This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
维持植物部分完整性是用于在细胞,组织,或者甚至器官水平研究详细的解剖结构是至关重要的。然而,一些植物细胞有刚性细胞壁,坚韧的纤维和晶体 (草酸钙,硅石, 等 ),和水含量高,往往破坏植物组织切片中的组织的完整性。
该研究建立了一个简单的混合切割组织切片的方法。该协议修改一个基于石蜡的切片技术,提高了从不同的植物组织切片的完整性。植物组织在-16℃下在低温恒温器切片之前包埋在石蜡中。低温切片硬化石蜡块,减少撕裂和划伤,提高组织的完整性显著。该协议被成功地应用于富含钙草酸盐蝴蝶兰组织以及顽抗组织如生殖奥尔加纳秒和水稻,玉米和小麦的叶子。此外,从杂交切的组织切片的高品质,可以在组合原位杂交(ISH)用于提供感兴趣的基因的空间表达模式。总之,这个协议是用于含有高结晶或二氧化硅含量顽抗植物组织特别有用。质量好组织切片使形态学和其他生物的研究。
的基于石蜡的切片方法,是解剖学研究一种广泛使用的技术。完整的组织解剖结构的保存是形态学和生物学研究的重要。石蜡包埋切片的技术是有利的,因为石蜡包埋保留的细胞和组织的形态。另外,石蜡块可以方便地用于长时间储存。然而,石蜡包埋切片不适合含有胞内晶体的植物组织。细胞内的晶体往往撕切片过程中石蜡彩带和损伤组织的完整性。
与石蜡切片,cryosectioning是比较快的,并部分可以不固定,串行脱水或包埋剂浸润1获得。冷冻切片与许多应用,例如免疫组织化学, 原位杂交和酶组织化学相容。 cryosectioning的另一优点是该方法不经过一个潜在的变性过程,如高温和化学处理,所以蜂窝分子保存完好的组织切片2内。 Cryosectioning一般优于石蜡切片基于对动物组织的研究。然而,cryosectioning并不在植物中的首选,因为冷冻温度有时会导致形成影响的部分完整性质量冰晶。尽管渗透调节,例如蔗糖溶液,聚乙二醇(PEG),或甘油3已报道降低冷冻条件下结晶冰的形成,其改进是不理想。
以适应不同的环境,不同的植物往往具有不同的组织质地和植物细胞进化以形成刚性细胞壁,坚韧纤维和结晶4,5-。例如,不溶性草酸钙晶体和二氧化硅机构是在相当普遍植物6。硅酸盐机构/晶体的报道,以帮助维持工厂结构,直立,防止病虫害的谷类植物7-9。
盆栽兰花切花兰花市场正在蓬勃发展,这是一个增长的行业。 白蝴蝶兰 (蝴蝶兰)是台湾最重要的出口观赏植物之一。显著已作出努力了解蝴蝶兰的兰花开花过程的形态和生理变化。 蝴蝶兰花的花尖峰从叶基部腋芽开始。一段凉爽环境温度后(约一个半月),腋芽放大,打破休眠,并且从叶基部突出培养成年轻花香尖峰。理解的生理,细胞和穗起始分子过程,重要的是开发一种健壮解剖技术visua丽泽组织或标记及时。然而,在兰组织普遍存在的晶体的存在,特别是在腋芽,使得解剖工作困难。
在这里,我们试图改善这种迄今已被视为技术上的挑战顽抗的植物组织部分的完整性。在这里我们命名为混合式切割的改进协议。它是使用低温恒温器进行的基于石蜡的切片方法。石蜡包埋解决植物组织中的含水量高。低温下切片变硬的石蜡块,减少了晶体撕裂的问题,并显著提高组织的完整性。该协议显著提高了顽抗的植物样品组织的完整性。
植物细胞有刚性细胞壁,坚韧的纤维,晶体,水分含量高,导致植物组织切片中组织撕裂的问题。即使基于石蜡的切片经常用于植物组织,内源晶体往往切片( 图1)过程中撕裂植物组织。因为植物细胞内的水分含量固有的高的,基于低温恒温器,切片往往会造成细胞破壁和打击组织切片。
在本研究中,命名为混合式切割组合石蜡包埋和冷冻切片协议被开发并且获得良好质量的组织切片。该协议解决了通过引入石蜡包埋具有高水含量有关的问题,并减少了切片( 图3)期间由低温下硬化石蜡的撕裂效应。因此,该修改的协议是在任一基于石蜡的sectio有利宁或cryosectioning用于保存植物组织的完整性。
这个手稿表明,混合式切割方法保留在蝴蝶兰的许多组织如腋芽,种子,和PLB 等含有高含量的结晶( 图 3-4)的组织的完整性。此外,该协议是适合于谷物作物如生殖器官和水稻,玉米的叶,小麦含有高二氧化硅( 图5-6)。据推测,该协议可以被应用到木质含高纤维植物。
一般来说,固定组织彻底是混合式切割非常重要的。我们发现,甲醛醇酸性酸(FAA)固定剂是比PFA保留一些顽抗组织的组织的完整性,如轴向芽,根, 等等。然而,PFA作品比联邦航空局在维护RNA的完整性更好。因此PFA建议修复样品原位杂交(ISH)的工作。这里所描述的协议被设计用于RNA ISH实验。因此,准备所有的试剂由DEPC处理消除了RNase污染,以避免RNA降解。如果混合形切割部分为解剖研究,定期反渗透(RO)水及其衍生缓冲器或试剂都是可接受的。
还原样品的大小和厚度小于3毫米为浸润有帮助的。此外,增加浸渍时间为脱水和渗透所必需的质地坚硬的组织。这个协议的限制可能由于由定影不足,脱水,和试样的渗透问题。因此,对于每个步骤的处理时间的调整是非常关键的,以产生质量好的石蜡块。通常情况下,很难组织需要更长的处理时间较软的组织。
此外,我们发现,混合式切割相结合的Wi成功合作日ISH提供选择的成绩单( 图7)的空间分布。总之,这个协议是植物解剖学的研究有用并提供所选择的基因的组织特异性的RNA图谱。此外,它也可以应用于其他的分子研究如末端脱氧核苷酸转移的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定法, 荧光原位杂交(FISH),和免疫染色技术。总之,这种改进组织切片协议既是有益的,对植物群落的研究人员很有帮助。
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |