Abstract
Bitki bölüm bütünlüğünü korumak hücre, doku, hatta Organ düzeyde detaylı anatomik yapıları incelemek için esastır. Ancak, bazı bitki hücreleri sert hücre duvarlarını, sert lifler ve kristaller var (kalsiyum oksalat, silika, vb) ve yüksek su içeriği genellikle bitki doku kesit sırasında doku bütünlüğünü bozmaya söyledi.
Bu çalışma, basit bir Hibrid-Cut doku kesit yöntemi kurar. Bu protokol, parafin esaslı kesit tekniği değiştirir ve farklı bitki doku kesitleriyle bütünlüğünü arttırır. Bitkisel dokular -16 ° C'de kriyostat içinde kesit önce parafine gömüldü. parafin blokları, azaltılmış yırtılma ve çizilmeye ve önemli ölçüde geliştirilmiş doku bütünlüğü düşük sıcaklık altında sertleştirilmiş Kesit. Bu protokol başarıyla gibi üreme Orga gibi kalsiyum oksalat bakımından zengin Phalaenopsis orkide dokuların yanı sıra inatçı dokulara uygulananNS, pirinç, mısır ve buğday yaprak. Buna ek olarak, hibrid-Cut doku bölümleri yüksek kalitede ilgili genlerin mekansal ekspresyonu sağlamak için in situ hibridizasyon (ISH) ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, yüksek bir kristal ya da silika içeriği içeren dirençli bitki dokusu için özellikle yararlıdır. Kaliteli doku bölümleri morfolojik ve diğer biyolojik çalışmalar etkinleştirin.
Introduction
parafin esaslı kesit Bu metod, anatomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. sağlam doku anatomisine korunması morfolojik ve biyolojik çalışmalar için önemlidir. parafin-gömme hücre ve doku morfolojisi korur çünkü parafine gömülü kesit tekniği avantajlıdır. Buna ek olarak, parafın bloklar uzun süreler boyunca uygun bir şekilde muhafaza edilebilir. Bununla birlikte, parafine gömülü kesit hücre içi kristalleri içeren bitki dokuları için uygun değildir. hücrelerin içinde Kristaller genellikle kesit sırasında parafin kurdeleler ve hasar doku bütünlüğünün gözyaşı.
Parafin kesit aksine, krio-bölümleme nispeten hızlı ve bölümler fiksasyon, seri dehidrasyon veya orta infiltrasyon 1 gömmeden elde edilebilir. Donuk kesitler bir çok örneğin immünohistokimya gibi uygulamalar, in-situ hibridizasyon ve enzim histokimya ile uyumludur. cryosectioning diğer avantajıBu yöntem, yüksek sıcaklık ve kimyasal tedaviler olarak potansiyel bir denatürasyon süreçleri yoluyla gitmez o kadar hücresel moleküller de doku kesitlerinde 2 içinde korunur. Cryosectioning genellikle parafin esaslı hayvan dokularında çalışmalar için kesit tercih edilir. sıcaklığı donma bazen bölüm bütünlüğünün kalitesini etkileyen buz kristallerinin oluşumuna yol açar Ancak, krio-bölümleme bitkilerde ilk seçenek değildir. Ozmoregülasyon sükroz çözeltiler, polietilen glikol (PEG), ya da gliserol 3 arasındaki dondurma koşulları altında, kristal buz oluşumunu azaltmak için rapor edilmiştir, ancak bir gelişme uygun daha azdır.
Farklı ortamlara uyum, farklı bitkiler genellikle farklı doku doku ve bitki hücreleri sert hücre duvarlarını, sert lifler ve kristaller 4,5 oluşturmak üzere gelişmiştir var. Örneğin, çözünmeyen kalsiyum oksalat kristalleri ve silika organları oldukça yaygındırBitkiler 6. Silikat kurum / kristaller bitki mimarisini, dürüstlük korumaya yardımcı ve tahıl bitkileri 7-9 hastalık veya haşere önlemek için rapor edilmiştir.
Saksı orkide ve kesme çiçek orkide pazar yayıldığını ve büyüyen bir endüstridir. Phalaenopsis aphrodite (güve orkide) Tayvan en önemli ihracat süs bitkileri biridir. Önemli çabalar Phalaenopsis orkide çiçekli süreçlerinin morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri anlamak için yapılmıştır. Phalaenopsis orkide çiçek sivri yaprak dibinde aksiller tomurcuklarından başlatılır. Serin ortam sıcaklığı bir süre sonra (yaklaşık bir buçuk ay), aksiller tomurcuklar büyütmek, dormansi kırmak ve genç çiçek sivri haline yaprak tabanından çıkıntı. fizyolojik, hücresel ve başak inisiyasyon moleküler süreçleri anlamak için, visua sağlam bir anatomik tekniğini geliştirmeye esastırzamanında Lize doku ya da işaretleri. Ancak, orkide dokularda yerde kristallerin varlığı, özellikle koltuk altı tomurcukları, anatomik çalışma zorlaştırır.
Burada şimdiye kadar teknik açıdan zor olarak kabul edilmiştir inatçı bitki dokularının bölüm bütünlüğünü geliştirmek için çalıştı. Burada Hibrid-Cut adlı gelişmiş bir protokol göstermektedir. Bir kriyostat kullanarak gerçekleştirilen bir parafin esaslı kesit bir yöntemdir. Parafin gömme bitki dokusunda yüksek su içeriği giderir. parafin blok düşük sıcaklık altında sertleşir Kesit sorunu yırtılma kristal azaltır ve önemli ölçüde doku bütünlüğünü artırır. Bu protokol ölçüde inatçı bitki örnekleri için doku bütünlüğünü geliştirir.
Protocol
1. Sabitleme ve katıştırma
- reaktif hazırlama
- 10x Fosfat tamponlu tuz (PBS)
- 80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 gr 2 Na HPO 4 ve 2.4 gr KH 2 PO 4 800 ml çift distile su (GKD 2 O) ekleyin ve HCl ile pH 7.4 ayarlayın. 1 L 'lik bir toplam hacme O GKD 2 ekleyin, sonra 1000 ul dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyin ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Mağaza PBS gece boyunca 20 dakika sonraki gün boyunca 121 ° C'de, oda sıcaklığı ve otoklavda.
- 1X PBS
- , HPO 4, 0.01 M Na 2 bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere GKD 2 O 1:10 oranında 0.002 M KH 2 PO 4, 0.003 M KCI ve 0.13 M NaCI hazır ve 10X PBS ile seyreltilir.
- Paraformaldehid (PFA) fiksatif
Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. Davlumbaz altında hazırlayın. Eldiven giy.- 250 ml PFA fiksatif hazırlamak için, 100 ısıtmakmi 1 x 70 PBS - 80 ° C ve NaOH 1.750 ul ekle. Daha sonra paraformaldehit 10 g ekleyin ve çözülene kadar iyice karıştırın. Buz üzerinde solüsyonu yerleştirilir ve daha sonra H2 ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın SO 4 - soğutulduktan sonra, (260, 100 ml 270 ul).
- , 1 x PBS ile 250 ml hacim ayarlama% 0.25 nihai konsantrasyona 625 ul glutaraldehit ekleyin. Fiksatif süzülmesini kolaylaştırmak için 250 ul, Triton X-100 ve 250 ul Tween 20 ekleyin.
Not: PFA sabitleyici olarak sabitleme yeteneğini kaybetmeden bir ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- DEPC ile muamele edilmiş su ile etanol içerisinde farklı konsantrasyonlarda (% 30,% 50,% 70,% 85 ve% 95) hazırlayın.
- 10x Fosfat tamponlu tuz (PBS)
- Bitki numune toplama
- aksiller tomurcukları
- Dört yaprak aşamasında olgun Orkide orkide bitkileri kullanın. Dikkatle ellerini kullanarak yaprak orta damarı aşağıdaki yaprak yırtarak yaprakları kaldırmak.
- Dikkatli için keskin bir neşter kullanabilirsinizully Monopodial sap üzerinde üçüncü ya da dördüncü yaprağın tabanından koltuk altı tomurcukları kaldırın.
- Tohum örneği
- tozlaşma sonra 4 ayda olgun orkide tohum kabukları hasat. bir neşter ile uzunlamasına tohum kabukları kesin. nazikçe açılış tohum pod sallamak ve filtre kağıdı üzerinde kuru tohumları bırakın.
- Protocorm
- Bir 1/2 x Murashige ve Skoog agar plakası olgun orkide tohumları ekmek ve doku kültürü, 12 saat aydınlık döneminde odası ve 25 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta büyür. Ekimden sonra 7 hafta yeşil protocorm tadına bakın.
- Protocorm benzeri cisimler (PLB'ler)
- Adım 1.2.3.1 aynı büyüme koşulları altında, daha önce 10 ve yer tarif edildiği gibi T2 agar yenileyici üzerinde orkide PLB'ler büyütün. 8 mm - 5 yükseklikte 10 PLB'ler toplayın.
- yaprak örnek
- Aşamasında tarif edildiği gibi olgun Orkide Orkide alınan yaprak dokusu, toplamak1.2.1.1.
- İkinci Yeni geliştirilen yapraktan yaprak dokusu (7 mm uzunluk x 5 mm genişlik) küçük bir parça kesmek için keskin bir neşter kullanın.
- kök örnek
- Adım 1.2.1.1 açıklanan aynı bitki kullanılarak, keskin bir neşter kullanılarak kök ucu dokusunun 1 cm uzunluğunda teşrih.
- genç başak
- uzunluğu 10 cm sapı çiçek uç kısmından genç başak doku kesmek için keskin bir neşter kullanın.
- Çiçek tomurcuğu
- orkide çiçek sapı çapı 5 mm küçük bir çiçek tomurcuğu tüketim. çiçek tomurcuğu dokusundan uzunlamasına (kalınlık 3 mm) bir bölümünü kesin.
- Yaprak dokuları ve tahılların başakçık dokular
- pirinç, buğday, mısır bitkileri ilk yeni geliştirilmiş yapraklardan 1 cm uzunluğunda yaprak ayası doku kesilir.
- bitkilerden 10 Spikelets (pirinç, buğday ve mısır) anthesis'e bir gün önce toplayın.
- aksiller tomurcukları
- tespit
- 15 ml buz gibi soğuk PFA fiksatif içeren bir cam sintilasyon şişesi içine transfer hemen bitki örneklerini düzeltildi.
- 4 ° C soğuk bir odada bitki örneklerinin bir vakum (~ 720 mm Hg) uygulayın. 15 vakum tutun - 20 dakika (küçük kabarcıklar örneklerinden serbest bırakılmalıdır). dokuların en vakum yayımlanmasından sonra lavaboya kadar bu adımı yineleyin. Gecede vakum tutun ve ertesi gün yavaş yavaş vakumu boşaltmak.
- kurutma
NOT: sızma adımlarında sabitleme aynı flakon kullanın. Dökün ya da bir önceki adımda çözüm boşaltın ve şişenin içine yeni çözüm 15 ml ile değiştirmek için bir pipet kullanın. dokuların doku bağlı olarak, örneğin daha uzun bir süre orkide aksiller tomurcuk, tohum, protocorm ve PLB ve pirinç, buğday tane sayısı ve mısır gibi sert dokular tedavi; Böyle bir kısa süre orkide çiçek tomurcuğu, genç başak, yaprak ve kök ve pirinç, buğday yaprak ve mısır gibi yumuşak dokuların tedavisi.- aşağıdaki gibi, oda sıcaklığında 15 mi etanol seri örnekleri kurutmak:% 30 etanol, 30 dakika,% 50 etanol 30 dakikada,% 70 etanol için 1 saat süre ile, daha sert dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika boyunca% 85 etanol, sert dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika ve daha dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika boyunca iki kez% 100 etanol için% 95 etanol.
Not: bitki örnekleri, birkaç ay boyunca 4 ° C 'de% 70 etanol içinde saklanır.
- aşağıdaki gibi, oda sıcaklığında 15 mi etanol seri örnekleri kurutmak:% 30 etanol, 30 dakika,% 50 etanol 30 dakikada,% 70 etanol için 1 saat süre ile, daha sert dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika boyunca% 85 etanol, sert dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika ve daha dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika boyunca iki kez% 100 etanol için% 95 etanol.
- aşağıdaki şekilde oda sıcaklığında, sert dokular için 54 dakika her biri ve yumuşak dokular için 30 dakika boyunca 15 ml etanol ve iksilen yerine karışımı ile örnekleri Infiltrate: etanol / ksilen yerine (2: 1, hac / hac), etanol / ksilen yerine (1 : 1, h / h) etanol / iksilen yerine (1: 2, h / h), ve iki kez de saf ksilen yerine. Dikkat: Ksilen zehirlidir. Davlumbaz bu adımı yapın. gece boyunca sert dokular için, 60 ° C'de bir fırın içinde 15 mi iksilen yerine parafin karışımı ile şişe içinde örnek sızmakta ve yumuşak dokular için 60 dakika boyunca, aşağıdaki gibidir: ksilen yerine / parafin (2: 1, hac / hac), iksilen yerine / parafin (1: 1, h / h) ve ksilen yerine / parafin (1: 2, hac / hac).
- günde iki kez 15 mi saf parafin ile örnek sızarak bir fırın içinde, 60 ° C'de inkübe edin.
- Adımı tekrarlayın ertesi gün 1.5.3.
- parafin blok dokuların gömmeden önce parafin haznesindeki mum eritmek için önceden doku gömme merkezi 1 saat gücü açın.
- 62 ° C'de ısınma tepsi üzerinde metal kalıpları (taban 3.3 cm uzunluk x 2 cm genişliğinde boyutunu) Isınma ve kalıp tabanına yaklaşık 13 ml erimiş mum dökün.
