Abstract
Behoud installatiesectie integriteit essentieel voor het bestuderen gedetailleerde anatomische structuren op cellulair, weefsel, of orgaan niveau. Echter, sommige plantencellen hebben starre celwanden, taai vezels en kristallen (calciumoxalaat, silica, etc.), en een hoog watergehalte dat vaak verstoren weefselintegriteit in plantenweefsel snijden.
Deze studie stelt een eenvoudige-Hybrid Cut weefsel snijden methode. Dit protocol wijzigt een paraffine gebaseerde snijden techniek en verbetert de integriteit van weefselsecties uit verschillende planten. Plantaardige weefsels werden ingebed in paraffine voor het snijden in een cryostaat bij -16 ° C. Snijden onder lage temperatuur verstokte paraffineblokken, verminderd scheuren en krassen, en verbeterde integriteit weefsel aanzienlijk. Dit protocol werd met succes toegepast op calciumoxalaat-rijke orchidee Phalaenopsis weefsels evenals recalcitrant weefsels zoals reproductieve organs en bladeren van rijst, maïs en tarwe. Bovendien kan de kwaliteit van de weefselsecties van hybride-Cut worden gebruikt in combinatie met in situ hybridisatie (ISH) ruimtelijke expressiepatronen van genen van belang. Kortom: dit protocol is vooral handig voor recalcitrante plantenweefsel met een hoog kristal of silica inhoud. Goede kwaliteit weefselcoupes in staat morfologische en andere biologische studies.
Introduction
De paraffine gebaseerde snijden methode is een veel gebruikte techniek voor anatomische studies. Behoud van intact weefsel anatomie is belangrijk voor de morfologische en biologische studies. De in paraffine ingebedde coupes techniek is voordelig omdat paraffine-inbedding behoudt cel en weefsel morfologie. Bovendien kunnen paraffineblokken gemakkelijk worden opgeslagen voor langere tijd. Echter, in paraffine ingebedde coupes is niet geschikt voor plantenweefsels die intracellulaire kristallen. Kristallen in de cellen scheuren vaak paraffine linten en integriteit weefselschade tijdens het snijden.
In tegenstelling tot paraffine snijden, cryosectioning is relatief snel en secties kunnen worden verkregen zonder fixatie, seriële uitdroging of inbeddingmedium infiltratie 1. Cryosecties kunnen op tal van toepassingen zoals immunohistochemie, in situ hybridisatie en enzym histochemie. Het andere voordeel van cryosectioning isdat deze methode niet verder door middel van een mogelijke denaturatie processen, zoals hoge temperatuur en chemische behandelingen, zijn zo cellulaire moleculen goed bewaard gebleven in het weefsel secties 2. Cryosectioning het algemeen de voorkeur boven paraffine coupes basis voor studies in dierlijke weefsels. Echter, cryosectioning is niet de eerste keus in planten, omdat vriestemperatuur soms veroorzaakt vorming van ijskristallen die de kwaliteit van de afdeling integriteit aantasten. Hoewel osmoregulatie zoals sucrose oplossingen, polyethyleenglycol (PEG) of glycerol 3 is melding kristal ijsvorming te verminderen onder vorst, is de verbetering niet optimaal.
Aan te passen aan verschillende omgevingen, verschillende planten hebben vaak verschillende weefsel textuur en plantencellen zijn geëvolueerd tot starre celwanden, taai vezels, en kristallen 4,5 te vormen. Bijvoorbeeld, onoplosbare calciumoxalaatkristallen en silica lichamen zijn vrij algemeen in6 planten. Silicaat lichamen / kristallen zijn gemeld te helpen handhaven fabriek architectuur, oprechtheid, en ziekte of plaag te voorkomen dat in graangewassen 7-9.
De ingemaakte orchideeën en cut-bloemorchidee markt floreert en het is een groeiende industrie. Phalaenopsis Aphrodite (motten orchis) is een van de belangrijkste export sierplanten in Taiwan. Aanzienlijke inspanningen zijn gedaan om de morfologische en fysiologische veranderingen van de bloei processen Phalaenopsis begrijpen. Bloemen pieken van Phalaenopsis orchideeën zijn geïnitieerd vanuit oksel knoppen op het blad basis. Na een periode van koele omgevingstemperatuur (ongeveer anderhalve maand), okselknoppen vergroten, breken latentie en uitsteken van de bladbasis ontwikkelen tot jonge bloemen spikes. De fysiologische, cellulaire en moleculaire processen van spike initiatie begrijpen, is het essentieel om een sterke anatomische techniek ontwikkelen VisuaLize weefsels of markers in een tijdige wijze. De aanwezigheid van kristallen in alomtegenwoordige orchidee weefsels, met name in okselknoppen, maakt anatomische werk moeilijk.
Hier zochten we naar paragraaf integriteit van recalcitrant plantenweefsels die tot nu toe als technisch uitdagende beschouwd hebben te verbeteren. Hier laten we een verbeterde protocol genaamd Hybrid-Cut. Het is een paraffine gebaseerde snijden methode die wordt uitgevoerd met behulp van een cryostaat. Inbedden in paraffine lost hoog watergehalte in plantenweefsel. Snijden onder lage temperatuur verhardt het paraffine blok, vermindert crystal scheuren probleem, en verbetert de integriteit van het weefsel aanzienlijk. Dit protocol aanzienlijk verbetert weefsel integriteit voor recalcitrante planten monsters.
Protocol
1. Fixatie and Embedding
- reagens voorbereiding
- 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Voeg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 en 2,4 g KH 2 PO 4 in 800 ml dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O) en breng de pH op 7,4 met HCl. Voeg DDH 2 O tot een totaal volume van 1 L, voeg 1.000 III diethylpyrocarbonaat (DEPC) en schud krachtig. WINKEL PBS overnacht bij kamertemperatuur en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min werd de volgende dag.
- 1x PBS
- Verdun de voorraad 10x PBS bij 1:10 verhouding in DDH 2 O tot een eindconcentratie van 0,01 M Na2 verkrijgen HPO 4, 0,002 M KH 2PO 4, 0,003 M KCl en 0,13 M NaCl.
- Paraformaldehyde (PFA) fixeermiddel
Let op: Paraformaldehyde is giftig. Bereid onder een zuurkast. Draag handschoenen.- Tot 250 ml PFA fixeermiddel bereiden Verhit 100ml 1x PBS tot 70-80 ° C en voeg 1750 ul NaOH. Voeg vervolgens 10 g paraformaldehyde en meng totdat het is opgelost. Plaats de oplossing op ijs en daarna op pH 7,2 met H 2 SO 4 (260-270 gl 100 ml) na koeling.
- Stel het volume op 250 ml met 1x PBS, voeg 625 ul glutaaraldehyd tot een eindconcentratie van 0,25%. Voeg 250 pl Triton X-100 en 250 ul Tween 20 om de infiltratie van het fixeermiddel te vergemakkelijken.
OPMERKING: De PFA fixeermiddel kan één maand worden bewaard bij 4 ° C zonder verlies van fixatie vermogen.
- Bereid verschillende concentraties ethanol (30%, 50%, 70%, 85% en 95%) met DEPC behandeld water.
- 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Plant monstername
- okselknoppen
- Gebruik volwassen planten orchidee Phalaenopsis op de vier-bladstadium. Verwijder de bladeren voorzichtig door het scheuren van het blad na de hoofdnerf met behulp van handen.
- Gebruik een scherp scalpel te Carefully okselknoppen verwijderen van de basis van de derde of vierde blad op de monopodiaal steel.
- zaad monster
- Oogst rijpe orchidee zaaddozen na 4 maanden na bestuiving. Snijd zaaddozen in de lengterichting met een scalpel. Schud de opening zaadpeul voorzichtig en laat de droge zaden op filterpapier.
- protocorm
- Zaai volwassen orchidee zaden op een 1 / 2x Murashige en Skoog agar plaat, en te groeien in een weefselkweek kamer in een 12 uur licht periode en constante temperatuur van 25 ° C. Proef groene protocorm op 7 weken na het zaaien.
- Protocorm-achtige lichamen (PLB)
- Groeien orchidee PLB op T2 regenereren agarplaten zoals eerder 10 beschreven plaats en onder dezelfde groeiomstandigheden als in stap 1.2.3.1. Verzamel 10 PLB op een hoogte van 5-8 mm.
- Leaf monster
- Verzamel blad weefsel van een volwassen orchidee Phalaenopsis planten zoals beschreven in stap1.2.1.1.
- Gebruik een scherp scalpel om een klein stukje van het blad weefsel (7 mm lengte x 5 mm breedte) gesneden uit de tweede nieuw ontwikkelde blad.
- Root monster
- Met behulp van dezelfde plant in de stap 1.2.1.1 beschreven, ontleden 1 cm lengte van de wortel tip weefsel met een scherp scalpel.
- jonge spike
- Gebruik een scherp scalpel aan jonge spike weefsel gesneden uit het uiteinde deel van de bloemsteel 10 cm in lengte.
- Bloemknop
- Accijnzen een kleine bloemknop van 5 mm in diameter van orchidee bloemsteel. Snijd een deel van de bloemknop weefsel lengterichting (3 mm dik).
- Leaf weefsels en aartjes weefsels van graangewassen
- Snijd 1 cm lengte bladschijf weefsel uit de eerste nieuw ontwikkelde bladeren van planten van rijst, tarwe en maïs.
- Verzamel 10 aartjes uit planten (rijst, tarwe en maïs) een dag voor de bloei.
- okselknoppen
- bevestiging
- Fix plantmonsters onmiddellijk door ze in een glazen scintillatieflesje met 15 ml ijskoude PFA fixeermiddel.
- Breng een vacuüm (~ 720 mm Hg) te planten monsters in een 4 ° C koele kamer. Houd het vacuüm gedurende 15 - 20 min (kleine bellen worden vrijgesteld van de monsters). Herhaal deze stap totdat het merendeel van de weefsels zinken na de vrijgave van vacuüm. Houd het vacuüm 's nachts en laat het vacuüm langzaam de volgende dag.
- uitdroging
LET OP: Gebruik dezelfde flacon uit de fixatie door de infiltratie stappen. Giet of een pipet de oplossing in de vorige stap af te voeren en te vervangen door 15 ml nieuwe oplossing in de flacon. Afhankelijk van de structuur van weefsels behandelen hardere weefsels zoals orchidee okselknop, zaad, protocorm en PLB en de aartjes van rijst, tarwe en maïs gedurende een langere tijd; behandel zachtere weefsels zoals orchidee bloemknop, jonge spike, blad en wortel, en het blad van rijst, tarwe en maïs voor een kortere tijd.- Dehydrateer monsters in 15 ml ethanol serie bij kamertemperatuur als volgt: 30% ethanol gedurende 30 min, 50% ethanol gedurende 30 min, 70% ethanol gedurende 1 uur, 85% ethanol gedurende 54 min voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels 95% ethanol gedurende 54 min voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels en 100% ethanol tweemaal gedurende 54 min voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels.
OPMERKING: plantmonsters kan enkele maanden worden opgeslagen in 70% ethanol bij 4 ° C.
- Dehydrateer monsters in 15 ml ethanol serie bij kamertemperatuur als volgt: 30% ethanol gedurende 30 min, 50% ethanol gedurende 30 min, 70% ethanol gedurende 1 uur, 85% ethanol gedurende 54 min voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels 95% ethanol gedurende 54 min voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels en 100% ethanol tweemaal gedurende 54 min voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels.
- Infiltreren monsters met 15 ml ethanol en xyleen vervangende mengsel gedurende 54 minuten elk voor hardere weefsels en 30 min voor zachtere weefsels bij kamertemperatuur als volgt: ethanol / xyleen pas (2: 1, v / v) ethanol / xyleen pas (1 : 1, v / v) ethanol / xyleen pas (1: 2, v / v) en pure xyleen vervangende tweemaal. Voorzichtig: Xyleen is giftig. Doe dit stap in de zuurkast. Infiltreren monster in het flesje met 15 ml xyleen vervanging en paraffine mengsel in een oven bij 60 ° C overnacht voor hardere weefsels, en 60 minuten voor zachtere weefsels als volgt: xyleen substituut / paraffine (2: 1, v / v), xyleen vervangende / paraffine (1: 1, v / v) en xyleen vervangende / paraffine (1: 2, v / v).
- Infiltreren monster met 15 ml zuivere paraffine tweemaal per dag en incubeer bij 60 ° C in een oven.
- Herhaal stap 1.5.3 de volgende dag.
- Schakel de stroom van het weefsel inbedding centrum 1 uur van tevoren om de was in de paraffine reservoir smelten voordat inbedding weefsels in een paraffine blok.
