Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

hyperpolarized Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/54751
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1,2, 1, 3,4, 1,5,6, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Nuclear Medicine, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Chemistry, Technische Universität München, 3GE Global Research, 4Zentralinstitut für Medizintechnik der Technischen Universität München (IMETUM), Technische Universität München, 5Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, 6IDG Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München
* These authors contributed equally

Abstract

I de siste tiårene har nye metoder for svulst staging, restaging, behandlingsrespons overvåking, og tilbakefall deteksjon av en rekke kreftformer dukket opp i forbindelse med state-of-the-art positronemisjonstomografi med 18 F-fluorodeoxyglucose ([18 F ] -FDG PET). 13 C magnetisk resonansavbildning spektroskopiske (13 CMRSI) er en minimal invasiv avbildningsmetode som muliggjør overvåking av metabolisme in vivo og i sanntid. Som med en hvilken som helst annen metode basert på 13C kjernemagnetisk resonans (NMR), står det utfordringen med lav termisk polarisering og en påfølgende lavt signal-til-støy-forhold på grunn av den relativt lave gyromagnetiske forhold på 13 C og dets lave naturlige overflod i biologiske prøver. Ved å overvinne disse begrensningene, har dynamisk atom polarisering (DNP) med påfølgende prøven oppløsning nylig aktivert brukte NMR og magnetisk resonans imaging (MRI) systemer for å måle, Studere og bilde viktige metabolske veier i ulike biologiske systemer. En spesielt interessant og lovende molekyl som brukes i 13 CMRSI er [1- 13 C] pyruvat, som i de siste ti årene, har vært mye brukt for in vitro, preklinisk, og nå nylig, kliniske studier for å undersøke den cellulære energiomsetningen i kreft og andre sykdommer. I denne artikkelen skissere vi teknikken for oppløsning DNP bruke en 3,35 T preklinisk DNP hyperpolarizer og demonstrere bruken i in vitro studier. En tilsvarende protokoll for hyperpolarization kan brukes for det meste i in vivo studier i tillegg. For å gjøre dette, anvendte vi laktatdehydrogenase (LDH) og katalyserte den metabolske reaksjon av [1- 13C] pyruvat til [1- 13C] laktat i en prostata carcinoma cellelinje, PC3, in vitro ved anvendelse av 13 CMRSI.

Introduction

For tiden er det mest brukte klinisk metode for tumor oppsetning, restaging, behandling respons overvåking, og gjentakelse påvisning av en rekke forskjellige krefttyper er [18F] -FDG PET. 1 Men nylig, flere nye og alternative tilnærminger har dukket opp. En av disse metodene er 13 CMRSI. Denne teknikk innebærer innføring av det 13 C-molekyl i en biologisk prøve, etterfulgt av minimalt invasiv MR for å vurdere metabolisme in vitro eller in vivo i sanntid. Ikke desto mindre, det største utfordringen i 13 CMRSI, sammenlignet med andre metoder som for eksempel [18F] -FDG PET eller computertomografi, er dens lave signal-til-støy-forhold.

NMR-signalet er direkte proporsjonal med graden av polarisering, et forhold av spinn ½ kjerner populasjonsdifferanse i to energitilstander til den totale populasjonen (figur 1A). Polariseringen er et produkt av the gyromagnetiske forhold (γ) av kjernene, og det påførte magnetiske feltstyrken over temperatur. En typisk polarisering av 1 H-kjerner er i størrelsesorden 0,001% til 0,005% etter 3 T, noe som gir en relativt dårlig signal-til-støy-forhold. Dagens state-of-the-art MR har vært en vellykket avbildningsmetode bare på grunn av den høye overflod av en H i biologiske prøver og den høye gyromagnetiske forholdet 1 H (y 1 H = 42,576 MHz / T). Imidlertid observere andre kjerner, slik som karbon, er mer krevende. Den eneste stabile, magnetisk aktivt karbon isotop, 13 C, utgjør bare 1,1% av alle karbonatomer. I tillegg er det gyromagnetiske forholdet mellom 13 C (γ 13C = 10,705 MHz / T) fire ganger lavere enn for en H, som fører til en lavere deteksjonseffektivitet. Oppsummert, den lave 13 C overflod og lav γ 13C forårsake brann 13 C-målinger for å oppnå 0,0176% av følsomheten av en 1H-NMR-måling in vivo.

Dynamisk Nuclear Polarisering

En fremgangsmåte for å overvinne den relativt dårlige følsomhet av 13 C-målinger er DNP. Det ble opprinnelig beskrevet for metaller i 1953 av Albert W. Hauser. I sin artikkel, uttalte han: «Det er vist at dersom elektronspinn resonans av lednings elektroner er mettet, vil kjernen bli polarisert i samme grad de ville være hvis deres gyromagnetiske forholdet var at av elektronspinn." 2 Senere det året, Carver og Slichter eksperimentelt bekreftet Hauser hypotese 3. I 1958 Abragam og Proctor beskrevet denne effekten for elektroner i væsker og kalte det for "solid effekt." Ved temperaturer under 4 K, når elektron-spinn polarisering nesten 100%, og er mer enn tre størrelsesordener høyere enn atom-spinn polarisering (figur 1B) 4. Thans oppstår fordi det gyromagnetiske forholdet mellom elektronet (γ e = 28024,944 MHz / T) er tre størrelsesordener høyere enn de nukleære gyromagnetiske forholdstall. De svake interaksjoner mellom elektroner og kjerner, slik som Overhauser-effekten, det faste stoff effekt, krysseffekten, og den termiske blandeeffekt, tillate overføring av polarisasjonen fra elektron-spinn til kjernespinn ved hjelp av mikrobølgestråling med en frekvens i nærheten av den tilsvarende elektron paramagnetisk resonans (EPR) frekvens 5,6. DNP teorien har blitt videreutviklet for å involvere flere elektroner og termisk blanding. Likevel, til dags dato, ingen enhetlig kvantitativ teoretisk beskrivelse av DNP er publisert 7,8.

Figur 1
Figur 1: Forstå Dynamic Nuclear Polarisering og hyperpolarisering. A) En skjematisk sammenligning av spinn populasjoneni termisk likevekt polarisasjonstilstand og den hyperpolariserte tilstand. B) Den polariseringen er avhengig av temperaturen. Polariseringen av et elektron (e -) når 100% under 1,4 K. DNP tillater overføring av polarisasjonen fra e- til de 13 C-kjernene, noe som øker deres polarisasjon inntil 10 5 fold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Å introdusere DNP i studier av biologiske systemer ved hjelp av 13C, påfølgende rask sample oppløsning måtte utvikles. 50 år etter Hauser hypotese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. løst teknisk utfordrende problemet med å bringe den hyperpolariserte frosne prøve i flytende tilstand med minimalt tap hyperpolarisering 6. Oppløsning DNP åpnet et nytt forskningsfelt som heter 13 pliktige CMR-stofferJeg, som gir en ny metode for å undersøke og karakterisere ulike sykdomstilstander 9,10. Som stabile bærere av et uparet elektron, en trityl- radikal tris (8-karboksy-2,2,6,6-tetra (hydroksyetyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) -metyl-natriumsalt (OX063) eller (2,2,6,6-tetrametylpiperidin-1-yl) oksyl (TEMPO) blir vanligvis anvendt. Disse er blandet med den ønskede 13 C-merket molekyl og utsatt for mikrobølgestråling med en frekvens i nærheten av den tilsvarende EPR frekvens. Ved hjelp av denne teknikken, kan polarisasjonen av 13 C-kjerner økes opp til 37% 11. Dette resulterer i en 10 5-doble polarisasjon forbedring sammenlignet med den termiske likevekt polarisasjonen 11,12. Men så snart som den mikrobølgebestråling er stoppet og / eller den 13 C-molekylet er overført til flytende tilstand, avtar den polarisasjon med den langsgående relaksasjonstid (T 1) av 13C kjernen som ble polarisert. Dermed blirOppfinnelsen av raske oppløsnings teknikker eller eventuelle senere teknikk forkorte tiden før eksperimentell måling (dvs. injeksjon) er avgjørende for biologiske applikasjoner 13.

Det er tre store krav at kandidaten molekylet trenger for å oppfylle for vellykkede 13 CMRSI studier. For det første har 13 C-kjernen av interesse å ha en tilstrekkelig lang T 1 (> 10 s). Valget av det 13 C-etikett er avgjørende. Den beste kandidaten kjerner er karboner med ingen direkte kontakt med 1 H-kjerner via en obligasjon. Det må også bli hurtig metabolisert i løpet av 2 - 3 T 1 ganger, noe som resulterer i en nedstrøms metabolsk produkt med en vesentlig forskjellig kjemisk skift fra den opprinnelige substans. Prøveblandingen må også danne et amorft glass når den er i en fast tilstand, slik at den romlige fordelingen avtar avstanden mellom elektronet og 13 C, slik at det transfer av polarisering. Hvis kandidaten molekylet ikke danner amorft glass naturlig, må det være meget oppløselig i et glassing middel, slik som glycerol eller dimetylsulfoksyd 14. Disse kravene fører til et forholdsvis lite antall kandidatmolekyler. Imidlertid, selv etter en vellykket oppdagelsen av en egnet molekyl, utvikle en arbeidsprotokoll for hyperpolarisering kan være teknisk utfordrende 9,14,15.

I de senere årene har flere substrater vært vellykket polarisert, for eksempel [1- 13C] pyruvat 12,16 - 36, [2- 13C] pyruvat 37, [1- 13C] etyl-pyruvat 38, [1- 13 C ] laktat 39, [1- 13C] fumarat 40-43, 13 C-bikarbonat 36,44,45, [1- 13C] natriumacetat 43,46 - 49, 13C-urea 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutamine 15,52,53, [1- 13C] glutamat 53,54, [1- 13 C] 2-oksoglutarat 55, [1- 13C] alanin, og andre 14,56. En spesielt interessant og som vanligvis brukes substrat for hyperpolarisering er [1- 13C] pyruvat. Den er mye brukt i prekliniske studier for å undersøke den cellulære energiomsetningen i ulike sykdommer 14,17,22. [1- 13C] pyruvat oppfyller alle krav for vellykket hyperpolarisering, blant annet en forholdsvis lang T 1 og rask transport over cellemembranen før senere blir metabolisert. Prekliniske studier med [1- 13 C] pyruvat blir nå oversatt til klinikken 57.

Metabolisme av Pyruvate

Det er vel kjent at det er en direkte sammenheng mellom mutasjoner i en kreftcellenes DNA og endringer i deres metabolske veier. Allerede på 1920-tallet, Otto Warburg discovket at det er en økt metabolisme av glukose og produksjon av laktat i tumorer sammenlignet med friskt vev 58-60. Deretter diverse alter på andre metabolske veier, slik som den pentose-fosfat svei, den trikarboksylsyre syklus, oksidativ fosforylering, og syntese av nukleotider og lipider, er blitt beskrevet.

Pyruvat er sluttproduktet av glykolyse. I tumoren, gjennomgår det anaerob glykolyse katalysert av LDH 61 og reagerer med den reduserte formen av nikotinamidadenindinukleotid koenzym (NADH), som resulterer i laktat og den oksyderte formen av koenzym (NAD +). Alternativt, gjennomgår pyruvat en trans reaksjon med glutamat for å danne alanin, katalysert av alanin transaminase (ALT). Begge reaksjoner er lett reversibel. Pyruvat også gjennomgår dekarboksylering katalysert av pyruvat dehydrogenase (PDH) til karbondioksyd og acetyl-CoA, representing en irreversibel reaksjon på dette trinnet. Alter i disse reaksjonshastigheter kan knyttes til tumor metabolisme 17,21,22,25,62. De metabolske baner er oppsummert i figur 2.

Figur 2
Figur 2: Skisse av større metabolsk reaksjon av pyruvat. Pyruvat / laktat konvertering er katalysert av LDH, og pyruvat / alanin konvertering katalyseres av ALT. Pyruvat er irreversibelt omdannet til acetyl-CoA og CO to av PDH, og CO 2 er i et pH-avhengig likevekt med bikarbonat 80. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Påvisningen av hyperpolariserte [1- 13C] pyruvat og dets metabolitter er tidligere blitt påvist i rotte hanart 37,63 - 65, lever 66, muskler og nyrer 62,67. En studie viste signifikante forskjeller i laktat-til-alanine forholdet mellom normal og fastet rottelever 66 og demonstrert en svært forhøyet og hyperpolarized [1- 13 C] laktatnivå i leveren kreft 68,69. Det er dokumentert at svulsten klasse kan identifiseres i en transgen adenokarsinom i mus prostata (TRAMP) med hyperpolarized [1- 13 C] pyruvat 22, med Hyperpolariserte laktatnivåer som viser en høy korrelasjon med histologisk grad av skåret svulster. Den alanine katalysert fra pyruvat ved ALT har også blitt foreslått som en nyttig markør i rotteleverkreft 23.

Måling av pyruvat-laktat metabolsk fluks har blitt brukt for å overvåke iskemi 63,65,70 og som en respons på behandling med cytotoksisk kjemoterapi 17,40, målrettede medikamenter <sup> 24,25,41 eller strålebehandling 26 i dyremodeller. Det har også blitt brukt for påvisning av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 reaksjon med glioblastom og brystkreft musemodeller 25. Endringer i pyruvat stoffskiftet i hjernen tumorer 26 og prostatakreft 24,71 er også observert etter behandling.

prostata Carcinoma

Prostata kreft er den dominerende kreft hos eldre menn og den nest største kreft knyttet til død hos menn over hele verden 72. Til dags dato ingen pålitelig, ikke-invasive metoder for tidlig diagnose og karakterisering av prostatakreft 73,74, understreker det akutte behovet for nye metabolske bildeteknikker for å muliggjøre strenge deteksjon og iscenesettelse av pasienter. Prostata carcinoma ble anvendt som en modell for å demonstrere muligheten for oppløsnings DNP kombinert med 13 CMRSI i pasientenss 57. Dette arbeidet ble videreført i en første klinisk studie ansette [1- 13 C] pyruvat og 13 CMRSI for avbildning av prostata kreft, og det har bare nylig har blitt fullført (NCT01229618).

Bakgrunnen for dette arbeidet var å illustrere mer detaljert og for et større publikum anvendelse av 13 CMRSI metoden i en preklinisk omgivelser med celler. Måling av LDH-katalysert metabolisme av [1- 13C] pyruvat til [1- 13C] laktat in vitro i PC3 prostata carcinoma-cellelinjen, viser at det er mulig anvendelse av oppløsnings DNP i in vitro studier, og ta opp de avgjørende skritt og utfordringer under eksperimentene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøve Stock Solution Forberedelse

  1. Legg gadoterate meglumin (GadM, 0,5 mol / l) for å konsentrert [1- 13C] pyrodruesyre til å gi en sluttkonsentrasjon på 1 mmol / l GadM. Legg trityl radikal tris (8-karboksy-2,2,6,6-tetra (hydroksyetyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) - metyl-natriumsalt (OX063) til denne blanding for å gi en sluttkonsentrasjon på 15 mmol / l. Vortex inntil fullstendig oppløsning.
    MERK: Denne stamløsningen preparatet er beregnet for bruk med en 3,35-T preklinisk DNP hyperpolarizer. Når en 7-T klinisk hyperpolarizer blir brukt, blir gadoterate meglumin ikke nødvendig fordi, ved en høyere magnetisk felt, dets fordeler er ubetydelig. Tilsetningen av et gadolinium-baserte kontrastmiddel som øker den oppnåelige faststoff-tilstand polarisering og også polarisering hastighet. Imidlertid, i flytende tilstand, kontrastmidlet forkorter T en relaksasjonstid.

2. Økende Cell Culture

    to vekstområde. Bruk F-12K medium inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og opprettholde cellene ved 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2. Før oppløsningstrinnet, fjernes mediet fra kulturflaske.
    MERK: Hver cellelinje krever en spesiell forberedelse protokoll for celle formering. Rådfør kravene med cellelinjen leverandøren.

3. Utarbeidelse av celler for Experiment

  1. Fjerne cellemediet og vaske cellene med ~ 10 ml fosfat-bufret saltvann (PBS).
  2. Tilsett 5 ml av trypsin til kolben og returnere cellekulturflasker til inkubatoren i 3 til 5 min.
  3. Legge til ~ 5 ml F-12K medium for å deaktivere trypsin.
  4. Tell cellene ved hjelp av en automatisk celleteller. Bland 10 ul av celleløsningen med 10 mL av den fargende oppløsning. Bland godt med pipette og overfør 10 pl av blandingen inn i the kammer av en "telling glass".
  5. Fjerne og telle cellene i kolben (s). Overfør de aktuelle volumene inneholdende det ønskede antall celler (f.eks, 5 x 10 6 opp til 10 8) i plastampuller.
  6. Sentrifuger cellene ved 1200 xg i 5 min og supernatanten kastes.
  7. Re-suspendere cellene i F-12K medium inneholdende 10% FCS til et totalt volum på 800 ul og overføre dem til en reaksjonsbeger (2 ml). Plasser mottrykkslokket inn i en plastampulle fylt med varmt vann.

4. Oppløsning Agent Forberedelse

MERK: oppløsningsmiddel er en væske som brukes til å oppløse den hyperpolariserte prøven. I biologiske anvendelser er oppløsnings vanligvis utføres med H2O-baserte eller deuteriumoksyd (D2O) -baserte buffere slik som PBS eller tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris), inneholdende 1 g / l etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).

  1. forberedelsesjon på 20 mmol / l PBS-buffer
    1. For å fremstille 100 ml av oppløsningsmidlet, oppløse 36 mg av mononatriumfosfat (NaH 2PO 4), 247 mg dinatrium-fosfat (Na 2 HPO 4), og 10 mg av EDTA i en oppløsning av 20 mmol / l natriumhydroksyd ( NaOH) i D 2 O. Bland skikkelig til fullstendig oppløsning.
      MERK: EDTA (1 g / l) ble tilsatt til bufferen for å eliminere mulige ferromagnetiske ioner, noe som kan ødelegge den hyperpolarisering. NaOH for å nøytralisere den pyrodruesyre i et 1: 1 mol-forhold for å oppnå en pH-verdi på 7,4.

5. Variabel temperatur Sett (VTI) Avkjøling

  1. I polarisator program hovedvinduet i DNP-NMR, klikk på "Avkjøling".
    MERK: Dette slår på vakuumpumpen og evakuerer VTI til ca 5,0 mbar. Deretter nåleventilen mellom VTI og den flytende helium reservoaret helt åpnet, slik at flytende helium for å strømme inn i VTI. Strømningshastigheten er regulated av nåleventilen for å opprettholde den optimale mengden av flytende helium i VTI til det når helium koketemperatur. Deretter blir VTI evakueres til nesten fullstendig vakuum, og temperaturen når ca. 1,4 K. VTI er fylt med flytende helium opp til 65%. På dette punktet, er instrumentet klar for prøve innsetting.

6. Prøvepreparering og innsetting

  1. Ved hjelp av en mikropipette tilsettes ~ 8 mL av 13C-merkede prøvelageroppløsning i en plastkopp.
  2. Fest plastkopp til innføringsstanga og sette i gang prøveinnføringsprosessen ved å trykke "Sett sample" i hovedvinduet til programmet. Velg "Normal sample" og klikk "Fortsett".
    NB: I løpet av denne prosessen, først lukker nåleventil for å avbryte strømmen av flytende helium inn i VTI, og trykket i VTI øker deretter. Prøveholderen inne i VTI er hevet fra den flytende helium, innløpsventilenpå toppen av VTI åpnes, og et gassformig helium strømnings innføres fra innløpsventilen for å hindre utvendig forurensning av luften fuktighet.
  3. Når du blir bedt, skyv innføringsstangen med vedlagte plastkopp ned i VTI. Sørge for å komme til prøveholderen ved bunnen av VTI. Ellers kan det gassformige helium presse prøven ut av VTI.
  4. Løsne og fjern innføringsstanga.
  5. Avslutt prosedyren ved å klikke på "Next" i dialogboksen. Prøven innsettingsprosedyren bør ikke ta lenger enn 10 s.
    MERK: Innløpsventilen deretter lukkes, den gassformige heliumstrømmen avbrytes, prøveholderen med prøvekoppen er neddykket i flytende helium, og nåleventilen åpnes for å tillate det flytende helium for å strømme inn i VTI. Etter 5 - 10 min, blir VTI ble avkjølt til under 1,4 K, slik at alle av de frie elektroner for å bli polarisert.
  6. Kontroller at plastkopp med prøven ble innført riktig i VTI ved å sjekke that det ikke er festet til innføringsstanga eller skyves ut fra den VTI av heliumgass. Klikk deretter på "Finish".

7. Mikrobølgeovn Sweep (valgfritt)

MERK: En mikrobølgesveip tillater bestemmelse av den optimale mikrobølgefrekvens for å maksimere den hyperpolarisering frekvensen av de 13 C-kjernene i den ønskede forbindelsen.

  1. For å måle mikrobølgeovn feie, start RINMR programmet, skriv "HYPERSENSENMR," og klikk "Velg Config" og "Do Microsweep."
  2. For å starte prosessen, velger du "kalibrere" -kategorien på hovedprogramvinduet.
  3. Klikk "Generer" og velg begynnelsen og slutten frekvens (f.eks 94,100 GHz-94,200 GHz), frekvenstrinn størrelse (for eksempel 20 MHz), kraften (100 mW), og tiden (60 sek). Klikk "Fortsett", "Enable" og "Start".
    MERK: Med disse innstillingene, den hyperpolarizer første polarizes prøveni 60 s ved hjelp av en mikrobølgefrekvens på 94.100 GHz og en effekt på 100 mW. Deretter, det gjelder en 90 ° radiofrekvens (RF) puls og kjøper hyperpolarized 13C signal ved hjelp av den innebygde spektrometer. Disse trinnene blir gjentatt for hvert trinn i angitte frekvensområdet. For påfølgende hyperpolarisering, velge mikrobølgefrekvens med maksimal signal amplitude målt.

8. Polarisering

  1. For å måle polariseringen oppbygging, starter RINMR programmet, skriv "HYPERSENSENMR," og klikk "Velg Config" og "Solid oppbygging."
  2. I polarisator program hovedvinduet i DNP-NMR, klikk på "Polarisering" for å starte hyperpolarization prosessen.
  3. Velg den optimale mikrobølgefrekvens (innhentet under mikrobølgeovn sweep) og kraft (f.eks, 100 mW) for prøven og klikk "Next".
  4. Aktiver "Polarisering bygge opp overvåking" og klikk "Finish".
  5. Polarisere prøven til> 95% (~ 60 min for [1- 13C] pyruvat).
    MERK: Under polarisering, er mikrobølger føres inn i VTI og til prøven, slik at 13 C spinner å justere med Hyperpolariserte uparede elektronspinn. For å måle den hyperpolarisering oppbygging, er RF-pulser med en flippvinkel (FA) på 5 ° tilføres periodisk (for eksempel hver 300. e), og det resulterende signalet er plottet som en polarisasjons oppbygging kurve.

9. Oppløsning

  1. Når polarisering når> 95%, initiere løsningsprosessen ved å klikke på "Oppløsning" i polarise program hovedvinduet i DNP-NMR.
  2. Velg oppløsningsprosessen fra rullegardinmenyen, og klikk "Next".
    MERK: polarisatoren gjør det mulig å definere den ønskede oppløsningsprosessen, ved å velge tidspunktet for jage gass.
  3. Belastnings ~ 5 ml av oppløsningsmidlet gjennom toppventilen inn i et oppvarmet kar i than oppløsning del av polarisatoren. Beregne det nøyaktige volumet av oppløsningsmidlet er nødvendig ved bruk av følgende ligning:
    ligning 1
    hvor V DA er det ønskede volum av oppløsningsmidlet, m PA, m OX063, og m Gad er masser av pyruvat, OX063 og gadoterate meglumin, respektivt, tilsettes til prøvestamløsning.
  4. Sett oppløsning pinne i den aktive stilling over innløpsventilen.
    MERK: Dette gjør instrumentet til å koble dets oppløsning instrumentering for å prøvekoppen i VTI.
  5. Klikk "Finish" for å starte oppløsningsprosessen.
    MERK: oppløsningsmiddel er trykksatt til 3 bar med heliumgass, og blir deretter varmet opp til 200 ° C, forårsaker en økning i trykket. Når trykket når 10 bar, lukker nåleventil for å avbryte strømmen av flytende helium inn i VTI. Prøveholderen hever koppenfra den flytende helium. Oppløsnings stokk senkes ned i VTI og koblet til prøvekoppen. Det kondisjonerte oppløsningsmiddel er presset av trykket, noe som resulterer fra varme beholder inneholdende oppløsningsbuffer og heliumgass gjennom oppløsningen stokk til koppen, forårsaker en hurtig oppløsning av prøven. Oppløsningen strømmer deretter ut i samlingen kolben via plastrør. Oppløsningen pinne med vedlagte koppen blir så hevet fra VTI.
  6. Flytt oppløsningen pinne med den vedlagte koppen til "rengjøring" posisjon og fullføre prosessen ved å klikke på "Finish".

10. Påvisning av 13C hyperpolarized Signal

  1. 13 C metabolsk magnetisk resonansspektroskopi in vitro
    1. Bland 200 ul av den 20 mmol / l oppløst hyperpolariserte prøve fra samlingen kolbe med 800 mL av celleløsning.
      MERK: Den resulterende sluttkonsentrasjonav [1- 13C] pyruvat er 4 mmol / l.
    2. Bland suspensjonen godt ved hjelp av en mikropipette og overføring ~ 600 pl inn i et 5 mm NMR-rør.
    3. Sett 5 mm NMR-rør inn i en T-NMR-spektrometer. I hovedvinduet i programvaren, klikk på "Kjør" for å starte målingen, søker serie av hundre 10 ° RF-pulser hver 3. s.
      MERK: Mål tiden mellom den initiale blanding av hyperpolariserte prøven med cellene og starten av spektroskopiske anskaffelse. Påse at blandeprosedyren ikke overstiger 30 s for å minimere polarisering tap.
  2. 13 C metabolske magnetic resonance imaging
    1. For å bygge en beholder for in vitro-forsøk ved bruk av MRI-spektrometer, ta en 5 ml sprøyte og koble den til et kateter (d = 1,2 mm) som er lang nok til å nå fra spektrometeret er iso-sentrum til slick området av spektrometer.
    2. Fyll in vitro beholder med the celle oppløsning av ønsket konsentrasjon for forsøket (f.eks, 10 8), eller med en enzymatisk oppløsning.
    3. Plasser en in vitro container ved isomidtpunktet av MR magnet. Plasser en 13 C-avstemt radiofrekvensmottagerspole på beholderen. Plasser en konsentrert 13 C-merket kalibrering fantom (f.eks 10-mol / L 13C-urea) i nærheten.
    4. Sett "in vitro beholder" i nærheten av iso-senteret av NMR-skanneren.
    5. Kjør skannerens standard 3-planet lokalisering sekvens og justeres in vitro beholderens posisjon til iso-senteret, etter behov.
    6. Kjør en 1 H T2-vektet "anatomisk" sekvens dekker in vitro container lokalisering. Bruk følgende innstillinger: 2D spin ekko med aksial orientering, repetisjon tid (TR) = 2000 ms, ekko tid (TE) = 20 ms, skivetykkelse = 1 mm, synsfelt som dekker in vitro container, og16 ekko per eksitasjon. Pass på at feltet shimsingen er gjort på protoner i dette trinnet.
    7. I de anatomiske bilder, velger du 5 sammenhengende skiver sentrert på regionen av interesse. Foreskrive en 13C spektroskopiske kalibrering oppkjøpet dekker de valgte anatomiske skiver. Bruk følgende innstillinger: 2D Block-Siegert kalibreringssekvensen med aksial orientering 12 x 12 risk kodet, TR = 1000 ms, skivetykkelse = 5 mm, synsfelt matchende anatomiske bilder, antall skanninger (NS) = 64, båndbredde = 5000 Hz, og FA = 90 °.
    8. Velg 13C spektroskopiske kalibreringssekvensen (for mer informasjon, se Schulte et al. 2011) 75 fra pulssekvens biblioteket. Last ned pulssekvens til skanneren fra datamaskinen ved å klikke på "Last ned". Klikk på "Spectra Prescan" for å kjøre spektroskopiske Prøve. I spekteret magnitudeplott, justere toppen fra 13 C kalibrering phantom til center av skanneren frekvens. Still mottakeren gevinster til det maksimale. Klikk "Start" for å kjøre 13 C spektroskopiske kalibreringssekvensen. Legg merke til den rapporterte sende gevinst og sentriske frekvens.
    9. Sett en 13C kjemisk skift imaging (CSI) oppkjøpet dekker de valgte anatomiske skiver. Bruk følgende innstillinger: 2D ekko-planar spektroskopiske imaging (EPSI) med aksial orientering 12 x 12 risk kodet, TR = 400 ms, skivetykkelse = 5 mm, synsfelt matchende anatomiske bilder, NS = 300, og båndbredde = 5000 Hz .
      MERK: EPSI prøver én linje i k-space gjentatte ganger etter en RF eksitasjon å skaffe både romlig og spektral informasjon samtidig. For mer informasjon om oppkjøps teknikker, se artikkel av Durst et al. 2015 76.
    10. Last ned 13 C CSI sekvens og kjøre spektroskopiske Prøve. Juster skanneren frekvens og overføre den vinning som er angitt ved kalibreringssekvensenproduksjon.
    11. Etter den hyperpolariserte løsning er deponert i samlingen kolbe, tegne opp ~ 3 mL inn i en sprøyte og deretter injisere den inn i kateteret koplet til den in vitro beholderen. Start oppkjøpet. Etter oppkjøpet er fullført, lagrer rå datafil for påfølgende gjenoppbygging.

11. data Reconstruction

  1. Påfør en av de to som er beskrevet kinetiske modeller for å analysere de innsamlede data.
    1. I den første metoden for å beskrive de LDH-kinetikk, kinetisk verdi (k) sammenligne summen av laktatsignalet (M LAC) til signalet fra alle Hyperpolariserte molekyler (M x) 21,77.
      ligning 2
    2. I den andre fremgangsmåten, måle laktat og pyruvat signaler over tid, og de monteres til en kinetisk modell 17,25,71. For å løse den metabolske valutakursen, k PA → LAC, og den effektivesignal decay rate av laktat, r LAC, kan du bruke følgende lineære differensialligninger ved hjelp av to-site utveksling differensial modell, som gir for laktat:

      ligning 3

Merk: Den effektive laktat signal dempefaktor r LAC er avhengig av laktat langsgående avslapping tid (T 1, LAC), motsatt metabolske valutakursen fra laktat til pyruvat k LAC → PA, anvendt FA og TR, og signalstyrken pyruvat (M PA) og laktat (M LAC), tar hensyn til den irreversible signalreduksjon etter hver suksessiv eksitasjon:

ligning 4

Derfor r LAC resulterer i en enkel, uatskillelig løpetid signal forfall. Siden det er mulig å korrigere for than snu vinkel og repetisjon tid, og selv om det er en forandring LAC → PA, antar vi at kursen fra laktat til pyruvat (k LAC → PA) ikke trenger å tas med i beregningen, basert på resultatene av Harrison et al. 2012 78. Deres resultater viser at k LAC → PA ikke spiller så avgjørende rolle som man ville anta. Denne modusen lar T 1 avslapning tid av laktat som skal kvantifiseres. Denne modellen er uavhengig av pyruvat administrering til måling, som, i tilfelle av in vitro forsøk, er ikke avgjørende og kan neglisjeres. Det gjør imidlertid spille en viktig rolle for in vivo målinger 79.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene av "mikrobølge sweep" er illustrert i figur 3. Den viser at den optimale mikrobølgefrekvens for [1- 13C] pyruvat prøven er ved 94,156 GHz for den lokale 3,35-T hyperpolarizer. Alle påfølgende hyperpolarisering eksperiment (n = 14) ble utført ved anvendelse av denne mikrobølgefrekvens med en effekt på 100 mW. Den mikrobølgebestråling ble påført i 60 til 80 min, noe som fører til en solid-state hyperpolarisering høyere enn 90%. Resultatene er presentert i figur 4. Den hyperpolariserte [13C] pyruvat ble blandet med 5 x 10 6 (n = 2), 10 7 (n = 2), 2 x 10 7 (n = 1), 3 x 10 7 (n = 2), 4 x 10 7 (n = 1), 6 x 10 7 (n = 2), 8 x 10 7 (n = 2), og 10 8 (n = 1) av prostatakreft-cellelinjen PC3.

De resulterende data er oppsummert i figur 5 figur 6. Innsamlede data med spektrale og tidsmessig oppløsning er vist i figur 5A-D og figur 6A-D, med bare en tidsmessig oppløsning for hvert molekyl observert (figur 5E-H og figur 6E-H), og med bare en spektral oppløsning (figur 5I -L og fig 5I-L). Vi har observert tre store Hyperpolariserte signaler som representerer [1- 13C] pyruvat, [1- 13C] pyruvat-hydrat, og [1- 13C] laktat, med kjemiske skift ved 173 ppm, 181 ppm og 185 ppm, tilnærmet relativ til den trimetylsilyl-propansyre (TMSP) ved pH 7,4 og temperatur 20 ° C. Signalforhold mellom de tre metabolitter er oppsummert i tabell 1. Dataene viser en klar sammenheng mellom laktat signal og det antall celler som er tilstede i prøven (figur 7). Men resultatenefra eksperimenter med mindre enn 2 x 10 7 celler utviser betydelig avvik, sannsynligvis på grunn av et lavt signal-til-støy-forhold. Derfor foreslår vi at du bruker flere celler enn dette for videre eksperimenter. Når den relative signal laktat (kinetisk verdi) blir normalisert med antall celler (figur 8), viser dette klart lignende opptak og metabolisme gjennom alle cellene. Men det er en trend med avtagende laktatproduksjon per celle med et økende antall celler. Vi tror at en av årsakene til redusert celle metabolske aktivitet er en meget høy konsentrasjon av celler i et meget lite volum, noe som resulterer i øket viskositet av prøven. Resultatene av to-sete utveksling differensial modell er oppsummert i tabell 2 og vist på figur 9. Dataene følger en trend lik den forrige modellen: økende k PA → LAC med et økende antall celler. Men denne modellen medføres i en brattere økning av kinetikken med antallet celler. Når den metabolske valutakursen k PA → LAC er normalisert til antall celler, kan vi igjen ser en klar trend med synkende k PA → LAC med et økende antall celler (figur 10).

Figur 11 viser muligheten for tilsetning av romlig lokalisering til eksperimentet. Det viser et fantom injisert med 80 mmol / l hyperpolarized [1- 13C] pyruvat ved siden av en 10 mol / l 13 C-urea fantom. Teknikken tillater oppnåelse av et spektrum med tidsmessig og spesiell oppløsning (figur 11A) eller av signalet nedbrytning av de valgte metabolitt-signalene i tid (figur 11B). Spektrene i tidsdomenet også kan summeres for å motta et bedre signal-til-støy-forhold (figur 11C). Den spesielle oppløsning tillater et valg av det ønskede frekvensområdet of 13 C-spektrum som hører til visse metabolitter, for eksempel [1- 13C] pyruvat (figur 11D), [1- 13C] pyruvat-hydrat (figur 11E), eller referanse 13C-urea (figur 11F). Det kan være co-registrert med en H bilde. Den pulssekvens brukes (EPSI) gjør at kjøp av et bilde av hele stykket hver 4,9 s. Oppsummert kan denne teknikken gi data med en romlig, tidsmessig, og spektral oppløsning på en hvilken som helst metabolitt.

Figur 2
Figur 3: Resultater fra en mikrobølgeovn Sweep med [1- 13 C] pyruvat på den lokale 3.35-T Hyperpolarizer. Resultatet av målingene som bestemmer den optimale mikrobølgefrekvens for å maksimere den hyperpolarisering hastighet av 13 C-kjerner i målforbindelsen av [1- 13C] pyruvat. Mikrobølge sveip har en form av en EPR absorpsjonspektrum. Formen og separering av toppene er basert på den radikale som brukes (i dette tilfellet, trityl radikal), og den største innflytelse ha en solid virkning og termisk blanding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 4: Solid State Polarisering det dannes en [1- 13 C] pyruvat Sample. Et gjennomsnitt på n = 13 solid-state polarisering buildups med feil representert ved standardavvik målt hver 300 s for opptil 4500 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 5: Resultater fra C-13 NMR-spektroskopi for antall celler (5 x 10 6 3 x 10 7 celler). De oppkjøpte data plottet med spektral og tidsmessig oppløsning (AD), plottet med tidsmessig oppløsning bare for [1- 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, og [1- 13 C] laktat (EH), og plottet med spektral oppløsning bare summere alle tidssteg (IL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 6: Resultater fra C-13 NMR-spektroskopi for antall celler (4 x 10 7 til 1 x 10 8 celler). De oppkjøpte data plottet med spektral og tidsmessig oppløsning ( 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, og [1- 13 C] laktat (EH), og plottet med spektral oppløsning bare summere alle tidssteg (IL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 7: Resultater fra Simple metabolitt Ratio Kinetic modellering. Dataene representerer forholdet mellom [1- 13C] laktat signal til summen av [1- 13C] pyruvat, [1- 13C] pyruvat-hydrat, og [1- 13C] laktat i forhold til antall celler i eksperimenter. Feilen representerer standardavvik. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 8: Resultater fra Simple metabolitt Ratio Kinetic Modellering Normalisert til antall celler. De data som representerer forholdet mellom [1- 13C] laktat signal til summen av [1- 13C] pyruvat, [1- 13C] pyruvat-hydrat, og [1- 13C] laktat normalisert til antall celler versus antallet celler i eksperimentene. Feilen representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 9: Resultater fra Two-området Veksling Differential Model. Dataene repr ESENT den metabolske kursen (k-PA → LAC) i forhold til antall celler i eksperimentene. Feilen representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 10: Resultater fra Two-området Veksling Differential Modell normalisert til antall celler. Dataene representerer metabolske kursen (k PA → LAC) normalisert til antall celler versus antallet celler i eksperimentene. Feilen representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 11: Resultat av Magnetic Resonance Imaging av hyperpolarized [1- 13 C] pyruvat Probe. A) Spekteret ervervet over hele stykket og alle tidssteg. B) Den nedbrytning av [1- 13C] pyruvat og [1- 13C] pyruvat-hydrat signal over tid. Det tredje signalet er 10 M 13 C-urea lokalisering referanse. C) Spekteret kjøpt fra hele romlig og tidsmessig oppløsning. D) Et 1 H-bilde overlappende med de 13 C-bildet av den summerte [1- 13C] pyruvat-signalet over alle tidstrinn. E) Den 1H bilde kledde med 13C bildet av summerte [1- 13 C] pyruvat hydrat signal over alle tidssteg. F) Den 1H bilde kledde med <sup> 13 C bilde av den summerte 13C-urea-signalet over alle tidstrinn (referanse). Den 13C-signal i CE er normalisert til den maksimale av signalet av den spesifikke metabolitten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Telefonnummer
5 x 10 6 (n = 2) 10 7 (n = 2) 2 x 10 7 (n = 1) 3 x 10 7 (n = 2) 4 x 10 7 (n = 1) 6 x 10 7 (n = 2) 8 x 10 7 (n = 2) 10 8 (n = 1)
[1- 13C]
pyruvat 		92,9 ± 1,4 91,7 ± 1,0 86.7 77,5 ± 2,7 76 69,7 ± 0,5 65,9 ± 3,7 42.9
[1- 13C]
pyruvat hydrat 		6.8 ± 1.2 6.7 ± 1.6 9.5 10,1 ± 1,8 8.9 7,7 ± 1,5 10,4 ± 0,2 13.4
[1- 13C]
laktat 		0.3 ± 0.3 1.6 ± 0.6 3.8 12,4 ± 4,5 15.1 22,5 ± 1,1 23,7 ± 3,5 43.7

Tabell 1: Den relative forholdet av Hyperpolariserte Metabolitter med hensyn til ulikt antall celler.

Telefonnummer 5 x 10 6 (n = 2) 10 7 (n = 2) 2 x 10 7 (n = 1) 3 x 10 7 (n = 1) 4 x 10 7 (n = 1) 6 x 10 7 (n = 2) 8 x 10 7 (n = 2) 10 8 (n = 1) k PA → LAC [* 10 -4] 0,924 ± 0,870 4,984 ± 1,19 15,135 36,289 58,904 112,174 ± 10,491 114,3 ± 37,059 349,234

Tabell 2:Resultatene av de to-site Veksling Differential Model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

13 CMRSI med Hyperpolariserte prober er en lovende metode for å overvåke metabolisme i sann tid in vitro og in vivo. Ett meget viktig aspekt ved anvendelse av denne eksperimentelle fremgangsmåte er den riktige standardisering, spesielt når det gjelder in vitro-eksperimenter. Først må fremstillingen av prøven som skal gjøres riktig og konsekvent å oppnå samme konsentrasjon av hyperpolariserte materiale i hvert eksperiment. Dette krever en nøyaktig veiing av både prøven til å være hyperpolariserte og bufferen. Hvis konsentrasjonen er ikke riktig, er den endelige pH i løsningen ikke er nøyaktig, noe som kan ha en innflytelse på T-en og cellenes respons. Det er også viktig å behandle cellene så jevnt som mulig. Cellene bør alltid være forberedt på en slik måte at det er en minimal forsinkelse mellom celle høsting og den påfølgende eksperiment for å minimalisere varigheten av tids cellene holdes på en meget høy konsentration og lavt volum. Variasjon i cellen forberedelse protokoll, for eksempel en annen forberedelse ganger eller temperaturer kan føre til betydelige variasjoner i de innhentede data. Blandingen av prøven med cellene bør også være standardisert. Det er viktig å måle tiden mellom tilsetninger av sporstoffet til cellesuspensjonen og begynnelsen av målingen, fordi dette kan variere; under dataanalysen, bør dette vurderes.

Riktig valg av dataanalyse og kinetisk modellering er avgjørende i tolkningen av de innsamlede data. Den enkle modellen er egnet for en lineær enveis reaksjon med en konstant kurs på to metabolitter. Som beskrevet i innledningen, gjennomgår pyruvat flere enzymatiske reaksjoner og, enda viktigere, den gjennomgår også en ikke-enzymatisk reversible-utbyttingsreaksjon med pyruvat-hydrat. Denne reaksjonen spilte en avgjørende rolle i forsøkene, og effekten er godt demonstrert in forsøket med 8 × 10 7 celler. Selv Tabell 1 indikerer at pyruvat-hydrat relative konsentrasjonen er lik andre eksperimenter, da nøye undersøkt i figur 6D, viser det en mye høyere pyruvat-hydrat signal ved begynnelsen av forsøket sammenlignet med de andre forsøkene. Men når tidsoppløsningen er summert opp, er dette viktig informasjon går tapt og forårsaker en feil i gjenoppbyggingen av dataene. På den annen side, er de to-sete utveksling differensial modellen en mer robust og nøyaktig beskrivelse av kinetikken fordi den inneholder den tidsmessige oppløsningen i beregningen. Således omfatter den ikke-enzymatiske utveksling med pyruvat-hydrat, selv om det hurtig utveksling med pyruvat under målingen.

Det finnes ulike bilde strategier for å velge mellom for å observere den hyperpolariserte signal eller for å spore metabolismen av en hyperpolariserte molekyl i preclinical og kliniske studier. Durst et al. demonstrerte fordeler og ulemper ved ulike puls sequnces 76. Den induksjons forfall kjemisk skift imaging (FIDCSI) sekvens er relativt robust, men har begrenset bruk for multi-slice og timelig løst bildebehandling. Echo-planar spektroskopiske imaging (EPSI) er robust for graderingsspørsmål og off-resonans effekter, men det er utsatt for gjenoppbygging gjenstander. Den iterative dekomponering av vann og fett med ekko asymmetrisk og minste kvadraters estimering (IDEAL) 81, spiral kjemisk skift imaging (ISPCSI), pulssekvens 35, og spiral kjemisk skift imaging (SPCSI) har høy koding effektivitet, men er følsomme for B 0 inhomogeneity. Valget av sekvensen vil avhenge av skanneren egenskaper, den biologiske spørsmål, og systemet som undersøkes.

Det er mange krav som må være oppfylt for vellykket hyperpolarization. Imidlertid ther er også flere begrensninger som hyperpolarized 13 CMRSI teknikken er i dag overfor. Den primære og uforanderlig begrensning er T en relaksasjonstid for 13 C-kjernen i molekylet, som definerer mengden av påvisbart signal er tilgjengelig på den bestemte måletidspunktet. Signalet blir senket ved hver RF-eksitasjon som fører til et tap av den hyperpolarisering signalet gjentatte ganger i løpet av datainnhenting. En annen begrensning er den forholdsvis lange tidsrom som er nødvendig for å hyperpolarize et molekyl. Dette tar vanligvis 30-90 min.

I forhold til andre teknikker for molekylet avbildning, for eksempel [18F] -FDG PET, betyr hyperpolariserte 13 CMRSI ikke kreve tumorer med økt glykolytiske metabolske veier og dermed økt glukoseforbruk. Teknikken viser en ekte metabolsk fluksen i sanntid. På den annen side, [18F] -FDG PET ikke gir direkte informasjon ommetabolisme, men bare indirekte informasjon om opphopning i metabolsk aktive området. Dette kan forårsake et falskt negativt resultat, hvor tumoren synes å være metabolsk aktiv, men er faktisk anvendelse av forskjellige metabolske veier, som for eksempel glutaminolysis, som karbonkilde for proliferasjon.

Som konklusjon kan oppløsningen DNP benyttes i en rekke anvendelser for å studere et ubegrenset liste av sykdommer (for eksempel diabetes) 82, måle pH 15,36,45, eller en monitor metabolske endringer i ulike typer av kreft. Disse målingene kan utføres på forskjellige nivåer, fra in vitro-celleforsøk, ved prekliniske studier ved hjelp av dyremodeller (for eksempel mus, rotter, kaniner, griser og hunder), til nyere kliniske studier 57. De fremtidige kliniske anvendelser vil inneholde en svært kraftig og ikke-invasiv diagnostisk verktøy som ikke bare kunne oppdage og lokalisere sykdommen, men også tillate observasjon av behandlingenrespons i sanntid 83.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901 GE Healthcare/Agilent Technologies 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon Magritek 1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 7789-20-0
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic Sigma Aldrich 7558-80-7
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 1310-73-2
Disodium edetate Sigma Aldrich 6381-92-6
Pyruvic acid - 13C1 Cambridge Isotopes Laboratories CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L) Guerbet gadoterate meglumine  
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) GE Healthcare trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line ATCC CRL1435
F-12K medium  ATCC 30-2004
Fetal Bovine Serum ATCC SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1x ATCC 30-2101
Sample plastic cup Oxford Instruments
Trypan blue Bio-Rad 145-0013-MSDS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohren, E. M., Turkington, T. G., Coleman, R. E. Clinical applications of PET in oncology. Radiology. 231 (2), 305-332 (2004).
  2. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  3. Carver, T. R., Slichter, C. P. Polarization of Nuclear Spins in Metals. Phys. Rev. 92 (1), 212-213 (1953).
  4. Abragam, A., Proctor, W. G. Spin Temperature. Phys. Rev. 109 (5), 1441-1458 (1958).
  5. Abragam, a, Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Reports Prog. Phys. 41 (3), 395-467 (2001).
  6. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  7. Shimon, D., Hovav, Y., Feintuch, A., Goldfarb, D., Vega, S. Dynamic nuclear polarization in the solid state: a transition between the cross effect and the solid effect. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (16), 5729-5743 (2012).
  8. Serra, S. C., Rosso, A., Tedoldi, F. Electron and nuclear spin dynamics in the thermal mixing model of dynamic nuclear polarization. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (38), 13299-13308 (2012).
  9. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Brindle, K. M. Biomedical applications of hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55 (4), 285-295 (2009).
  10. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Chen, A., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Hyperpolarized 13C metabolic imaging using dissolution dynamic nuclear polarization. J. Magn. Reson. Imaging. 36 (6), 1314-1328 (2012).
  11. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  12. Golman, K., in't Zandt, R., Thaning, M. Real-time metabolic imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (30), 11270-11275 (2006).
  13. Comment, A., Rentsch, J., et al. Producing over 100 ml of highly concentrated hyperpolarized solution by means of dissolution DNP. J. Magn. Reson. 194 (1), 152-155 (2008).
  14. Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magn. Reson. Med. 66 (2), 505-519 (2011).
  15. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magn. Reson. Med. 60 (2), 253-257 (2008).
  16. Chen, A. P., Albers, M. J., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magn. Reson. Med. 58 (6), 1099-1106 (2007).
  17. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
  18. Schroeder, M. A., Swietach, P., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovasc. Res. 86 (1), 82-91 (2010).
  19. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Tropp, J., Pfefferbaum, A., Spielman, D. M., Mayer, D. Cerebral dynamics and metabolism of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate using time-resolved MR spectroscopic imaging. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (13), 1734-1741 (2010).
  20. Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Res. 66 (22), 10855-10860 (2006).
  21. Park, I., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C magnetic resonance metabolic imaging: application to brain tumors. Neuro. Oncol. 12 (2), 133-144 (2010).
  22. Albers, M. J., Bok, R., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Res. 68 (20), 8607-8615 (2008).
  23. Yen, Y. -F., Le Roux, P., et al. T(2) relaxation times of (13)C metabolites in a rat hepatocellular carcinoma model measured in vivo using (13)C-MRS of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 23 (4), 414-423 (2010).
  24. Dafni, H., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopic imaging informs on hypoxia-inducible factor-1 and myc activity downstream of platelet-derived growth factor receptor. Cancer Res. 70 (19), 7400-7410 (2010).
  25. Ward, C. S., Venkatesh, H. S., et al. Noninvasive detection of target modulation following phosphatidylinositol 3-kinase inhibition using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res. 70 (4), 1296-1305 (2010).
  26. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magn. Reson. Med. 65 (2), 557-563 (2011).
  27. Johannesson, H., Macholl, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Dynamic Nuclear Polarization of [1-13C]pyruvic acid at 4.6 tesla. J. Magn. Reson. 197 (2), 167-175 (2009).
  28. Durst, M., Koellisch, U., et al. Bolus tracking for improved metabolic imaging of hyperpolarised compounds. J. Magn. Reson. 243, 40-46 (2014).
  29. Khegai, O., Schulte, R. F., et al. Apparent rate constant mapping using hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 27 (10), 1256-1265 (2014).
  30. Sogaard, L. V., Schilling, F., Janich, M. A., Menzel, M. I., Ardenkjaer-Larsen, J. H. In vivo measurement of apparent diffusion coefficients of hyperpolarized (1)(3)C-labeled metabolites. NMR Biomed. 27 (5), 561-569 (2014).
  31. Aquaro, G. D., Frijia, F., et al. 3D CMR mapping of metabolism by hyperpolarized 13C-pyruvate in ischemia-reperfusion. JACC. Cardiovasc. Imaging. 6 (6), 743-744 (2013).
  32. Menzel, M. I., Farrell, E. V., et al. Multimodal assessment of in vivo metabolism with hyperpolarized [1-13C]MR spectroscopy and 18F-FDG PET imaging in hepatocellular carcinoma tumor-bearing rats. J. Nucl. Med. 54 (7), 1113-1119 (2013).
  33. Schilling, F., Duwel, S., et al. Diffusion of hyperpolarized (13) C-metabolites in tumor cell spheroids using real-time NMR spectroscopy. NMR Biomed. 26 (5), 557-568 (2013).
  34. Schulte, R. F., Sperl, J. I., et al. Saturation-recovery metabolic-exchange rate imaging with hyperpolarized [1-13C] pyruvate using spectral-spatial excitation. Magn. Reson. Med. 69 (5), 1209-1216 (2013).
  35. Wiesinger, F., Weidl, E., et al. IDEAL spiral CSI for dynamic metabolic MR imaging of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Magn. Reson. Med. 68 (1), 8-16 (2012).
  36. Wilson, D. M., Keshari, K. R., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. J. Magn. Reson. 205 (1), 141-147 (2010).
  37. Schroeder, M. A., Atherton, H. J., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  38. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., et al. Metabolic imaging in the anesthetized rat brain using hyperpolarized [1-13C] pyruvate and [1-13C] ethyl pyruvate. Magn. Reson. Med. 63 (5), 1137-1143 (2010).
  39. Chen, A. P., Kurhanewicz, J., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magn. Reson. Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
  40. Witney, T. H., Kettunen, M. I., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-(13)C]pyruvate and. Br. J. Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
  41. Bohndiek, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to a vascular disrupting agent using hyperpolarized (13)C magnetic resonance spectroscopy. Mol. Cancer Ther. 9 (12), 3278-3288 (2010).
  42. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (47), 19801-19806 (2009).
  43. Jensen, P. R., Peitersen, T., et al. Tissue-specific short chain fatty acid metabolism and slow metabolic recovery after ischemia from hyperpolarized NMR in vivo. J. Biol. Chem. 284 (52), 36077-36082 (2009).
  44. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
  45. Scholz, D. J., Janich, M. A., et al. Quantified pH imaging with hyperpolarized 13C-bicarbonate. Magn. Reson. Med. 73 (6), 2274-2282 (2015).
  46. Koellisch, U., Gringeri, C. V., et al. Metabolic imaging of hyperpolarized [1-(13) C]acetate and [1-(13) C]acetylcarnitine - investigation of the influence of dobutamine induced stress. Magn. Reson. Med. 74 (4), 1011-1018 (2015).
  47. Koellisch, U., Laustsen, C., et al. Investigation of metabolic changes in STZ-induced diabetic rats with hyperpolarized [1-13C]acetate. Physiol. Rep. 3 (8), (2015).
  48. Jensen, P. R., Meier, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Duus, J. O., Karlsson, M., Lerche, M. H. Detection of low-populated reaction intermediates with hyperpolarized NMR. Chem. Commun. (34), 5168-5170 (2009).
  49. Koelsch, B. L., Keshari, K. R., Peeters, T. H., Larson, P. E. Z., Wilson, D. M., Kurhanewicz, J. Diffusion MR of hyperpolarized 13C molecules in solution. Analyst. 138 (4), 1011-1014 (2013).
  50. Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10435-10439 (2003).
  51. von Morze, C., Larson, P. E. Z., et al. Imaging of Blood Flow Using Hyperpolarized [(13)C]Urea in Preclinical Cancer Models. J. Magn. Reson. Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
  52. Chiavazza, E., Kubala, E., et al. Earth's magnetic field enabled scalar coupling relaxation of 13C nuclei bound to fast-relaxing quadrupolar 14N in amide groups. J. Magn. Reson. 227, 35-38 (2013).
  53. Jensen, P. R., Karlsson, M., Meier, S., Duus, J., Lerche, M. H. Hyperpolarized amino acids for in vivo assays of transaminase activity. Chem. - A Eur. J. 15 (39), 10010-10012 (2009).
  54. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Detection of tumor glutamate metabolism in vivo using 13C magnetic resonance spectroscopy and hyperpolarized [1-13C]glutamate. Magn. Reson. Med. 66 (1), 18-23 (2011).
  55. Chaumeil, M. M., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized [1-13C] glutamate: a metabolic imaging biomarker of IDH1 mutational status in glioma. Cancer Res. 74 (16), 4247-4257 (2014).
  56. Keshari, K. R., Wilson, D. M. Chemistry and biochemistry of 13C hyperpolarized magnetic resonance using dynamic nuclear polarization. Chem. Soc. Rev. 43 (5), 1627-1659 (2014).
  57. Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Transl. Med. 5 (198), (2013).
  58. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  59. Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. {Ü}ber den Stoffwechsel von Tumoren im K{ö}rper. Klin. Wochenschr. 5 (19), 829-832 (1926).
  60. Barnes, A. B., De Paepe, G., et al. High-Field Dynamic Nuclear Polarization for Solid and Solution. Biological NMR. Appl. Magn. Reson. 34 (3-4), 237-263 (2008).
  61. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Gatter, K. C., Harris, A. L. Pyruvate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase expression in non small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia. 7 (1), 1-6 (2005).
  62. Golman, K., Petersson, J. S. Metabolic Imaging and Other Applications of Hyperpolarized 13C1. Acad. Radiol. 13 (8), 932-942 (2016).
  63. Golman, K., Petersson, J. S., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magn. Reson. Med. 59 (5), 1005-1013 (2008).
  64. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Jeffrey, F. M., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  65. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia NMR detection of hyperpolarized 13CO2 and H13CO3-. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  66. Hu, S., Chen, A. P., et al. In vivo carbon-13 dynamic MRS and MRSI of normal and fasted rat liver with hyperpolarized 13C-pyruvate. Mol. imaging Biol. MIB Off. Publ. Acad. Mol. Imaging. 11 (6), 399-407 (2009).
  67. Kohler, S. J., Yen, Y., et al. In vivo 13 carbon metabolic imaging at 3T with hyperpolarized 13C-1-pyruvate. Magn. Reson. Med. 58 (1), 65-69 (2007).
  68. Hu, S., Lustig, M., et al. 3D compressed sensing for highly accelerated hyperpolarized (13)C MRSI with in vivo applications to transgenic mouse models of cancer. Magn. Reson. Med. 63 (2), 312-321 (2010).
  69. Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
  70. Schroeder, M. A., Cochlin, L. E., Heather, L. C., Clarke, K., Radda, G. K., Tyler, D. J. In vivo assessment of pyruvate dehydrogenase flux in the heart using hyperpolarized carbon-13 magnetic resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (33), 12051-12056 (2008).
  71. Zierhut, M. L., Yen, Y. -F., et al. Kinetic modeling of hyperpolarized 13C1-pyruvate metabolism in normal rats and TRAMP mice. J. Magn. Reson. 202 (1), 85-92 (2010).
  72. Dennis, L. K., Resnick, M. I. Analysis of recent trends in prostate cancer incidence and mortality. Prostate. 42 (4), 247-252 (2000).
  73. Jambor, I., Borra, R., et al. Functional imaging of localized prostate cancer aggressiveness using 11C-acetate PET/CT and 1H-MR spectroscopy. J. Nucl. Med. 51 (11), 1676-1683 (2010).
  74. Presti, J. C. J., Hricak, H., Narayan, P. A., Shinohara, K., White, S., Carroll, P. R. Local staging of prostatic carcinoma: comparison of transrectal sonography and endorectal MR imaging. AJR. Am. J. Roentgenol. 166 (1), 103-108 (1996).
  75. Schulte, R. F., Sacolick, L., et al. Transmit gain calibration for nonproton MR using the Bloch-Siegert shift. NMR Biomed. 24 (9), 1068-1072 (2011).
  76. Durst, M., Koellisch, U., et al. Comparison of acquisition schemes for hyperpolarised (1)(3)C imaging. NMR Biomed. 28 (6), 715-725 (2015).
  77. Janich, M. A., Menzel, M. I., et al. Effects of pyruvate dose on in vivo metabolism and quantification of hyperpolarized (1)(3)C spectra. NMR Biomed. 25 (1), 142-151 (2012).
  78. Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13 C NMR. NMR Biomed. 25 (11), 1286-1294 (2012).
  79. Gómez Damián, P. A., Sperl, J. I., et al. Multisite Kinetic Modeling of (13)C Metabolic MR Using [1-(13)C]Pyruvate. Radiol. Res. Pract. 2014, (2014).
  80. Talbot, J. -N., Gutman, F., et al. PET/CT in patients with hepatocellular carcinoma using [(18)F]fluorocholine: preliminary comparison with [(18)F]FDG PET/CT. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 33 (11), 1285-1289 (2006).
  81. Reeder, S. B., Pineda, A. R., et al. Iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation (IDEAL): application with fast spin-echo imaging. Magn. Reson. Med. 54 (3), 636-644 (2005).
  82. Laustsen, C., Ostergaard, J. A., et al. Assessment of early diabetic renal changes with hyperpolarized [1-(13) C]pyruvate. Diabetes. Metab. Res. Rev. 29 (2), 125-129 (2013).
  83. Serrao, E. M., Brindle, K. M. Potential Clinical Roles for Metabolic Imaging with Hyperpolarized [1-(13)C]Pyruvate. Front. Oncol. 6, 59 (2016).

Tags

Cancer Research hyperpolarization DNP, NMR magnetisk resonans spektroskopi magnetic resonance imaging MRI, LDH pyruvat laktat prostatisk carcinoma
hyperpolarized<sup&gt; 13</sup&gt; C Metabolsk Magnetic Resonance spektroskopi og avbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, … More

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, K. A., Topping, G., Hundshammer, C., Feuerecker, B., Gómez, P. A., Pariani, G., Schilling, F., Glaser, S. J., Schulte, R. F., Menzel, M. I., Schwaiger, M. Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54751, doi:10.3791/54751 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter