This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
الحفاظ على قسم النبات سلامة الضروري لدراسة الهياكل التشريحية مفصلة في الخلوية والأنسجة، أو حتى على مستوى الأعضاء. ومع ذلك، فإن بعض الخلايا النباتية لها جدران الخلايا صلبة، الألياف صعبة وبلورات (أكسالات الكالسيوم، والسليكا، وما إلى ذلك)، ونسبة عالية من المياه التي غالبا ما يعطل سلامة الأنسجة خلال باجتزاء الأنسجة النباتية.
وتحدد هذه الدراسة الأنسجة قطع الهجين طريقة بسيطة باجتزاء. هذا البروتوكول بتعديل أسلوب باجتزاء القائم على البرافين ويحسن سلامة أقسام الأنسجة من النباتات المختلفة. كانت جزءا لا يتجزأ من الأنسجة النباتية في البارافين قبل باجتزاء في ناظم البرد في -16 درجة مئوية. باجتزاء تحت درجة حرارة منخفضة تصلب كتل البارافين، وانخفاض تمزيق والخدش، وتحسين سلامة الأنسجة بشكل كبير. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح إلى الكالسيوم الأنسجة فالاينوبسيس السحلبية-أكسالات الغنية وكذلك الأنسجة المتمردة مثل ORGA الإنجابنانوثانية وأوراق الأرز، والذرة، والقمح. وبالإضافة إلى ذلك، ونوعية عالية من أقسام الأنسجة من الهجين قص يمكن استخدامها في تركيبة مع التهجين في الموقع (ISH) لتوفير أنماط التعبير المكانية للجينات الفائدة. وفي الختام، وهذا البروتوكول هو مفيد بشكل خاص للالأنسجة النباتية المتمردة التي تحتوي على الكريستال عالية أو محتوى السيليكا. تمكن أقسام الأنسجة ذات نوعية جيدة الدراسات البيولوجية المورفولوجية وغيرها.
طريقة باجتزاء القائم على البرافين هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع للدراسات تشريحية. الحفاظ على تشريح الأنسجة سليمة مهم للدراسات المورفولوجية والبيولوجية. تقنية باجتزاء جزءا لا يتجزأ من البارافين هو مفيد لالبارافين التضمين يحتفظ الخلايا والأنسجة التشكل. وبالإضافة إلى ذلك، وكتل البارافين ويمكن تخزين مريح لفترات طويلة من الزمن. ومع ذلك، باجتزاء جزءا لا يتجزأ من البارافين ليست مناسبة للأنسجة النباتات التي تحتوي على بلورات داخل الخلايا. بلورات داخل الخلايا في كثير من الأحيان المسيل للدموع وأشرطة البارافين وسلامة الأنسجة الضرر أثناء باجتزاء.
على عكس باجتزاء البارافين، cryosectioning سريع نسبيا ويمكن الحصول على المقاطع دون تثبيت، والجفاف تسلسلي أو تضمين تسلل المتوسط 1. Cryosections متوافقة مع العديد من التطبيقات مثل المناعية والتهجين في الموقع، والكيمياء النسيجية الانزيم. ميزة أخرى من cryosectioning هيأن هذا الأسلوب لا تذهب من خلال عمليات تمسخ المحتملة مثل ارتفاع درجة الحرارة والعلاجات الكيميائية، والجزيئات الخلوية بحيث يتم الاحتفاظ بشكل جيد داخل أقسام الأنسجة 2. ويفضل Cryosectioning عموما على القائم على البرافين باجتزاء للدراسات في الأنسجة الحيوانية. ومع ذلك، cryosectioning ليس هو الخيار الأول في النباتات لدرجة حرارة التجمد يسبب في بعض الأحيان تكوين بلورات الثلج التي تؤثر على نوعية من قسم السلامة. على الرغم من أن التنظيم الاسموزي مثل حلول السكروز، البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، أو الجلسرين 3 تم الإبلاغ للحد من تكون الجليد الكريستال في ظل ظروف التجميد، وتحسين أقل من المستوى الأمثل.
على التكيف مع بيئات مختلفة، وغالبا ما يكون نباتات مختلفة تطورت متميزة خلايا نسيج نسيج ومصنع لتشكيل الجدران الصلبة المحمولة، والألياف صعبة، وبلورات 4،5. على سبيل المثال، غير قابلة للذوبان بلورات أكسالات الكالسيوم والهيئات السيليكا شائعة إلى حد ما فيمصانع 6. / تم الإبلاغ الهيئات سيليكات بلورات للمساعدة في الحفاظ على بنية النبات، الإنتصاب، والوقاية من الأمراض أو الآفات في نباتات الحبوب 7-9.
بساتين الفاكهة بوعاء وقطع زهرة السحلبية سوق مزدهرة وأنه هو الصناعة المتنامية. فالاينوبسيس أفروديت (العثة السحلية) هو واحد من نباتات الزينة التصدير الأكثر أهمية في تايوان. وقد بذلت جهود كبيرة لفهم التغيرات المورفولوجية والفسيولوجية للعمليات المزهرة في بساتين الفاكهة فالاينوبسيس. وبدأت المسامير الزهور من بساتين الفاكهة فالاينوبسيس من البراعم الإبطية في قاعدة ورقة. بعد فترة من درجة الحرارة المحيطة باردة (ما يقرب من شهر ونصف)، براعم الإبطين تكبير، وكسر السكون، وتبرز من قاعدة ورقة على التطور إلى ارتفاع الأزهار الصغيرة. لفهم الفسيولوجية والخلوية، والعمليات الجزيئية للبدء السنبلة، لا بد من تطوير تقنية التشريحية قوية لvisuaالأنسجة ليز أو علامات في الوقت المناسب. ومع ذلك، فإن وجود بلورات في كل مكان في أنسجة السحلية، لا سيما في البراعم الإبطية، ويجعل العمل التشريحية صعوبة.
نحن هنا سعت إلى تحسين قسم سلامة الأنسجة النباتية المتمردة التي تعتبر حتى الآن تحديا من الناحية التقنية. نحن هنا تظهر تحسن بروتوكول اسمه الهجين قص. وهي طريقة باجتزاء القائم على البرافين التي يتم تنفيذها باستخدام ناظم البرد. تضمين البارافين يحل نسبة عالية من المياه في الأنسجة النباتية. باجتزاء تحت درجة حرارة منخفضة يصلب كتلة البارافين، ويقلل من وضوح الشمس تمزيق المشكلة، ويحسن سلامة الأنسجة بشكل كبير. هذا البروتوكول بشكل كبير على تحسين سلامة الأنسجة للعينات النباتية المتمردة.
الخلايا النباتية والجدران الصلبة المحمولة، والألياف صعبة، البلورات، ونسبة عالية من المياه التي تسبب مشاكل تمزق الأنسجة أثناء باجتزاء الأنسجة النباتية. على الرغم من أن كثيرا ما يستخدم باجتزاء القائم على البرافين لأنسجة النبات، وبلورات الذاتية غالبا ما ممزق الأنسجة النباتية خلال باجتزاء (الشكل 1). ونظرا لنسبة عالية من المياه بطبيعتها داخل الخلايا النباتية، باجتزاء القائم ناظم البرد وغالبا ما يسبب خلايا مكسورة وأقسام الأنسجة متصدع.
في هذه الدراسة، تم تطوير جنبا إلى جنب بروتوكول البارافين التضمين وcryosection اسمه الهجين قص وتم الحصول عليها جيدة أقسام الأنسجة الجودة. هذا البروتوكول يحل المشكلة المرتبطة نسبة عالية من المياه عن طريق إدخال البارافين التضمين، ويقلل من تأثير تمزق لتصلب شمع البارافين تحت درجة حرارة منخفضة خلال باجتزاء (الشكل 3). لذلك، هذا البروتوكول المعدل هو مفيد أكثر من أي التقطيعة القائم على البرافيننينغ أو cryosectioning للحفاظ على سلامة الأنسجة النباتية.
توضح هذه المخطوطة أن طريقة الهجين قص يحافظ على سلامة الأنسجة في العديد من الأنسجة من فالاينوبسيس السحلبية مثل برعم إبطي، والبذور، وPLB، الخ التي تحتوي على مستويات عالية من بلورات (الشكلان 3-4). وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو قابل للمحاصيل الحبوب مثل الأعضاء التناسلية وأوراق الأرز، والذرة، والقمح التي تحتوي على السيليكا عالية (الشكلان 5-6). ويفترض، ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لودي النباتات التي تحتوي على الألياف عالية.
بشكل عام، وتحديد الأنسجة بدقة بالغة الأهمية لالهجين قص. وجدنا أن تثبيتي حامض الفورمالديهايد الكحول الحمضية (FAA) هو أفضل من منهاج العمل للحفاظ على سلامة الأنسجة من بعض الأنسجة المتمردة مثل براعم محوريا، والجذور، وما إلى ذلك، PFA يعمل بشكل أفضل من القوات المسلحة الأنغولية في الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. لذلك يوصى PFA لإصلاحعينة لفي الموقع التهجين (ISH) العمل. تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لتجربة RNA ISH. لذلك، تم إعداد جميع الكواشف لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي عن طريق القضاء على التلوث ريبونوكلياز عن طريق العلاج DEPC. إذا الهجين قص القسم للدراسات تشريحية، التناضح العكسي (RO) المياه العادية وعازلة أو الكواشف المشتقة منها مقبولة.
تقليل حجم العينة وسماكة أقل من 3 مم مفيد للتسلل. وعلاوة على ذلك، وزيادة الوقت الغمر للجفاف وتسلل ضرورية لأنسجة الملمس الصعبة. الحد من هذا البروتوكول قد يرجع ذلك إلى المشاكل الناجمة عن عدم كفاية التثبيت، والجفاف، وتسلل من العينة. لذلك، وتعديل الوقت لتجهيز كل خطوة أمر بالغ الأهمية لإنتاج كتلة البارافين نوعية جيدة. عادة، الأنسجة أصعب تحتاج وقتا أطول معالجة من الأنسجة ليونة.
وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت لنا أن الهجين قص عملت بنجاح في تركيبة وايISH التاسع لتوفير التوزيع المكاني للنصوص مختارة (الشكل 7). باختصار، هذا البروتوكول هو مفيد لدراسة علم تشريح النبات ويوفر خريطة الحمض النووي الريبي الأنسجة محددة للجينات منتقاة. بالإضافة إلى ذلك فإنه يمكن تطبيقها على الدراسات الجزيئية الأخرى مثل محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز dUTP نيك نهاية الوسم (النفق) مقايسة، مضان في الموقع التهجين (FISH)، والتقنيات المناعية. في الختام، هذا المحسن بروتوكول باجتزاء الأنسجة على حد سواء مفيدة ومفيدة للباحثين في المجتمعات النباتية.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |