳酸39、[1- 13 C]フマル酸40から43、13 C-重炭酸塩36,44,45、[1- 13 C]酢酸ナトリウム43,46 - 49、13 C-尿素6,36,50,51 、[5- 13 C] glutamineの15,52,53、[1- 13 C]グルタミン酸53,54、[1- 13 C] 2-オキソグルタル酸55、[1- 13 C]アラニン、およびその他14,56。過分極に特に興味深く、一般的に使用される基板は、[1- 13 C]ピルビン酸塩です。広く種々の疾患14,17,22における細胞のエネルギー代謝を調査するために前臨床試験で使用されています。 [1- 13 C]ピルビン酸は続いて代謝される前に、細胞膜を横切る比較的長いT 1および迅速な輸送を含む成功した超偏極のためのすべての要件を満たしています。 [1- 13 C]ピルビン酸と前臨床研究は、現在、診療所57に翻訳されています。
ピルビン酸の代謝
よく、癌細胞のDNAおよびそれらの代謝経路の変化の突然変異との間に直接的なリンクがあることが知られています。すでに1920年代、オットーウォーバーグdiscov60 -健康な組織58に比べて、腫瘍中の乳酸のグルコース生産の増加代謝があることをered。続いて、このようなペントース - リン酸経路、トリカルボン酸回路、酸化的リン酸化、ならびにヌクレオチドおよび脂質の合成のような他の代謝経路における種々の交替は、記載されています。
ピルビン酸は、解糖の最終産物です。腫瘍では、LDH 61によって触媒嫌気的解糖を受け、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元形態と反応し （NADH）、乳酸塩および補酵素（NAD +）の酸化型になります。あるいは、ピルビン酸は、アラニントランスアミナーゼ（ALT）によって触媒されるアラニンを形成するグルタミン酸転移反応を受けます。両方の反応は容易に可逆的です。ピルビン酸は、また、二酸化炭素およびアセチルCoA、rにピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）により触媒される脱炭酸を受けこの段階で不可逆的な反応をepresenting。これらの反応速度での交代は、腫瘍代謝17,21,22,25,62にリンクすることができます。代謝経路を図2にまとめます。
図2：ピルビン酸の主要代謝反応のダイアグラム。ピルビン酸/乳酸変換はLDHにより触媒される、ピルビン酸/アラニンの変換はALTによって触媒されます。ピルビン酸は、不可逆的にPDHによって、およびCO 2 -アセチルCoAに変換され、CO 2は重炭酸塩80とのpH依存性平衡状態にあります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
過分極[1- 13 C]ピルビン酸塩及びその代謝産物の検出は、以前にラットにおいて実証されている彼芸術37,63 - 65、肝臓66、筋肉、および腎臓62,67。ある研究では、正常と絶食ラットの肝臓66との間に乳酸からアラニンへの比率に有意差を示し、肝癌68,69に非常に上昇し、過分極[1- 13 C]乳酸レベルを示しました。腫瘍の悪性度を切除した腫瘍の組織学的悪性度と高い相関を示す過分極乳酸レベルで、過分極[1- 13 C]ピルビン酸22を用いて、マウス前立腺（TRAMP）のトランスジェニック腺癌において同定することができるという証拠があります。 ALTによってピルビン酸から触媒アラニンはまた、ラットの肝細胞癌23に有用なマーカーとして提案されています。
ピルビン酸、乳酸の代謝フラックスを測定するモニタリング虚血63,65,70のための細胞傷害性化学療法17,40、標的薬による治療への応答として使用されてきました<SUP> 24,25,41、または動物モデルでの放射線治療26。また、神経膠芽腫および乳癌のマウスモデル25におけるホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）阻害剤LY294002応答の検出のために使用されてきました。脳腫瘍26および前立腺癌24,71におけるピルビン酸代謝の変化はまた、治療後に観察されています。
前立腺癌
前立腺癌は、世界中の72人の男性に死刑に関連する高齢男性と第二の主要癌における主要な癌です。現在まで、信頼性の高い、非侵襲的な方法は、患者の厳格な検出およびステージングを有効にするための新規な代謝イメージング技術のための緊急の必要性を強調し、前立腺癌73,74の早期診断および特徴付けのために用意されていません。前立腺癌は、患者における13 CMRSIと組み合わせた溶解DNPの可能性を実証するためのモデルとして使用されました57です。この作業は、[1- 13 C]ピルビン酸および前立腺癌のイメージングのための13 CMRSIを採用した最初の臨床試験で継続し、それは最近（NCT01229618）を完了したしました。
この作品の背後にある動機は、細胞を用いた前臨床設定で13 CMRSI法の適用をより詳細に、より広い聴衆のために説明することでした。 PC3前立腺癌細胞株のin vitroでの [1- 13 C]乳酸に[1- 13 C]ピルビン酸のLDH触媒による代謝を測定し、我々は、in vitro試験で溶解DNPの適用可能性を実証し、重要なステップに対応し、実験中の課題。
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Protocol
1.サンプルストック溶液の調製
- 1-ミリモル/ L GadMの最終濃度が得られるように濃縮された[1- 13 C]ピルビン酸にgadoterateメグルミン（GadM、0.5モル/ L）を追加します。トリチルラジカルトリス追加（8-カルボキシ-2,2,6,6-テトラ（ヒドロキシエチル）-benzo- [1,2-4,5]ビス - （1,3）-dithiole -4-イル） - 15ミリモル/ Lの最終濃度を与えるために、この混合物にメチルナトリウム塩（OX063）。完全に溶解するまでボルテックス。
注：このストック溶液の調製は、3.35-T前臨床DNPの超分極との使用のために設計されています。 7-T臨床超偏極を使用した場合、より高い磁場で、その利点は無視できる、ので、gadoterateメグルミンは必要ありません。ガドリニウムベースの造影剤の添加はまた、達成可能な固体分極及び分極率を増加させます。しかし、液体状態で、造影剤は、T 1緩和時間を短縮します。
2.細胞培養の成長
注：各細胞株は、細胞増殖のための特定の調製プロトコルを必要とします。細胞株プロバイダとの要件を参照してください。
実験用の細胞の調製
- 細胞培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を〜10 mLで細胞を洗浄します。
- フラスコにトリプシンの5ミリリットルを加え、3〜5分間インキュベーターに細胞培養フラスコを返します。
- トリプシンを不活性化するためにF-12K媒体の〜5ミリリットルを追加します。
- 自動セルカウンターを用いて細胞を数えます。染色液の10μLと細胞溶液の10μLを混ぜます。ピペットでよく混ぜ、目に混合物10μLを転送「カウントガラス」の電子室。
- 削除し、フラスコ（複数可）で細胞を数えます。所望の細胞数を含む適切なボリュームを転送する（ 例えば、5×10 6、最大10〜8）プラスチックバイアルへ。
- 5分間、1200×gで細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
- 800μLの総容量に10％FCSを含むF-12K培地中で細胞を再懸濁し、反応カップ（2 mL）に移します。暖かい水で満たされたプラスチックバイアルに反応カップを置きます。
4.解散エージェントの準備
注：溶解剤が、過分極サンプルを溶解するために使用される液体です。生物学的用途では、溶解は、通常は1g / Lエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する、H 2 Oをベースまたは重水（D 2 O）は、PBS又はトリスベースの緩衝剤、（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）を用いて行われます。
- Prepara20ミリモル/ L PBS緩衝液の化
- （溶解剤を100mLを調製し、20ミリモル/ Lの水酸化ナトリウム溶液中にリン酸一ナトリウム（ の NaH 2 PO 4）36mgの、リン酸二ナトリウム（のNa 2 HPO 4）の247ミリグラム、及びEDTA 10mgを溶解しますNaOH）D 2 Oミックスで適切に完全に溶解するまで。
注：EDTA（1 G / L）は、過分極を損なう可能性のある強磁性体イオンを除去するために緩衝液に添加されます。 7.4のpHを達成するために1モル比のNaOHを1にピルビン酸を中和するために使用されます。
- （溶解剤を100mLを調製し、20ミリモル/ Lの水酸化ナトリウム溶液中にリン酸一ナトリウム（ の NaH 2 PO 4）36mgの、リン酸二ナトリウム（のNa 2 HPO 4）の247ミリグラム、及びEDTA 10mgを溶解しますNaOH）D 2 Oミックスで適切に完全に溶解するまで。
5.温度可変インサート（VTI）クールダウン
- DNP-NMR偏光板プログラムのメインウィンドウで、をクリックして「クールダウン。」
注：これは、真空ポンプのスイッチをオンにし、約5.0ミリバールにVTIを排出。その後、VTIと液体ヘリウム貯留槽との間にニードルバルブが完全に液体ヘリウムはVTIに流入することができ、表示されます。流量をrそれは、ヘリウムの沸騰温度に達するまでVTIに液体ヘリウムの最適な量を維持するために、ニードル弁によってegulated。その後、VTIは、ほぼ完全な真空にし、温度は約1.4 KでVTIが65％に液体ヘリウムを上にして充填されて到達します。この時点で、器具は、サンプルの挿入のための準備ができています。
6.サンプルの調製および挿入
- マイクロピペットを用いて、プラスチック製のカップに13 C標識試料原液の〜8μLを追加します。
- 挿入ロッドにプラスチックカップを取り付け、メインプログラムウィンドウに "挿入サンプル」を押すことにより、サンプルの挿入プロセスを開始します。 「通常のサンプル」を選択し、クリックして "続行。」
注：このプロセスの間、ニードルバルブは、最初のVTI内への液体ヘリウムの流れを中止する閉じ、VTI内の圧力が増大します。 VTI内の試料ホルダは、液体ヘリウム、入口弁から上昇させますVTIの上部に開き、ヘリウムガスの流量は、空気の湿気によって外部汚染を防止するために、入口弁から導入されます。 - プロンプトが表示されたら、ダウンVTIに取り付けられたプラスチックカップに挿入ロッドを押してください。 VTIの下部にあるサンプルホルダーに到達することを確認します。それ以外の場合は、気体ヘリウムはVTIの外にサンプルをプッシュすることができます。
- 挿入ロッドを外し、取り外します。
- ダイアログウィンドウで「次へ」をクリックして手順を完了します。サンプル挿入手順は、10秒を上回ってはいけません。
注：入口弁は、サンプルカップを有する試料ホルダが液体ヘリウムに浸漬され、ヘリウムガスの流れが中断され、閉じ、ニードルバルブ、液体ヘリウムがVTIに流入できるように開放されます。 5の後 - 10分、VTIは自由電子の全てが偏することを可能にする、1.4 K以下に冷却されます。 - サンプルとプラスチックカップをtをチェックすることにより、VTIに正しく導入されたことを確認してください帽子には、挿入ロッドに取り付けられた、またはヘリウムガスによってVTIから押し出されていません。その後、「完了」をクリックします。
7.マイクロ波スイープ（オプション）
注：マイクロ波掃引は、最適マイクロ波周波数の決意は、標的化合物における13 C核の過分極率を最大化することができます。
- 、マイクロ波スイープを測定RINMRプログラムを起動し、タイプ「HYPERSENSENMR、 "と" Configを選択」とクリックして「ドMicrosweepを。」
- プロセスを開始するには、メインプログラムウィンドウの「キャリブレーション」タブを選択します。
- クリックして「生成」と開始および終了周波数（ 例えば、94.100 GHzの-94.200 GHz帯）、周波数ステップサイズ（ 例えば、20 MHz）で、パワー（100ミリワット）、および時間（60秒）を選択します。 「有効」と「スタート」、続行」をクリックします。」
注：これらの設定により、超分極は、最初のサンプルを分極します94.100 GHzおよび100ミリワットの電力のマイクロ波周波数を用いて60秒間。そして、それは90°無線周波数（RF）パルスを印加し、内蔵分光計を用いて過分極13 C信号を取得します。これらのステップは、特定の周波数範囲内の各ステップごとに繰り返されます。その後の過分極のために、測定された最大の信号振幅を持つマイクロ波周波数を選択します。
8.偏光
- 分極のビルドアップを測定するために、RINMRプログラム、タイプ「HYPERSENSENMRを、「起動して「Configを選択」をクリックし「ソリッドビルドアップを。」
- DNP-NMR偏光板プログラムのメインウィンドウでは、過分極プロセスを開始する「偏光」をクリックします。
- （マイクロ波掃引中に得られた）最適なマイクロ波周波数とサンプル用の電源（ 例えば、100 MW）を選択し、クリックして"次へ。"
- 「偏光ビルドアップ監視」を有効にして、クリックして「完了」を
- > 95％（〜60分間[1- 13 C]ピルビン酸）にサンプルを分極。
注：偏光の間に、マイクロ波は、13 Cが過分極不対電子スピンと整列するように回転引き起こし、VTIに試料に導かれます。過分極の蓄積を測定するために、5°のフリップ角（FA）を有するRFパルス（ 例えば、すべての300の）周期的に適用され、結果として得られる信号は、偏光ビルドアップ曲線としてプロットされています。
9.解散
- 分極が> 95％に達すると、DNP-NMR偏光板プログラムのメインウィンドウで「解散」をクリックすることにより、溶解プロセスを開始します。
- ドロップダウンメニューから、溶解プロセスを選択し、クリックして「次へ」を
注：偏光子は1が追跡ガスのタイミングを選択することにより、所望の溶解プロセスを定義することができます。 - トンで加熱された容器内に上部弁を通る溶解剤の負荷〜5ミリリットル偏光子の彼溶解部分。以下の式を用いて必要な溶解剤の正確な量を計算します。
V DA、溶解剤、M PA、MのOX063の所望の体積であり、そしてm ガドは 、ピルビン酸の質量である場合、OX063とgadoterateメグルミンは、それぞれ、試料原液に添加しました。 - 入口弁上記のアクティブな位置での溶解スティックを置きます。
注：これは楽器はVTIのサンプルカップにその溶解機器を接続することができます。 - 溶解プロセスを開始するには「完了」をクリックしてください。
注：溶解剤がヘリウムガスで3バールに加圧され、その後圧力の上昇を引き起こし、200°Cまで加熱します。圧力が10バールに達すると、ニードル弁は、VTIへの液体ヘリウムの流れを中止する閉じ。サンプルホルダーは、カップを上昇させます液体ヘリウムから。溶解スティックVTIに下げ、サンプルカップに接続されています。馴化溶解剤は、サンプルの迅速な溶解を引き起こす、カップに溶解棒を通じて、溶解緩衝液およびヘリウムガスを含む加熱容器から生じる圧力によって押されます。次いで、溶液をプラスチックチューブを介して収集フラスコへ流出します。添付のカップで溶解スティックは、その後、VTIから発生します。 - 「クリーニング」の位置に取り付けられたカップとの溶解スティックを移動し、クリックすることで、プロセスを終了し、「完了」を
13 C過分極信号の10.検出
- in vitroでの 13 C代謝磁気共鳴分光法
- 細胞溶液の800μLと、収集フラスコから20ミリモル/ L溶解した過分極サンプルの200μLを混ぜます。
注：結果の最終濃度[1- 13 C]ピルビン酸の4ミリモル/ Lです。 - 5 mmのNMRチューブにマイクロピペットと転送〜600μLを使用してもサスペンションを混ぜます。
- 1-TのNMR分光計に5 mmのNMRチューブを挿入します。ソフトウェアのメインウィンドウで、百10°RFパルスごとに3秒のシリーズを適用し、測定を開始するには、「ファイル名を指定して実行」をクリックします。
注：細胞と過分極サンプルの初期混合および分光取得の開始までの時間を測定します。混合手順は、偏光損失を最小限にするために30秒を超えないことを確認してください。
- 細胞溶液の800μLと、収集フラスコから20ミリモル/ L溶解した過分極サンプルの200μLを混ぜます。
- 13 Cの代謝磁気共鳴イメージング
- MRI分光計を用いたin vitro実験のためのコンテナを構築するには、5-mLシリンジを取るとの親しみやすい領域に分光器のアイソセンタから到達するのに十分な長さであるカテーテル（D = 1.2ミリメートル）に接続します分光計。
- 目を用いたin vitro容器を満たします実験のための所望の濃度の電子細胞溶液（ 例えば、10 8）または酵素溶液で。
- MRI磁石のアイソセンタでのin vitroでの容器を置きます。容器上の13 C-高周波同調受信機コイルを配置します。近くに濃縮13 C標識キャリブレーションファントム（ 例えば、10モル/ L 13 C-尿素）を配置します。
- NMRスキャナのアイソセンタの近くに「 インビトロコンテナ」を挿入します。
- スキャナの標準的な3面の局在化配列を実行し、必要に応じて、アイソセンタにin vitroでのコンテナの位置を調整してください。
- in vitroでのコンテナの局在をカバーする1 H T2強調「解剖学」のシーケンスを実行します。軸配向、繰り返し時間（TR）= 2000ミリ秒、エコー時間（TE）= 20ミリ秒、スライス厚= 1ミリメートル、in vitroでのコンテナをカバーする視野と2Dスピンエコーをし、次の設定を使用します。励起あたり16エコー。フィールドシミングが、このステップの間に、プロトン上で行われていることを確認してください。
- 解剖学的画像では、関心領域を中心とした5個の連続スライスを選択します。選択された解剖学的スライスをカバーする13 C分光キャリブレーション取得を規定しています。次の設定を使用します軸配向と2Dブロック-Siegertのキャリブレーション・シーケンスを12×12中心のエンコードされ、TR =千ミリ秒、スライス厚= 5ミリメートル、解剖学的画像、スキャン（NS）= 64、帯域幅の数と一致する視野= 5000ヘルツ、および= 90°FA。
- 13 C分光キャリブレーション・シーケンスを選択してパルスシーケンスライブラリから75（詳細については、シュルテら 2011を参照してください）。クリックして、コンピュータからスキャナにパルスシーケンスをダウンロードし、「ダウンロードしてください。」分光プリスキャンを実行するには、「スペクトルプレスキャン」をクリックします。スペクトルの大きさのプロットでは、CENTEに13 Cのキャリブレーションファントムからのピークを調整スキャナ周波数のR。最大受信機のゲインを設定します。 13 C分光キャリブレーション・シーケンスを実行するために、「スタート」をクリックしてください。報告された送信利得と中心周波数に注意してください。
- 選択された解剖学的スライスをカバーする13 C化学シフトイメージング（CSI）の取得を設定します。次の設定を使用します。軸配向12×12中心のエンコードされ、TR = 400ミリ秒、スライス厚= 5ミリメートル、ビューマッチング解剖画像フィールド、NS = 300、および帯域幅= 5000ヘルツとの2Dエコープラナー分光イメージング（EPSI） 。
注：EPSIサンプル繰り返し1のRF励起後のk空間内の単一の行が同時に空間およびスペクトル情報を取得します。取得技術の詳細については、ダーストらによる記事を参照してください。 2015年76。 - 13 C CSIシーケンスをダウンロードして、分光プリスキャンを実行します。スキャナの周波数を調整し、キャリブレーション・シーケンスで指定されたゲインを送信出力。
- 過分極溶液を回収フラスコ内に堆積された後、注射器に〜3ミリリットルを策定した後、in vitroでのコンテナに接続カテーテルに注入。取得を開始します。買収が完了した後、その後の復興のための生データファイルを保存します。
11.データの再構築
- 取得したデータを分析するために、2つの記載の運動モデルのいずれかを適用します。
- LDH動態を説明するための第一の方法では、運動値（k）は、すべての過分極の分子の信号（M x）から21,77に乳酸塩信号（M LAC）の合計を比較します。
- 他の方法では、時間をかけて乳酸およびピルビン酸信号を測定し、運動モデル17,25,71にこれらをフィット。代謝為替レート、K PA→LAC、かつ効果的に解決するために、乳酸、r個のLACの信号減衰率、乳酸のために得、二部位交換差動モデルを使用して、次の線形微分方程式を使用します。
- LDH動態を説明するための第一の方法では、運動値（k）は、すべての過分極の分子の信号（M x）から21,77に乳酸塩信号（M LAC）の合計を比較します。
注：効果的な乳酸信号減衰率rの LACは乳酸縦緩和時間に依存している（T 1、LAC）、乳酸からピルビン酸K LAC→PA、適用FAとTRとの信号強度と反対代謝の為替レートピルビン酸（M PA）および乳酸（M LAC）、口座に連続する各励起後の不可逆的な信号の減少を取ります： 
したがって、R LACは、信号減衰のシングル、不可分用語になります。 Tを補正することができるのでの結果に基づいて、我々は乳酸からピルビン酸への為替レート（K LAC→PA）が計算に含まれる必要がないことを前提とし、彼は角度と繰り返し時間を反転し、フラックスLAC→PAがあるにもかかわらず、ハリソンら。 2012年78。彼らの結果がk LAC→PAは 1を引き受けるとして重要な役割を果たしていないことを示しています。このモードでは、乳酸のT 1緩和時間を定量化することを可能にします。このモデルは、 インビトロ実験の場合には、重要ではなく、無視することができ、測定にピルビン酸の投与とは無関係です。しかしながら、 インビボでの測定79のための重要な役割を果たしていません。
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Representative Results
「マイクロ波スイープ」の結果は、図3に示されています。これは、[1- 13 C]ピルビン酸サンプルのための最適なマイクロ波の周波数がローカル3.35-Tの超偏極のための94.156 GHzであることを示しています。以下のすべての過分極実験（N = 14）は、100ミリワットの電力で、このマイクロ波周波数を使用して実施しました。マイクロ波照射は、90％より高い固体過分極につながる、60〜80分間適用しました。結果を図4に示されています。過分極[13 C]ピルビン酸塩は、5×10 6（N = 2）、10 個 （N = 2）、2×10 7（N = 1）、3×10 7（N = 2）、4×と混合し10 7（N = 1）、6×10 7（N = 2）、8×10 7（N = 2）、及び10 8（N = 1）、前立腺癌細胞株PC3の。
得られたデータを図5に要約されています図6。スペクトルおよび時間分解能で取得されたデータは、観察された各分子のための唯一の時間分解能（ 図5E-H及び図6E-H）との、そして唯一のスペクトル分解能（ 図5Iで、 図5A-Dおよび図6A-Dに示されています-Lおよび図5I-L）。私たちは173 ppmで、181 ppmで、185 ppmで、約相対で化学シフトで、三つの主要な過分極[1- 13 C]ピルビン酸、[1- 13 C]ピルビン酸水和物を表す信号、および[1- 13 C]乳酸を観察していますpHが7.4、温度20℃でトリメチルシリルプロパン酸（TMSP）へ。 3代謝物との間の信号比を表1にまとめます。データは、乳酸塩信号及びサンプル（ 図7）に存在する細胞の数との間に明確な相関関係を示しています。しかし、結果未満2×10 7細胞を用いた実験から、低い信号対雑音比に可能性の高い重要な偏差を呈します。したがって、我々はさらなる実験のためにこれ以上の細胞を使用することをお勧め。相対乳酸塩信号（運動値）細胞（ 図8）の数によって正規化されると、それは明らかに細胞のすべてにわたって同様の取り込みおよび代謝を示します。しかし、細胞の数が増加してセル当たりの乳酸産生を減少させる傾向があります。我々は減少し、細胞代謝活性の原因の一つは、細胞の非常に高い濃度は、試料の粘度が上昇、その結果、非常に小さな体積であると信じています。二部位交換差分モデルの結果を表2に要約し、 図9に示されています。細胞の数が増加してkの PA→LACを増やす：データは、以前のモデルと同様の傾向をたどります。しかし、このモデルの結果細胞の数と速度の急勾配の増加の。代謝為替レートkの PA→LACは、細胞の数に正規化されたとき、我々は再び細胞（ 図10）の数の増加とともにK PA→LACが減少する明確な傾向を見ることができます。
図11は、実験の空間位置の追加の可能性を示しています。それは次の10モル/ L 13 C-尿素ファントムに80ミリモル/ Lの過分極[1- 13 C]ピルビン酸を注入したファントムを示しています。技術は時間的および特別決議（ 図11A）または時間内に選択された代謝産物信号の信号減衰（ 図11B）のスペクトルの達成を可能にします。時間領域でのスペクトルは、より良好な信号対雑音比（ 図11C）を受信するように加算することができます。特別決議は、所望の周波数領域Oの選択を可能にしますFなど[1- 13 C]ピルビン酸（ 図11D）などの特定の代謝産物に属する13 Cスペクトル、[1- 13 C]ピルビン酸水和物（ 図11E）、または参照13 C-尿素（ 図11F）。これは、1 H画像と同時登録することができます。使用されるパルスシーケンス（EPSI）は、全スライスごとに4.9秒の画像の取得を可能にします。要約すると、この技術は、任意の代謝産物は、空間的、時間的およびスペクトル分解能でデータを提供することができます。
図3：ローカル3.35-T超偏極での[1- 13 C]ピルビン酸マイクロ波スイープの結果。 [1- 13 C]ピルビン酸塩の標的化合物の13 C核の過分極率を最大にする最適なマイクロ波周波数を決定する測定結果。マイクロ波掃引はEPR吸収の形状を有していますスペクトラム。ピークの形状及び分離（この場合、トリチル基）を用いるラジカルに基づいて、及び最大の影響は、固体効果及び熱混合を有します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：[1- 13 C]ピルビン酸サンプルの固体分極のビルドアップ。最大4500秒ごとに300の測定された標準偏差で表される誤差のn = 13、固体分極buildupsの平均。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：細胞の数（5×10 6〜3×10 7細胞）のための13 C NMR分光法の結果。取得したデータは、スペクトルと時間分解能（AD）でプロットし、のみ[1- 13 C]ピルビン酸、[1- 13 C]ピルビン酸水和物、および[1- 13 C]乳酸（EH）のための時間分解能でプロットし、プロットスペクトル分解能を持つだけで、すべての時間ステップ（IL）を合計します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：細胞の数（4×10 7から1×10 8細胞）のための13 C NMR分光法の結果。スペクトルおよび時間分解能でプロット取得したデータ（
図7：シンプルな代謝物比動力学モデリングの結果。データは、[1- 13 C]ピルビン酸、[1- 13 C]ピルビン酸水和物、および中の細胞数対[1- 13 C]乳酸の合計に[1- 13 C]乳酸塩信号の比率を表し実験。誤差は、標準偏差を表します。 Pリースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：細胞の数に単純な代謝産物比動力学モデリングの結果は、正規化されました。データは、[1- 13 C]ピルビン酸、[1- 13 C]ピルビン酸塩水和物、および細胞の数に正規化された乳酸[1- 13 C]の合計に[1- 13 C]乳酸塩信号の比を表します実験における細胞数対。誤差は、標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9：二部位交換差動モデルの結果。データのrepr実験中の細胞数に対する代謝為替レート（K PA→LAC）を ESENT。誤差は、標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図10： 細胞の数に 二部位交換微分モデル 正規化 の結果 。データは実験中の細胞数に対する細胞の数に正規化された代謝の為替レート（K PA→LAC）を表します。誤差は、標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11：過分極[1- 13 C]ピルビン酸プローブの磁気共鳴イメージングの結果 。スライス全体とすべての時間ステップにわたって取得A）のスペクトル。 B）経時[1- 13 C]ピルビン酸および[1- 13 C]ピルビン酸水和物信号の減衰を。第3の信号は、10 M 13 C-尿素ローカライゼーション参照です。 C）全体の空間と時間分解能から得られたスペクトル。 D）1 H画像は、すべての時間ステップにわたって合計された[1- 13 C]ピルビン酸信号の13 C画像を重ね。 E）1 H画像は、すべての時間ステップにわたって合計された[1- 13 C]ピルビン酸水和物信号の13 C画像を重ね。 F）でオーバーレイ1 H画像<SUP>すべての時間ステップ（参照）を介して加算された13 C-尿素信号の13 C画像。 CEにおける13 C-信号は、特定の代謝産物の信号の最大値に正規化されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 細胞の数 | ||||||||
| 5×10 6（N = 2） | 10 7（N = 2） | 2×10 7（N = 1） | 3×10 7（N = 2） | 4×10 7（N = 1） | 6×10 7（N = 2） | 8×10 7（N = 2） | 10 8（N = 1） | |
| [1- 13 C] ピルビン酸塩 | 92.9±1.4 | 91.7±1.0 | 86.7 | 77.5±2.7 | 76 | 69.7±0.5 | 65.9±3.7 | 42.9 |
| [1- 13 C] ピルビン酸塩水和物 | 6.8±1.2 | 6.7±1.6 | 9.5 | 10.1±1.8 | 8.9 | 7.7±1.5 | 10.4±0.2 | 13.4 |
| [1- 13 C] 乳酸塩 | 0.3±0.3 | 1.6±0.6 | 3.8 | 12.4±4.5 | 15.1 | 22.5±1.1 | 23.7±3.5 | 43.7 |
表1：異なる細胞数に対する過分極代謝産物の相対比。
表2：二つのサイトのExchange差動モデルの結果。
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Discussion
過分極プローブと13 CMRSIは、in vitroおよびin vivoでリアルタイムでの代謝をモニターするための有望な方法です。 1つの非常に重要な側面は、この実験的なプロセスを採用した場合は、特にインビトロ実験にについて、適切な標準化です。まず、試料の調製は、各実験において、超偏極物質の同じ濃度を達成するように適切にかつ一貫して行われる必要があります。これは、過分極すべきサンプルとバッファの両方の計量精密を必要とします。濃度が正しくない場合、溶液の最終pHは、T 1及び細胞の応答に影響を与えることができ、正確ではありません。また、できるだけ均一に細胞を処理することが重要です。細胞は常に、細胞が非常に高い濃に保持される時間の長さを最小限にするために、細胞回収およびその後の実験の間に最小の遅延が存在するように調製されるべきですentrationと低容量。このような異なる準備時間や温度などの細胞調製プロトコルの変動は、得られたデータの大幅な変動が生じる可能性があります。細胞とサンプルの混合はまた、標準化されるべきです。これは変化し得るので、細胞懸濁液のトレーサーの添加と測定の開始までの時間を測定することが重要です。データ分析時、これを考慮すべきです。
データ分析や動力学モデリングの正しい選択は、取得したデータの解釈に重要です。単純なモデルは、2つの代謝物の一定の為替レートで線形一方向の反応に適しています。導入部で説明したように、ピルビン酸塩は、より重要なのは、それはまた、ピルビン酸水和物と非酵素的可逆交換反応を受け、複数の酵素反応を受け、。この反応は、実験で重要な役割を果たしており、その効果はよく私が実証されています8×10 7細胞を用いた実験をn個。 表1は、ピルビン酸塩水和物の相対濃度は、他の実験と類似していることを示しているが密接に図6Dに調べたとき、それは他の実験と比較して、実験の開始時に非常に高いピルビン酸塩水和物の信号を示しています。時間分解能が加算されたときしかし、この重要な情報が失われ、データの再構成でエラーが発生しています。それは計算に時間的な分解能を備えているので一方、二部位交換差分モデルは、速度のより頑強で正確な説明です。したがって、それは迅速に測定中にピルビン酸と交換しても、ピルビン酸水和物と非酵素的交換を含みます。
過分極信号を観察したり、過分極分子の代謝を追跡するための間で選択する様々なイメージング戦略がpreclinicaにあります。リットルおよび臨床研究。ダーストら。異なるパルスsequnces 76の利点と欠点を示しました。自由誘導減衰化学シフトイメージング（FIDCSI）配列が比較的強固であるが、マルチスライスし、一時的に分解イメージングのための限定使用されています。エコープラナー分光イメージング（EPSI）は、復興の成果物の傾向がある、勾配の問題とオフ共鳴効果のための堅牢ですが。エコー非対称と最小二乗推定（IDEAL）81、スパイラル化学シフトイメージング（ISPCSI）、パルスシーケンス35、及びスパイラル化学シフトイメージング（SPCSI）と水と脂肪の反復分解が高い符号化効率を有するが、B 0に敏感です不均一性。配列の選択は、スキャナの特性、生物学的問題に依存し、システムが検討されています。
成功した過分極のために満たされる必要がある多くの要件があります。しかし、トンここで過分極13 CMRSI技術は、今日直面しているいくつかの制限もあります。プライマリおよび不変の制限は、測定の特定の時間に利用可能な検出可能なシグナルの量を定義し、分子内に13 C核のT 1緩和時間です。信号は、データ収集中に繰り返し過分極信号の損失を引き起こし、各RF励起によって低下します。別の制限は、分子を過分極するために必要な比較的長い時間です。これは一般的に30〜90分にかかります。
このような[18 F] -FDG PETなどの分子イメージングの他の技術との比較では、過分極13 CMRSIは増加し、解糖代謝経路、したがって、増加したグルコース消費を伴う腫瘍を必要としません。技術は、リアルタイムで実際の代謝フラックスを示しています。一方、[18 F] -FDG PETは、約直接的な情報を与えるものではありません代謝が、代謝的に活性な領域での蓄積についての唯一の間接的な情報。これは、腫瘍が代謝的に不活性であると思われるが、実際には増殖のための炭素源として、そのようなグルタミノリシスなど、さまざまな代謝経路を、使用している偽陰性の結果を引き起こす可能性があります。
結論として、溶解DNPは、82（糖尿病など）の疾患の無制限のリストを研究のpH 15,36,45を測定する、または癌の様々なタイプの代謝の変化を監視するために様々な用途に使用することができます。これらの測定値は、最近のヒト臨床試験57への（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、およびイヌなど）、動物モデルを用いた前臨床研究によって、 インビトロ細胞実験でから、異なるレベルで達成することができます。将来の臨床応用を検出し、病気をローカライズだけでなく、治療の観察を可能性がありますだけでなく、非常に強力かつ非侵襲的な診断ツールを備えていますリアルタイム83で応答。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer | |
| GE/Agilent MR901 | GE Healthcare/Agilent Technologies | 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent | |
| Spinsolve Carbon | Magritek | 1 T NMR spectrometer with permanent magnet | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 7789-20-0 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monbasic | Sigma Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Disodium edetate | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | |
| Pyruvic acid - 13C1 | Cambridge Isotopes Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Dotarem (0.5 mmol/L) | Guerbet | gadoterate meglumine | |
| tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) | GE Healthcare | trityl radical used as a sourse of free electron | |
| PC3 cell line | ATCC | CRL1435 | |
| F-12K medium | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | SCRR-30-2020 | |
| Trypsine-EDTA Solution, 1x | ATCC | 30-2101 | |
| Sample plastic cup | Oxford Instruments | ||
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013-MSDS |
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