- Warm de metalen mallen (grootte van base 3,3 cm lengte x 2 cm breed) op de opwarmlade bij 62 ° C en giet ongeveer 13 ml gesmolten was in de vormbasis.
- Transfer één weefselmonster uit paragraaf 1.5.4 in de vorm met warm pincet en houd deze in de gewenste positie.
- Beweeg de malop de koele plaat voorzichtig, en laat tot de was is gestold.
2. Tissue-Sectie
- Paraffine snijden methode
- Wordt wax basis door het plaatsen van een cassette inbedding bovenop een mal (hetzelfde formaat in de sectie 1.6.2), vullen met gesmolten was en verwijder de matrijs nadat de was is gestold.
LET OP: De inbedding cassette zal een wax basis om het monster paraffine blok verankeren vormen. - Snijd de paraffine blok in een geschikte vorm en grootte, en plaats enkele wax stukken op een vlakke spatel. Verhit de wax stukjes met behulp van een alcohol brander tot de was smelt en plaats dan de gesmolten was op de wax basis in paragraaf 2.1.1 om het blok te houden. Klem in de microtoom.
- Plaats een nieuw blad op de microtoom, en stel de hoek tot 5 graden ten opzichte van het snijden in de microtoom te vergemakkelijken.
- Snijd het monster paraffine blok in dunne plakjes (10 micrometer), zoals eerder 11 beschreven. </ Ol>
- Wordt wax basis door het plaatsen van een cassette inbedding bovenop een mal (hetzelfde formaat in de sectie 1.6.2), vullen met gesmolten was en verwijder de matrijs nadat de was is gestold.
- -Hybrid Cut snijden methode
- Snij het preparaat paraffineblok uit stap 1.6.4 op een kolom met een trapezium oppervlak boven een geschikte grootte met een scheermesje.
- Voeg wat optimale snijtemperatuur verbinding (OCT) naar het midden van de cryostaat fase. Bevestig het paraffineblok de cryostaat stadium en dan snel oriënteren het weefsel blok in de gewenste positie.
- Breng de paraffine blok / podium om een cryostaat kamer. Laat oktober stollen op quick freeze bar bij -42 ° C gedurende 10 minuten. Mis het blok niet bewegen tijdens het stollen van oktober (figuur 2C).
- Laat de cryostaat adapter en kamertemperatuur afkoelen tot -20 ° C respectievelijk en -16 ° C alvorens het paraffineblok / stadium de cryostaat adapter. Gedeelte weefsel 10 urn dik.
- Pick weefsel secties met een pincet. Float de hoofdstukken over 800 ul-DEPC behandeld water in een Poly - L - lysine coated glijbaan en breng de objectglaasjes op een hete plaat bij 42 ° C.
- Laat de secties plat op DEPC-behandeld water bij 42 ° C. Gebruik papieren filter het water af te voeren vanaf de rand.
- Mount weefsel op de dia door het plaatsen van de dia op een 42 ° C hete plaat 's nachts.
3. Tissue kleuring
- deparaffinisatie
- Verzamel de dia's uit de hete plaat en leg ze in een kleuring rack. Voeg 150 ml xyleen in een kleuring pot in zuurkast en dompel de rek in xyleen gedurende 5 minuten.
- rehydratatie
- Bereid verschillende concentraties ethanol oplossing (100%, 95%, 70%, 50% en 30%) in DEPC-behandeld water en vul 150 ml oplossing in afzonderlijke kleurbakjes respectievelijk.
- Hydrateren de monsters door een afnemende reeks ethanolconcentratie, elke stap gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Overdracht van de dia's in de kleuring rack ene potje naar een andere pot met dVerschillende onderdelen ethanolconcentraties: 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol en 30% ethanol.
- Na rehydratatie, dompel de modellen in DDH 2 O 3 min.
- hematoxyline kleuring
- Stain weefselmonsters door onderdompeling weefsel dia's in hematoxyline oplossing voor 1,5 min.
- Spoel kort in DDH 2 O met 1-2 druppels 12 N zoutzuur (HCl) voor een paar seconden, en vervolgens kort wassen in DDH 2 O.
- uitdroging
- Dehydrateer de monsters door een reeks van toenemende concentraties ethanol gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur: 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol. Schakel de exemplaren met xyleen in de zuurkast gedurende 5 minuten.
- Montage
- Drop adequaat 600 ul-xyleen op basis van montage medium op dia. plaats een dekglaasje boven het monster voorzichtig. Vermijd luchtbellen vormen van goede kwaliteit beelden te krijgen.
- Laat de dia's drogen 's nachts de lucht. Observeer het monster onder een microscoop de volgende dag.
Noot: Beelden werden gevangen bij 25X tot 400X vergroting afhankelijk van de grootte van specimens.
4. In situ hybridisatie
- probe synthese
- Clone Phalaenopsis aphrodite actine-gen specifieke coderende sequentie met behulp van de primers 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'en 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (tot 242 bp PCR amplicon te komen) en CyclinB1; 1-gen specifieke coderende sequentie met behulp van de primers 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 ' en 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(327 bp PCR amplicon) te activeren als beschreven 12.
- Ligeren specifieke coderende sequenties in vectoren (bijvoorbeeld pGEMT) volgens het protocol van de fabrikant.
- Genereren digoxigenine (DIG) gemerkte sense en antisense probes gebruikt SP6 / T7 DIG RNA labeling kit volgens instructies van de fabrikants.
- In situ hybridisatie
- Snijd de 2 e en 3 e oksel bud weefsel plakjes (10 urn dikte) gegenereerd met behulp van de Hybrid-Cut methode en plakken monteren op gecoate dia.
- Deparaffinize weefselsecties in xyleen (zie 3.1.1), hydrateren afnemende concentraties ethanol (zie 3.2.2) en verteren met 2 mg / ml proteinase K bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeren in situ hybridisatie volgens het protocol eerder beschreven 11,13 met enkele wijzigingen, dat wil zeggen, hybridisatie gedurende actine als 59 ° C en 60 ° C gedurende CyclinB1;. 1 Hybridiseren dia met 40 ng DIG-gemerkte RNA-probe.
- Met / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) oplossing nitroblauwtetrazolium hybridisatie signalen detecteren 11 beschreven.
Representative Results
Hybride-Cut verbetert de integriteit van Tissue Secties
Voor de anatomie van de reproductieve bloemenstructuur belangrijk voor het onderzoeken van het onderliggende mechanisme van de bloem initiatie orchideeën. Echter, de accumulatie van intracellulair calcium oxalaat kristallen Phalaenopsis maakt dergelijke studies een uitdagende taak. Om de problemen in verband met tearing veroorzaakt door kristallen tijdens het snijden (figuur 1) te omzeilen, ontwikkelden we een systeem dat we met de naam Hybrid-Cut. Dit protocol combineert traditionele paraffine inbedding en cryosectie technieken. We hebben eerst getest-Hybrid Cut in oksel knoppen van de orchidee Phalaenopsis, omdat ze zijn berucht voor het weefsel stijfheid en een hoge kristal content. Oksel bud weefsel werd gefixeerd in 4% PFA (zie Protocol, stap 1.3). Na seriële ethanol uitdroging en paraffine infiltration, de oksel kiem werd ingebed in een blok paraffine. Het blok werd bijgesneden tot een geschikte grootte voor snijden (Figuur 2A). Een kleine hoeveelheid oktober werd vervolgens aangebracht op het midden van de cryostaat fase (figuur 2B). De paraffine blok werd vervolgens gehecht aan het podium via oktober Het podium werd geïncubeerd in een cryostaat tot 10 minuten om volledige stolling van oktober gewacht voordat snijden (figuur 2C) en vervolgens werd cryosectie uitgevoerd in een -16 ° C kamer (figuur 2D).
Ter vergelijking werd een paraffine blok met een oksel knop van Phalaenopsis orchidee onderworpen aan reguliere microtoom snijden. Zoals getoond in figuur 1A, werd ernstig scheuren van de paraffine linten waargenomen na microtoom snijden. De weefselintegriteit en cellulaire structuur werd aangetast (figuur 1B). Hybride-Cut, anderzijds,geproduceerd intact weefselcoupes (Figuur 3A) met geconserveerde structurele integriteit (Figuur 3B).
Toepassing van de Hybrid-Cut naar verschillende weefsels van P. Afrodite
Om de ontvankelijkheid van de Hybrid-Cut verder te testen, testten we de verschillende weefsels van Phalaenopsis orchideeën. Het is vaak moeilijk om delen van zaden met goede weefselintegriteit vanwege de geharde zaadvliezen verkrijgen. Met behulp van dit protocol, werden gedetailleerde structuren van zaden behouden na snijden (Figuur 4A). Zoals getoond in figuur 4A, eiwitlichamen, kan de gezamenlijke opslag producten 14, duidelijk herkenbaar. Hybride-Cut werkte ook met succes en toonde de gedetailleerde structuren van de shoot topmeristeem van de één maand oude protocorm (de ontkiemde structuur uit een zaadje) (figuur 4B) enprotocorm-like-lichamen (PLB, Figuur 4C). De intracellulaire kristallen werden waargenomen in delen van PLB. Phalaenopsis orchideeën hebben dikke en sappige bladeren en ze presteren Crassulacean zuur metabolisme (CAM) -type fotosynthese 15. De dwarsdoorsnede van het blad blad toonde grote bladmoes cellen en vaatbundels met xyleem en floeem (figuur 4D). Stomatale paar openingen werden waargenomen op de abaxiale bladoppervlak overdag (figuur 4D). In feite, CAM planten zich ontwikkeld tot koolstof winst te maximaliseren, maar tegelijkertijd minimaliseren waterverlies door de huidmondjes te openen in de nacht onder droge omstandigheden 15,16. De wortel topmeristeem van P. aphrodite wordt getoond in figuur 4E. De wortelpunt cellen bleek een groot aantal kristallen, die zeer goed bewaard zijn gebleven na snijden (figuur 4E) bevatten. Longitudinale secties van de jonge bloemen spikes voorzien information over de architectuur van de jonge bloemen primordials (Figuur 4F). Bovendien, kelkbladeren, bloemblaadjes, labellum en pollinia kon duidelijk worden geïdentificeerd van de langsdoorsnede van de jonge bloemknoppen dat differentiatie in deze 5 mm bloemknop (figuur 4G) hebben afgerond. Merk op dat kristallen werden verzameld in de kelk van de jonge bloemen knoppen. Kortom, dit protocol werkt consequent aan de integriteit van het weefsel te onderhouden en produceert intact morfologie waarmee anatomische en mogelijke cellulaire studies.
Hybride-Cut Behoudt Tissue Integriteit in graangewassen
We hebben ook getest-Hybrid bezuinigen op graan gewassen zoals rijst, tarwe en maïs die hoge gehalte aan siliciumdioxide 17,18 bevatten. Zoals getoond in Figuur 5, werd het weefsel integriteit van dwarsdoorsneden van rijst, tarwe, maïs en bladeren aanzienlijk verbeterd door Hybrui-Cut methode. Xylem, floëem, bladmoes cellen, huidmondjes en bulliform cellen die zeggenschap rollen van het blad om waterverlies te voorkomen duidelijk geïdentificeerd uit delen van rijst bladeren. De Kranz anatomie, bladmoes cellen en vaatbundels van de maïs blad 19,20 werd duidelijk geïdentificeerd. Het is intrigerend om een hoge dichtheid van huidmondjes vindt zowel de adaxiale en abaxiale zijde maïs bladeren (figuur 5). De verhouding van adaxial en abaxiale huidmondjes van 0,7 in maïs is eerder 21 vermeld. Bovendien, dit protocol ook gewerkt met succes de gedetailleerde celmorfologie van aartjes rijst, tarwe en maïs (figuur 6) verschaffen. Aartjes bekend overvloedige silica 9 bevatten. Normaal, dat moeilijkheden veroorzaakt bij het uitvoeren van weefsel coupes.
In situ hybridisatie
In situ hybridisatie (ISH) ontwikkeld genexpressie patronen lokaliseren weefselniveau 11, 22-25. Bovendien kan ISH cellulaire verschaffen, en in sommige gevallen subcellulaire, resolutie van mRNA distributie in meercellige organismen 26. Tijdens ISH, RNA en integriteit weefsel is essentieel voor betrouwbare ruimtelijke informatie over het geselecteerde transcript te verkrijgen. We testten ISH met behulp van de Hybrid-Cut protocol actine-gen (PATC157348) werd gekloond met behulp van de primers 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'en 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' tot 242 bp PCR amplicon Cycline B1 krijgen:.. 1 (PATC146999) genspecifieke coderende sequentie onder gebruikmaking van primers 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'En 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' 327 bp PCR amplicon krijgen. Na ISH, actine en cycline B1: 1 genexpressie werd gevolgd bij jonge en volwassen okselknoppen (Figuur 7). Beide genen werden uitgedrukt in meristematic cellen van 2 e en 3 e okselknoppen, met sterkere signalen gedetecteerd in 3e oksel knoppen. Deze resultaten toonden aan dat Hybrid-Cut behouden van goed anatomie en zorgen voor ruimtelijke genexpressie patroon.
Figuur 1: Traditionele paraffinecoupe veroorzaakt ernstige scheuren van Tissue Een paraffine blok met een oksel knop van Phalaenopsis orchidee werd onderworpen aan reguliere microtoom snijden.. Ernstige scheuren van de paraffine linten waargenomen na traditionele microtoom snijden (A) (B). De pijlen geven de ernstige scheuren van het weefsel slice. Arrowhead toont het kristal lichamen. Schaal bar 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Hybrid-Cut Sectioning Methode Een oksel bud weefsel werd gefixeerd in PFA en weefsels waren uitgedroogd, geïnfiltreerd met paraffine, en ingebed in een blok paraffine. Het paraffine blok werd bijgesneden om de maat (A). Optimale snijtemperatuur verbinding (OCT) werd aangebracht op het midden van de cryostaat fase (B). De paraffine blok is op de cryostaat podium verbonden aan de LGO. Onder lage temperatuur, de paraffine blok werd gehecht aan de cryostaat stadium via oktober (C). Weefselcoupes werden doorgesneden in de cryostaatkamer bij -16 ° C (D). Schaal bars vertegenwoordigt 0,5 cm (A), en 1 cm (BD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Hybrid-Cut verbetert afdeling Integriteit Een paraffine blok met een oksel knop van Phalaenopsis orchidee werd onderworpen aan Hybrid-Cut snijden (A) en de Hybrid-Cut methode geproduceerd secties met uitstekende weefsel integriteit (B).. De pijlpunt toont de endogene kristal organen ingebed in de oksel kiem weefsel. Schaal bar 100 micrometer.rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Toepassing van Hybrid Cut Various Tissue Secties van Phalaenopsis orchidee Verschillende orchidee. weefsels werden coupes met de hybride-Snijmethode, zoals langsdoorsnede orchideeën zaad tijdens het volwassen stadium (A), langsdoorsnede van protocorm (B), langsdoorsnede protocorm-achtige lichamen (PLB) (C), dwarsdoorsnede van bladschijf (D) langsdoorsnede root (E) langsdoorsnede jonge bloemsteel (F) en langsdoorsnede van jonge bloemknoppen (G). Weefsel secties werden gekleurd met hematoxyline. SC, zaadhuid; PB, eiwit lichaam; M,meristeem; MP, moeder PLB; DP, dochter PLB; Ad, adaxial bladoppervlak; Ab, abaxiale bladoppervlak; St, huidmondjes; MC, bladmoes cel; VB, vasculaire bundel; RC, wortel cap; fb, bloemknop; Se, kelkblad; Pe, bloemblaadje; La, lip; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, eelt. Pijlpunten tonen kristallen. Schaal bars vertegenwoordigen 20 pm (AE) en 200 micrometer (FG). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Hybrid-Cut Behoudt bladweefsel Integriteit in Verschillende graangewassen Vergelijking van het blad weefsel met behulp van de traditionele paraffine methode (linker paneel) en de Hybrid-Cut techniek ontwikkeld in dit onderzoek (rechter paneel). Blad beelden tonen dwarsdoorsneden van rijst, tarwe en maïs. MC, bladmoes cel; Ph, floëem; St, huidmondjes; BC, bu lliform cel. Pijlen geven de scheuren van slice weefsel. Pijlpunten tonen silica organen. De blauwe gestippelde cirkels geven Kranz anatomie in C4 maïs. Schaal bars 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Hybrid-Cut Behoudt Spikelet Tissue Integriteit in Verschillende graangewassen Vergelijking van weefsel integriteit van spikelet secties tussen de traditionele paraffine en Hybrid-Cut methoden. Pijlen geven de scheuren van slice weefsel. Pijlpunten geven silica organen. Schaal bars 20 pm (rijst), en 200 pm (tarwe en maïs). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: In Situ Hybridisatie van actine en CyclinB1; 1 Expressie Patronen in het Axillaire Bud van de orchidee Phalaenopsis Tissue plakken van de 2 e okselknoppen en 3 e oksel bud werden bereid met behulp van de Hybrid-Cut methode.. Een totaal van 40 ng actine en CyclinB1; 1-dig gelabelde probe werden gebruikt voor hybridisatie. De sense probe werd gebruikt als een negatieve controle. Pijlen geven de reproductieve meristeem van oksel bud. Schaal bars 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Plantencellen hebben starre celwanden, taaie vezels, kristallen, en een hoog watergehalte dat weefsel scheuren problemen tijdens plantenweefsel snijden veroorzaken. Hoewel paraffine gebaseerde snijden vaak wordt gebruikt voor plantenweefsels de endogene kristallen verscheuren vaak plantenweefsel tijdens het snijden (figuur 1). Vanwege de inherent hoog watergehalte in de plantencellen, cryostaat-gebaseerde snijden veroorzaakt vaak gebroken cellen en gebarsten weefselcoupes.
In de huidige studie, een gecombineerde paraffine-inbedding en cryosectie protocol genaamd Hybrid-Cut werd ontwikkeld en van goede kwaliteit weefsel secties werden verkregen. Dit protocol lost het probleem in verband met hoog watergehalte door invoering inbedden in paraffine en vermindert het scheuren effect door harding paraffine bij lage temperatuur tijdens het snijden (figuur 3). Daarom is deze gewijzigde protocol is voordelig ten opzichte van ofwel paraffine gebaseerde sectioning of cryosectioning voor het behoud van de integriteit van plantenweefsel.
Dit manuscript blijkt dat het hybride-Snijmethode behoudt weefselintegriteit in vele weefsels van orchidee Phalaenopsis zoals okselknop, zaad, en PLB, etc. die hoge kristallen (figuren 3-4) bevatten. Bovendien is dit protocol is ontvankelijk voor graangewassen zoals voortplantingsorganen en bladeren van rijst, maïs en tarwe die silica (figuren 5-6) bevatten. Vermoedelijk kan dit protocol worden gehanteerd voor installaties met een hoog vezel houtachtige.
In het algemeen, de vaststelling weefsel grondig is zeer belangrijk voor hybride-Cut. We vonden dat formaldehyde-alcohol-zuur zuur (FAA) fixatief is beter dan PFA aan het weefsel integriteit van een aantal recalcitrante weefsels te behouden, zoals axiaal knoppen, wortels, etc. Echter, PFA werkt beter dan FAA in het behoud van de RNA-integriteit. Daarom PFA wordt aanbevolen om vast te stellenmonster voor in situ hybridisatie (ISH) werk. De hier beschreven protocol is ontworpen voor RNA ISH experiment. Daarom werden alle reagentia bereid RNA afbraak door het elimineren RNase besmetting met DEPC behandeling te vermijden. Als Hybrid-Cut sectie is voor anatomische studies, regelmatige omgekeerde osmose (RO) water en daarvan afgeleide buffer of reagentia zijn aanvaardbaar.
Vermindering van specimen grootte en dikte tot minder dan 3 mm is nuttig voor infiltratie. Bovendien toenemende onderdompelingstijd voor dehydratatie en infiltratie nodig voor harde textuur weefsels. Beperking van dit protocol kunnen als gevolg van problemen veroorzaakt door onvoldoende fixatie, dehydratatie en infiltratie van specimen. Daarom aanpassing verwerkingstijd voor elke stap is kritisch voor goede kwaliteit paraffineblok produceren. Normaal gesproken moet harder weefsel langere verwerkingstijd dan zachtere weefsel.
Daarnaast hebben we laten zien dat de Hybrid-Cut werkte met succes in combinatie with ISH ruimtelijke verdeling van de geselecteerde transcripten (figuur 7) te verschaffen. Kortom, dit protocol is bruikbaar voor de studie van plantenanatomie en levert een weefselspecifieke RNA kaart van de geselecteerde genen. Bovendien kan het worden toegepast op andere moleculaire studies zoals terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) test, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en immunokleuring technieken. Tot slot, deze verbeterde weefsel snijden protocol is zowel nuttig en handig voor onderzoekers in plantengemeenschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
| Microtome model RM2255 | Leica | ||
| Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
| Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
| RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
| Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
| Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
| Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
| Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
| Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
| SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
| FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
| Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
| Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
| pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
- Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
- Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
- Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
- Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
- Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
- Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
- Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
- Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
- Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
- Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
- Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
- Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
- Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
- Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
- Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
- Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
- Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
- Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
- Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
- Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
- Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
- Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).