- ısındı forseps ile kalıbın içine bölüm 1.5.4 itibaren bir doku örneği aktarın ve istenilen pozisyona yönlendirmek.
- kalıp taşıbalmumu katılaşmış kadar dikkatlice serin plaka üzerine, ve bırakın.
2. Doku Kesit
- Parafin kesit yöntemi
- (Bölüm 1.6.2 de aynı boyutta) bir kalıp üstünde bir gömme kasetin koyarak bir mum üs yapmak erimiş balmumu ile doldurun ve balmumu katılaşmış sonra kalıp çıkarmak.
NOT: gömme kaset örnek parafin blok demirlemek bir mum tabanı oluşturacaktır. - Uygun şekil ve büyüklükte içine parafin blok Trim ve düz bir spatula bazı mum parçaları yerleştirin. balmumu erir kadar alkol yazıcı kullanarak balmumu parçaları ısıtın ve daha sonra blok uymak için Bölüm 2.1.1 balmumu bazında erimiş mum yerleştirin. mikrotom onu kelepçe.
- mikrotom üzerine yeni bir bıçak yerleştirin ve mikrotom bölümlendirilmeleri kolaylaştırmak için 5 derece açı ayarlayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi, 11, ince dilimler (10 uM) içinde Örnek parafin bloğu kesin. </ Ol>
- (Bölüm 1.6.2 de aynı boyutta) bir kalıp üstünde bir gömme kasetin koyarak bir mum üs yapmak erimiş balmumu ile doldurun ve balmumu katılaşmış sonra kalıp çıkarmak.
- Hibrid-Cut kesit yöntemi
- Bir jilet kullanarak uygun bir boyuta üstündeki bir yamuk yüzeye sahip bir sütun adım 1.6.4 örnek parafin blok Trim.
- Kriyostat sahnenin merkezine bazı Optimal Kesme Sıcaklık bileşik (OCT) ekleyin. Kriyostat aşamasına parafin blok takın ve daha sonra hızlı bir şekilde istenen pozisyona doku bloğu yönlendirin.
- Kriyostaz odasına parafin blok / sahne aktarın. 10 Ekim dakika süreyle -42 ° C'de hızlı dondurma çubuğunda katılaşmaya izin verin. OCT (Şekil 2C) katılaşma sırasında blok hareket etmiyor.
- Kriyostat adaptörü ve oda sıcaklığı Kriyostat adaptöre parafin blok / sahne takmadan önce -20 ° C ve -16 ° C sırasıyla soğumasını bekleyin. kalınlıkta 10 um Bölüm dokular.
- forseps ile doku bölümleri seçin. Bir Poly 800 ul DEPC arıtılmış su ile ilgili bölümleri Float - L - lizin COATed slayt ve 42 ° C'de sıcak bir tabağa slaytlar aktarın.
- Bölümler 42 ° C'de DEPC ile muamele edilmiş su düzleştirmek için izin verir. kenarından suyu boşaltmak için filtre kağıdı kullanın.
- bir gecede 42 ° C sıcak plaka üzerinde slayt koyarak slayt Dağı doku.
3. Doku Boyama
- Parafinden arındırma lamların
- sıcak plaka slaytları toplayın ve bir boyama rafa koyun. davlumbaz bir boyama kavanoza 150 mi ksilen ilave edin ve 5 dakika boyunca ksilen rafı bırakın.
- rehidrasyon
- DEPC ile muamele edilmiş su içinde etanol çözeltileri farklı konsantrasyonlarda (100,% 95,% 70,% 50,% 30,%) hazırlanması ve sırasıyla farklı boyama kavanoz içine 150 ml doldurun.
- etanol konsantrasyonu, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca her bir adımı azaltmak için bir dizi numune rehidrate. boyama slaytlar aktarın başka kavanoz içeren d bir kavanoz rafifferent etanol konsantrasyonu:% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol,% 50 etanol ve% 30 etanol.
- Rehidrasyon sonra 3 dakika boyunca GKD 2 O örnekleri bırakın.
- hematoksilin boyama
- 1.5 dakika süreyle hematoksilen çözeltisi içinde doku slaytları daldırarak leke doku örnekleri.
- Daha sonra, bir kaç saniye için 12 N hidroklorik asit (HCI) 2 damla ve GKD 2 O kısaca yıkayın - 1 içeren 2 O GKD kısaca durulayın
- kurutma
- % 30 Etanol ve% 50 etanol,% 70 etanol,% 95 etanol ve% 100 Etanol: oda sıcaklığında 3 dakika boyunca etanol konsantrasyonlarının artışının bir dizi numune kurutmak. 5 dakika boyunca davlumbaz ksilen ile numune temizleyin.
- Montaj
- slayt üzerine ksilende göre montaj orta uygun 600 ul bırakın. Dikkatle numune üzerinde bir lamel yerleştirin. İyi kaliteli görüntüler elde etmek için şekillendirme hava kabarcıkları kaçının.
- slaytlar kuru gecede hava izin verin. Ertesi gün, bir mikroskop altında örnek uyun.
Not: Görüntüler numunelerin boyutuna bağlı olarak 400X büyütme 25X ele geçirildi.
İn Situ Hibridizasyon 4.
- Probe sentezi
- Klon Orkide aphrodite aktin geni özel kodlama sekansı kullanılarak primerler 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 've 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC 3' (242 bp PCR amplikonu için) ve CyclinB1 1; gen spesifik kodlama sekansı kullanılarak primerler 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 ' ve 5'-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(327 bp PCR amplikonu için) 12 tarif edildiği gibi.
- Üreticinin protokolüne uygun olarak (örneğin, pGemT) vektörleri içine belirli kodlama dizilerini Arter.
- diyoksijenin oluşturun (DIG) üreticinin talimatlarına göre SP6 / T7 DIG RNA etiketleme kiti kullanılarak sens ve antisens sondaları etiketlis.
- In situ hibridizasyon
- Hibrid-Cut yöntemi kullanılarak elde 2 nci ve 3 üncü aksiller tomurcuk doku dilimleri (10 mikron kalınlığında) Kes ve kaplamalı slayt üzerine dilim monte edin.
- ksilen Deparaffinize doku bölümleri (3.1.1), etanol konsantrasyonu (3.2.2) azaltılmasında rehidrate ve 30 dakika boyunca 37 ° C 'de 2 mg / ml proteinaz K ile sindirmek.
- Protokole göre in situ hibridizasyon gerçekleştirmek daha önce 59 ° C ve CyclinB1 60 ° C Aktin için hibridizasyon sıcaklığı ile, örneğin, bazı değişiklikler ile 11,13 tarif;. 1 40 ng DIG işaretli RNA probu ile slayt melezleşme.
- 11 tarif edildiği gibi hibridizasyon sinyalleri tespit etmek için nitro mavi tetrazolyum / 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (NBT / BCIP) solüsyonu kullanın.
Representative Results
Hibrid-Cut Doku Bölüm bütünlüğü arttırır
üreme çiçek yapısının anatomisini anlamak orkide çiçek inisiyasyon yatan mekanizmayı araştırmak için önemlidir. Ancak, Phalaenopsis orkide hücre içi kalsiyum oksalat kristallerinin birikmesi Bu tür çalışmalar bir zorlu görevi yapar. Kesit süreci (Şekil 1) sırasında kristaller neden yırtılma ile ilgili sorunları aşmak için, biz Hybrid-Cut adında bir sistem geliştirdi. Bu protokol, geleneksel parafin gömme ve cryosection tekniklerini birleştirir. Biz ilk Hibrid-Cut onlar doku sertliği ve yüksek kristal içeriği için namlı çünkü Phalaenopsis orkide koltuk altı tomurcukları test. Aksiller tomurcuk doku% 4 PFA giderilmiştir (Protokolü, adım 1.3). Seri etanol dehidratasyon ve parafin mumu i sonranfiltration, aksiller tomurcuk parafin blok içinde gömülü idi. Blok (Şekil 2A) kesit önce uygun bir boyuta kesilmiş oldu. OCT küçük bir miktar daha sonra kriyostat aşamasında (Şekil 2B) ortasına uygulandı. parafin blok sonra OCT üzerinden sahneye yapıştırılır oldu. Aşama (Şekil 2C) kesit önce OCT tam katılaşma sağlamak için 10 dakika boyunca, bir kriyostat inkübe edildi ve daha sonra cryosection bir -16 gerçekleştirilmiştir ° C bölmesi (Şekil 2B).
Bir karşılaştırma olarak, Phalaenopsis orkide aksiller tomurcuk içeren bir parafin blok düzenli mikrotom kesit tabi tutuldu. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, parafın şeritler ciddi yırtılma mikrotom kesit sonra gözlenmiştir. Doku bütünlüğü ve hücresel yapısı da (Şekil 1B) tatlıya bağlandı. Hibrid-Cut, diğer taraftan,korunmuş yapısal bütünlüğü (Şekil 3B) üretilen sağlam doku bölümleri (Şekil 3A).
Uygulama P. Çeşitli Dokusuna Hybrid-Cut Afrodit
Ayrıca, hibrid kesilmiş amenability test etmek için, Orkide orkide farklı dokular test edilmiştir. Çünkü sertleşmiş tohum kat iyi doku bütünlüğü ile tohum bölümleri elde etmek genellikle zordur. Bu protokolü kullanarak, tohumların detaylı yapıları (Şekil 4A) kesit sonra korundu. Şekil 4A, protein organları gösterildiği gibi, ortak depolama ürünleri 14, net bir şekilde tespit edilebilir. Hibrid-kesim de başarılı oldu ve bir aylık protocorm sürgün apikal meristem (bir tohum çimlendirilen yapısı) (Şekil 4B) detaylı yapı gösterdi veprotocorm-like-organları (PLB'ler, Şekil 4C). Hücre içi kristaller, kalın ve etli yaprakları PLB. Phalaenopsis orkide bölümlerinde var gözlendi ve Crassulacean asit metabolizmasını (CAM) tipi fotosentez 15 gerçekleştirin. Yaprak kanadın enine kesitinin ksilemini ve floem (Şekil 4D) ihtiva eden büyük bir mezofil hücreleri, vasküler demetler göstermiştir. Birkaç stoma açıklıklar gündüz (Şekil 4D) içinde eksen dışı yaprak yüzeyinde gözlenmiştir. Aslında, CAM bitkileri karbon kazancı maksimize ama aynı zamanda kurak koşullarda 15,16 altında gece onların stomate'lerin açarak su kaybını en aza indirmek için gelişti. P. kök apikal meristem aphrodıte Şekil 4E'de gösterilmiştir. Kök ucu hücreleri çok iyi (Şekil 4E) kesit sonra korundu kristaller, önemli sayıda içerdiği görüldü. Genç çiçek sivri Boyuna bölümleri informat sağlananGenç çiçek primordials (Şekil 4F) mimarisi hakkında iyon. Ayrıca, çanak yaprakları, yaprakları, labellum ve pollinia açıkça 5 mm çiçek tomurcuğu (Şekil 4G) farklılaşmayı tamamlamış genç çiçek tomurcuklarının uzunlamasına bölümünden tanımlanabilir. Kristaller genç çiçek tomurcukları sepals birikmiş olduğunu fark. Kısacası, bu protokol, doku bütünlüğünü korumak için sürekli çalışıyor ve anatomik ve olası hücresel çalışmalar sağlayan sağlam morfolojisi üretir.
Hibrid-Cut Tahıl Bitkileri Doku bütünlüğü korur
Biz de Hybrid-Cut yüksek silika içeriği 17,18 ihtiva pirinç, buğday ve mısır gibi tahılların üzerinde test. Şekil 5'te gösterildiği gibi, pirinç, buğday ve mısır yaprakların enine kesitlerin doku bütünlüğü anlamlı Hy edilerek geliştirilmiştirbrid-Cut yöntemi. Su kaybını önlemek için yaprak bıçak haddeleme kontrolün odun dokusu, floem, mezofil hücreleri, Stomate'lerin ve bulliform hücreleri açıkça pirinç yaprak kesimlerinden tespit edilmiştir. Kranz anatomisi, mezofil hücreleri ve mısır yaprağı 19,20 vasküler demetleri açıkça tespit edilmiştir. Mısır yaprakları (Şekil 5) ve adaxial ve eksen dışı tarafı hem de stomate'lerin bir yüksek yoğunluklu bulmak ilginç oldu. Mısırda 0,7 adaxial ve eksen dışı stoma oranı daha önce 21 bildirilmiştir. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda, pirinç, buğday ve mısır (Şekil 6) gelen spikelets ayrıntılı hücre morfolojisi sağlamak için başarılı bir şekilde çalışmıştır. Spikelets bol miktarda silis 9 içerdiği bilinmektedir. Normalde, bu doku bölümlendirilmeleri iletken zorlaştırmaktadır.
İn Situ Hibridizasyon
In-situ hibridizasyon (ISH) doku seviyesinde 11 gen ekspresyonu lokalize geliştirilmiştir 22-25. Buna ek olarak, ISH hücre sağlar ve bazı durumlarda alt-selüler, çok-hücreli organizmalardan 26 mRNA'nın dağılımının çözünürlüğü. ISH sırasında, RNA ve doku bütünlüğü seçilen transkript hakkında güvenilir uzamsal bilgiyi elde etmek esastır. Hibrid-Kesme protokolü kullanılarak ISH test aktin geni (PATC157348) primerleri 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 've 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC 3' 242 bp PCR amplikon Siklin B1 için kullanılarak klonlandı.:. 1 (PATC146999) gen spesifik kodlama sekansı kullanılarak primerler 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'Ve 5'ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' 327 bp almak için PCR amplikon. ISH, Aktin ve Siklin B1 sonra: 1 gen ifadesi Genç ve olgun koltuk altı tomurcukları izlendi Güçlü sinyaller 3. aksiller tomurcukları tespit ile (Şekil 7). Her iki gen, 2. ve 3. koltuk altı tomurcuklarının meristematik hücrelerde ifade edildi. Bu sonuçlar Hibrid-Cut iyi anatomi korumak ve mekansal gen ifade desenini sağladığını göstermiştir.
Şekil 1: Geleneksel Parafin Bölüm Doku Şiddetli Yırtılma nedenleri Phalaenopsis orkide aksiller tomurcuk içeren bir parafin blok düzenli mikrotom kesit tabi tutuldu.. Parafin şeritler şiddetli yırtılma geleneksel mikrotom kesit sonra gözlenmiştir (A) (B) tatlıya bağlandı. oklar doku dilim şiddetli yırtılmasına göstermektedir. Ok başı kristal organları gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Hibrit-Cut Kesit Yöntemi Bir aksiller tomurcuk doku PFA giderilmiştir ve dokular parafin mumu ile sızmış, susuz olduğunu ve bir parafin blok içinde gömülü. Parafin blok uygun büyüklükte (A) kesilmiş oldu. Optimum kesme ısısı bileşiği (OCT) kriyostat aşama (B) 'nin merkezi uygulandı. parafin blok Kriyostat sahnede OCT bağlanmıştır. Düşük sıcaklık altında, parafin blok OCT (C) ile kriyostat aşamasına yapıştırılmıştır. Doku dilimleri -16 ° C (D) kriyostat odasında kesitler alındı. Ölçek çubukları 0,5 cm (A) ve 1 cm (BD) temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Hibrid-Cut Bölüm Bütünlüğünü geliştirir Phalaenopsis orkide aksiller tomurcuk içeren bir parafin blok (A) kesit Hybrid-Cut tabi tutuldu ve Hibrid-Cut yöntemi mükemmel doku bütünlüğü (B) bölümleri üretti.. ok aksiller tomurcuk dokusunda gömülü endojen kristal organları gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron.rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Hibrid-Cut Phalaenopsis orkide Çeşitli Doku Bölümler Farklı orkide Uygulaması dokularda olgunlaşmış aşamasında (A) protocorm uzunlamasına bölümü (B) protocorm benzeri cisimlerin uzunlamasına bölümü (PLB) (C), enine kesit boyunca orkide tohum uzunlamasına bir kesit olarak, melez kesme yöntemi kullanılarak kesitler alındı yaprak ayası (D), kök (E) uzunlamasına kesit, genç çiçek artış (F) ve genç çiçek tomurcukları (G) uzunlamasına bölümünün uzunlamasına kesitidir. Doku kısımları hematoksilin ile boyandı. SC, tohum kabuğu; PB, protein vücut; E,meristem; MP, anne PLB; DP, kızı PLB; Reklam, adaxial yaprak yüzey; Ab, abaxial yaprak yüzey; St, stoma; MC, mezofil hücre; VB, vasküler demet; RC, kök kap; fb, çiçek tomurcuğu; Se, çanak yaprağı; Pe, petal; La labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, yara dokusu. Ok uçları kristaller göstermektedir. Ölçek çubukları 20 um (AE) ve 200 mikron (FG) temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Hibrid-Cut Çeşitli Tahıl Bitkileri Yaprak Doku Bütünlüğünü korur geleneksel parafin yöntemi (sol panel) ve bu çalışmada (sağ panel) geliştirilen Hybrid-Cut tekniği kullanılarak yaprak dokusu karşılaştırılması. Fotoğraflar, pirinç, buğday ve mısır yaprak enine kesiti göstermektedir. MC, mezofil hücre; Ph, floem; St, stoma; M.Ö., bu lliform hücresi. Oklar doku dilim yırtılmasını göstermektedir. Ok uçları silika organları gösterir. mavi kesikli çevreler C4 mısırda Kranz anatomi gösterir. Ölçek 20 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:. Hibrid-Cut Çeşitli Tahıl Bitkilerinde başakçık Doku Bütünlüğünü korur geleneksel parafin ve Hibrid-Cut yöntemleri arasında başakçık bölümlerin doku bütünlüğü karşılaştırılması. Oklar doku dilim yırtılmasını göstermektedir. Ok uçları silika organları gösterir. Ölçek çubukları 20 mikron (pirinç) ve 200 mikron (buğday ve mısır). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: Aktin ve CyclinB1 Yerinde Hibridizasyon; Phalaenopsis orkide 2. aksiller tomurcuk ve 3. aksiller tomurcuk Doku dilimleri Hibrid-Cut yöntem kullanılarak hazırlandı Aksiller Bud 1 İfade Kalıpları.. Aktin ve CyclinB1 40 ng toplam 1; DIG etiketli prob hibridizasyonu kullanılmıştır. sens probu, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Oklar aksiller tomurcuk üreme meristemi göstermektedir. Ölçek 100 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bitki hücreleri bitki dokusu kesit sırasında doku yırtılma sorunlara neden sert hücre duvarları, sert elyaflar, kristaller, ve yüksek su içeriğine sahiptir. Parafin esaslı kesit genellikle bitki dokuları kullanılır da, endojen kristaller genellikle (Şekil 1) kesit sırasında bitki dokuyu yırtabilir. Çünkü, bitki hücreleri içinde doğal olarak yüksek su içeriği, kriyostat tabanlı kesit genellikle kırık hücreleri ve kırık doku bölümleri neden olur.
Bu çalışmada, Hibrid-Cut adlı bir kombine parafin-gömme ve cryosection protokolü geliştirildi ve kaliteli doku kesitlerinde elde edilmiştir. Bu protokol parafin gömme tanıtarak yüksek su içeriği ile ilgili sorunu giderir, ve (Şekil 3) kesit sırasında düşük sıcaklık altında parafin sertleştirerek yırtılma etkisini azaltır. Bu nedenle, bu değiştirilmiş protokolünü parafin esaslı sezaryen avantajlıdırning veya bitki dokusu bütünlüğünün korunması için cryosectioning.
Bu yazının Hybrid-Cut yöntemi kristalleri (Şekil 3-4) yüksek düzeyde içeren vb aksiller tomurcuk, tohum ve PLB gibi Phalaenopsis orkide birçok dokuda doku bütünlüğünü koruduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu protokol, yüksek silis (Şekil 5-6) içeren üreme organları ve pirinç, mısır yaprakları ve buğday gibi hububat bitkileri ile uyumludur. Muhtemelen, bu protokol, yüksek elyaf içeren bitkiler odunsu tatbik edilebilir.
Genel olarak, sabitleme doku iyice Hibrid-Cut için çok önemlidir. O formaldehit-alkol-asidik asit (FAA) sabitleştirici PFA gibi eksenel vb tomurcukları, kökler, Ancak, PFA RNA bütünlüğünü koruyarak FAA daha iyi çalışır gibi bazı inatçı dokuların doku bütünlüğünü korumak için daha iyidir bulundu. Bu nedenle PFA düzeltmek için tavsiye edilirin situ hibridizasyon (ISH) çalışma örneği. Burada açıklanan protokol RNA ISH deney için tasarlanmıştır. Bu nedenle, tüm reaktifler DEPC işlenerek RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırarak RNA bozulmasını önlemek için hazırlanmıştır. Hibrid-Cut bölümü anatomik çalışmalar, düzenli ters osmoz (RO) su ve onun türevi tampon veya reaktif kabul edin.
en az 3 mm numune boyutu ve kalınlığının azaltılması infiltrasyon için yararlıdır. Ayrıca, dehidratasyon ve infiltrasyon artan daldırma süresi sert doku dokular için gereklidir. Bu protokolün Sınırlaması yetersiz fiksasyon, dehidratasyon ve numunenin sızması kaynaklanan sorunlar nedeniyle olabilir. Bu nedenle, her basamak için işlem süresi ayarı kaliteli parafın bir bloğun üretilmesi için çok önemlidir. Normal olarak, sert doku yumuşak dokuya göre işlem süresi daha uzun gerekmektedir.
Ayrıca, Hibrid-Cut kombinasyonu wi başarıyla çalışmış olduğunu gösterdiinci ISH seçilen transkript (Şekil 7) dağılımını sağlamak. Özet olarak, bu protokol, bitki anatomisinin çalışma için yararlıdır ve seçilen gen, bir doku-spesifik RNA haritasını sağlar. Buna ek olarak bu tür terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç işaretleme analizi (TÜNEL) deneyi, floresan in situ melezleme (FISH) ve immün teknikleri gibi diğer moleküler çalışmalar tatbik edilebilir. Sonuç olarak, bu gelişmiş doku kesit protokolü kullanışlı ve bitki toplulukları araştırmacılar için yararlı hem de.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
| Microtome model RM2255 | Leica | ||
| Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
| Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
| RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
| Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
| Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
| Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
| Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
| Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
| SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
| FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
| Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
| Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
| pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
- Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
- Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
- Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
- Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
- Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
- Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
- Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
- Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
- Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
- Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
- Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
- Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
- Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
- Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
- Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
- Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
- Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
- Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
- Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
- Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
- Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
- Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).
