Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

हाइब्रिड-कट: अड़ियल संयंत्र के ऊतकों के नमूनों के लिए एक बेहतर सेक्शनिंग विधि

Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Academia Sinica Biotechnology Center in Southern Taiwan; Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica
* These authors contributed equally

Abstract

बनाए रखने संयंत्र खंड अखंडता सेलुलर, ऊतक, या भी अंग स्तर पर विस्तृत शारीरिक संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, कुछ संयंत्र कोशिकाओं कठोर सेल दीवारों, मुश्किल फाइबर और क्रिस्टल (कैल्शियम oxalate, सिलिका, आदि), और उच्च पानी सामग्री अक्सर संयंत्र के ऊतकों सेक्शनिंग दौरान ऊतक अखंडता को बाधित करता है।

इस अध्ययन के लिए एक सरल हाइब्रिड कट ऊतक सेक्शनिंग विधि स्थापित करता है। इस प्रोटोकॉल एक आयल आधारित सेक्शनिंग तकनीक को संशोधित करता है और विभिन्न पौधों से ऊतक वर्गों की अखंडता को बेहतर बनाता है। संयंत्र के ऊतकों -16 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat में सेक्शनिंग पहले पैराफिन में एम्बेडेड थे। कम तापमान के तहत सेक्शनिंग पैराफिन ब्लॉकों, कम फाड़ और scratching, और बेहतर ऊतक अखंडता काफी कठोर। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्रजनन संगठनों के रूप में कैल्शियम oxalate युक्त Phalaenopsis आर्किड ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से अड़ियल ऊतकों को लागू किया गया थाएनएस और चावल, मक्का और गेहूं की पत्तियों। इसके अलावा, हाइब्रिड से कट ऊतक वर्गों की उच्च गुणवत्ता सीटू संकरण (ISH) के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है ब्याज की जीन के स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदान करने के लिए। अंत में, इस प्रोटोकॉल उच्च क्रिस्टल या सिलिका सामग्री युक्त अड़ियल संयंत्र के ऊतकों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। अच्छी गुणवत्ता ऊतक वर्गों रूपात्मक और अन्य जैविक अध्ययन सक्षम करें।

Introduction

आयल आधारित सेक्शनिंग विधि संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है। बरकरार ऊतक शरीर रचना विज्ञान के संरक्षण रूपात्मक और जैविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि आयल एम्बेडिंग सेल और ऊतक आकृति विज्ञान को बरकरार रखे हुए आयल एम्बेडेड सेक्शनिंग तकनीक फायदेमंद है। इसके अलावा, आयल ब्लॉकों समय की लंबी अवधि के लिए आसानी से संग्रहित किया जा सकता है। हालांकि, आयल एम्बेडेड सेक्शनिंग संयंत्र intracellular क्रिस्टल युक्त ऊतकों के लिए उपयुक्त नहीं है। कोशिकाओं के भीतर क्रिस्टल अक्सर सेक्शनिंग दौरान आयल रिबन और नुकसान ऊतक अखंडता आंसू।

पैराफिन सेक्शनिंग के विपरीत, cryosectioning अपेक्षाकृत तेज है और वर्गों के निर्धारण, सीरियल निर्जलीकरण या मध्यम घुसपैठ 1 embedding के बिना प्राप्त किया जा सकता है। Cryosections में सीटू संकरण ऐसे immunohistochemistry के रूप में कई अनुप्रयोगों, और एंजाइम ऊतकरसायनविज्ञान के साथ संगत कर रहे हैं। cryosectioning के अन्य लाभ यह हैकि इस विधि में इस तरह के उच्च तापमान और रासायनिक उपचार के रूप में एक संभावित विकृतीकरण प्रक्रियाओं के माध्यम से जाना नहीं है, तो सेलुलर अणुओं अच्छी तरह से ऊतक वर्गों 2 के भीतर संरक्षित कर रहे हैं। Cryosectioning आम तौर पर आयल आधारित जानवरों के ऊतकों में पढ़ाई के लिए सेक्शनिंग अधिक पसंद है। हालांकि, cryosectioning पौधों में पहली पसंद है क्योंकि ठंड तापमान कभी कभी बर्फ क्रिस्टल कि खंड अखंडता की गुणवत्ता को प्रभावित के गठन का कारण बनता नहीं है। हालांकि इस तरह के osmoregulation सूक्रोज समाधान, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), या ग्लिसरॉल 3 के रूप में ठंड की स्थिति के तहत क्रिस्टल बर्फ गठन को कम करने के लिए सूचित किया गया है, सुधार इष्टतम से कम है।

विभिन्न वातावरण के लिए अनुकूल करने के लिए, विभिन्न पौधों अक्सर अलग ऊतक बनावट और संयंत्र कोशिकाओं कठोर सेल दीवारों, मुश्किल फाइबर, और क्रिस्टल 4,5 फार्म के लिए विकसित किया है। उदाहरण के लिए, अघुलनशील कैल्शियम oxalate क्रिस्टल और सिलिका निकायों में काफी आम हैंपौधों 6। सिलिकेट निकायों / क्रिस्टल मदद संयंत्र वास्तुकला, सीधापन को बनाए रखने, और अनाज के पौधे 7-9 में रोग या कीट को रोकने के लिए सूचित किया गया है।

कमरों का ऑर्किड और कट-फूल आर्किड बाजार पनप रहा है और यह एक उद्योग बढ़ रहा है। Phalaenopsis Aphrodite (कीट आर्किड) ताइवान में सबसे महत्वपूर्ण निर्यात सजावटी पौधों में से एक है। महत्वपूर्ण प्रयास Phalaenopsis ऑर्किड में फूल प्रक्रियाओं की रूपात्मक और शारीरिक परिवर्तन को समझने के लिए बनाया गया है। Phalaenopsis ऑर्किड के पुष्प spikes पत्ता आधार पर कक्षा कलियों से शुरू कर रहे हैं। शांत परिवेश के तापमान की अवधि के बाद (लगभग डेढ़ महीने), कक्षा कलियों विस्तार, निद्रा को तोड़ने, और पत्ता आधार से बहर युवा पुष्प spikes में विकसित करने के लिए। शारीरिक, सेलुलर, और कील दीक्षा की आणविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए, यह visua के लिए एक मजबूत शारीरिक तकनीक विकसित करने के लिए आवश्यक हैLize ऊतकों या एक समय पर ढंग से मार्करों। हालांकि, आर्किड ऊतकों में सर्वव्यापी क्रिस्टल की उपस्थिति, विशेष रूप से कक्षा कलियों में, संरचनात्मक काम कठिन बना देता है।

यहाँ हम अड़ियल संयंत्र के ऊतकों है कि अब तक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण के रूप में माना गया की धारा अखंडता में सुधार करने की मांग की। यहाँ हम एक बेहतर प्रोटोकॉल नामित हाइब्रिड कट दिखा। यह एक आयल आधारित सेक्शनिंग तरीका है कि एक cryostat का उपयोग किया जाता है। आयल एम्बेडिंग संयंत्र के ऊतकों में उच्च पानी सामग्री का निराकरण। कम तापमान के तहत सेक्शनिंग पैराफिन ब्लॉक मज़बूत बनाता है, समस्या फाड़ क्रिस्टल कम कर देता है, और काफी ऊतक अखंडता को बेहतर बनाता है। इस प्रोटोकॉल में काफी अड़ियल संयंत्र के नमूने के लिए ऊतक अखंडता को बेहतर बनाता है।

Protocol

1. फिक्सेशन और एम्बेडिंग

  1. अभिकर्मक तैयार
    1. 10x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
      1. 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 2 जी KCl, 14.4 छ ना 2 HPO 4, और 2.4 जी एच 2 4 पीओ 800 मिलीलीटर में दोहरा आसुत जल (DDH 2 हे) जोड़ें और एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। DDH 2 हे 1 एल की कुल मात्रा को जोड़ें, तो 1,000 μl diethyl pyrocarbonate (DEPC) जोड़ने के लिए और सख्ती से हिला। स्टोर पीबीएस रात भर 20 मिनट के अगले दिन के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान और आटोक्लेव पर।
    2. 1x पीबीएस
      1. 0.01 एम ना 2 के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 4 HPO DDH 2 हे 1:10 के अनुपात में शेयर 10x पीबीएस पतला, 0.002 एम एच 2 4 पीओ, 0.003 एम KCl, और 0.13 एम NaCl।
    3. Paraformaldehyde (पीएफए) लगानेवाला
      सावधानी: Paraformaldehyde विषैला होता है। एक धूआं हुड के तहत इसे तैयार। दस्ताने पहनें।
      1. 250 मिलीलीटर पीएफए ​​लगानेवाला तैयार करने के लिए, गर्मी 10070 मिलीलीटर 1x पीबीएस - 80 डिग्री सेल्सियस और NaOH के 1,750 μl जोड़ें। तब paraformaldehyde के 10 ग्राम जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से जब तक भंग कर दिया। बर्फ पर समाधान प्लेस और फिर एच 2 के साथ 7.2 पीएच को समायोजित करें ताकि 4 - ठंडा करने के बाद (260 270 100 मिलीलीटर के लिए μl)।
      2. , 1x पीबीएस के साथ 250 मिलीलीटर मात्रा समायोजित 0.25% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 625 μl glutaraldehyde जोड़ें। 250 μl ट्राइटन X-100 और 250 के बीच 20 μl लगानेवाला की घुसपैठ की सुविधा के लिए जोड़ें।
        नोट: पीएफए ​​लगानेवाला इसका निर्धारण क्षमता खोने के बिना एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    4. DEPC इलाज पानी से इथेनॉल के विभिन्न सांद्रता (30%, 50%, 70%, 85%, और 95%) तैयार करें।
  2. संयंत्र नमूना संग्रह
    1. कक्षा कलियों
      1. चार पत्ती चरण में परिपक्व Phalaenopsis आर्किड पौधों का प्रयोग करें। ध्यान से midrib हाथों का उपयोग निम्न पत्ती फाड़ द्वारा पत्तियों को हटा दें।
      2. caref के लिए एक तेज छुरी का प्रयोग करेंully monopodial तने पर तीसरे या चौथे पत्ती के आधार से कक्षा कलियों को हटा दें।
    2. बीज का नमूना
      1. परागण के बाद 4 महीने में परिपक्व आर्किड बीज फली हार्वेस्ट। एक छुरी के साथ longitudinally बीज फली कट। उद्घाटन बीज फली धीरे हिला और फिल्टर पेपर पर सूखे बीज जारी।
    3. Protocorm
      1. एक 1 / 2x Murashige और Skoog अगर प्लेट पर परिपक्व आर्किड बीज बोते हैं, और एक 12 घंटा प्रकाश की अवधि में एक टिशू कल्चर कमरे और 25 डिग्री सेल्सियस के लगातार तापमान में हो जाना। बुवाई के बाद 7 सप्ताह में हरी protocorm नमूना।
    4. Protocorm-जैसे निकायों (PLBs)
      1. टी 2 के रूप में कदम 1.2.3.1 के रूप में ही विकास शर्तों के तहत पहले 10 और जगह वर्णित अगर प्लेट regenerating पर आर्किड PLBs आगे बढ़ें। 8 मिमी - 5 की ऊंचाई पर 10 PLBs लीजिए।
    5. पत्ता नमूना
      1. कदम के रूप में वर्णित एक परिपक्व Phalaenopsis आर्किड संयंत्र से पत्ता ऊतक लीजिए1.2.1.1।
      2. एक तेज छुरी का प्रयोग दूसरे नव विकसित पत्ती से पत्ता ऊतक (7 मिमी लंबाई एक्स 5 मिमी चौड़ाई) का एक छोटा सा टुकड़ा काट।
    6. रूट नमूना
      1. कदम 1.2.1.1 में वर्णित एक ही पौधे का उपयोग करना, काटना एक तेज स्केलपेल का उपयोग जड़ टिप ऊतक का 1 सेमी लंबाई।
    7. युवा कील
      1. एक तेज छुरी का प्रयोग फूल की नोक हिस्से से युवा कील ऊतक में कटौती करने के लिए लंबाई में 10 सेमी डंठल।
    8. फुल की कलि
      1. आर्किड फूल डंठल से व्यास में 5 मिमी के एक छोटे से फूल कली आबकारी। फूल कली ऊतक longitudinally (मोटाई में 3 मिमी) के हिस्से में कटौती।
    9. पत्ता ऊतकों और अनाज फसलों की छोटी बाल ऊतकों
      1. चावल, गेहूं और मक्के के पौधों से पहले नव विकसित पत्तियों से 1 सेमी लंबाई पत्ती ऊतक में कटौती।
      2. पौधों से 10 spikelets (चावल, गेहूं और मक्का) एक दिन anthesis से पहले लीजिए।
  3. फिक्सेशन
    1. संयंत्र के नमूने उन्हें एक गिलास जगमगाहट 15 मिलीलीटर ठंडा पीएफए ​​लगानेवाला युक्त शीशी में स्थानांतरित द्वारा तुरंत ठीक करें।
    2. एक 4 डिग्री सेल्सियस शांत कमरे में एक निर्वात (~ 720 मिमी पारा) संयंत्र के नमूने लिए लागू करें। 15 के लिए वैक्यूम पकड़ - 20 मिनट (छोटे बुलबुले के नमूनों से रिहा किया जाना चाहिए)। इस चरण को दोहराएँ ऊतकों का सबसे जब तक वैक्यूम की रिहाई के बाद सिंक। वैक्यूम रात भर पकड़ो और अगले दिन वैक्यूम रिलीज धीरे धीरे।
  4. निर्जलीकरण
    नोट: घुसपैठ कदम के माध्यम से निर्धारण से ही शीशी का प्रयोग करें। डालो या पिछले चरण में समाधान से दूर नाली और शीशी में नए समाधान के 15 मिलीलीटर के साथ बदलने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। ऊतकों की बनावट पर निर्भर करता है, इस तरह के आर्किड कक्षा कली, बीज, protocorm, और पीएलबी, और चावल, गेहूं की छोटी बाल, और मक्का के लिए एक लंबे समय के लिए के रूप में कठिन ऊतकों के इलाज; ऐसे आर्किड फूल कली, युवा कील, पत्ती और जड़ है, और चावल, गेहूं की पत्ती, और मक्का एक छोटे समय के लिए के रूप में नरम ऊतकों का इलाज। निर्धारण के बाद, बर्फ पर 10 मिनट के लिए पीबीएस 1x 15 मिलीलीटर नमूना विसर्जित कर दिया।
    1. कमरे के तापमान पर 15 मिलीलीटर इथेनॉल श्रृंखला में नमूने निर्जलीकरण इस प्रकार है: 30 मिनट, 70% इथेनॉल के लिए 30 मिनट, 50% इथेनॉल के लिए 30% इथेनॉल के 1 घंटे के लिए, कठिन ऊतकों के लिए 54 मिनट और नरम ऊतकों के लिए 30 मिनट के लिए 85% इथेनॉल, कठिन ऊतकों के लिए 54 मिनट और नरम ऊतकों के लिए 30 मिनट, और कठिन ऊतकों के लिए 54 मिनट और नरम ऊतकों के लिए 30 मिनट के लिए 100% इथेनॉल दो बार के लिए 95% इथेनॉल।
      नोट: संयंत्र के नमूने कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है।
  • पैराफिन घुसपैठ
    1. इथेनॉल / xylene विकल्प (2: 1, वी / वी), इथेनॉल / xylene स्थानापन्न (1 कठिन ऊतकों के लिए 54 मिनट प्रत्येक और नरम ऊतकों के लिए 30 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर इथेनॉल और xylene स्थानापन्न मिश्रण के साथ नमूने घुसपैठ, कमरे के तापमान पर इस प्रकार के रूप में : 1, वी / वी), इथेनॉल / xylene विकल्प (1: 2, वी / वी), और शुद्ध xylene स्थानापन्न दो बार। सावधानी: ज़ाइलीन विषैला होता है। धूआं हुड में इस कदम है। 60 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर xylene विकल्प है और एक ओवन में पैराफिन मिश्रण के साथ शीशी में नमूना घुसपैठ, रात भर कठिन ऊतकों के लिए, और नरम ऊतकों के लिए 60 मिनट के लिए इस प्रकार है: xylene विकल्प / आयल (2: 1, वी / वी), xylene विकल्प / आयल (1: 1, वी / वी), और xylene विकल्प / आयल (1: 2, वी / वी)।
    2. 15 मिलीलीटर शुद्ध तेल के साथ नमूना एक दिन में दो बार घुसपैठ और एक ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. दोहराएँ कदम अगले दिन 1.5.3।
  • ऊतक एम्बेडिंग
    1. अग्रिम में ऊतक embedding केंद्र 1 घंटा की सत्ता पर स्विच एक पैराफिन ब्लॉक में ऊतकों embedding से पहले पैराफिन मोम जलाशय में पिघला।
    2. 62 डिग्री सेल्सियस पर वार्मिंग ट्रे पर धातु molds (आधार 3.3 सेमी लंबाई एक्स 2 सेमी चौड़ाई के आकार के) वार्म अप, और ढालना आधार में लगभग 13 मिलीलीटर पिघला हुआ मोम की डालना।
    3. गरम संदंश के साथ मोल्ड में खंड 1.5.4 से एक ऊतक का नमूना स्थानांतरण और यह वांछित स्थिति में उन्मुख।
    4. ढालना ले जाएँशांत प्लेट ध्यान से पर है, और जब तक छोड़ मोम जम जाता है।

    • 2. ऊतक सेक्शनिंग

    1. पैराफिन सेक्शनिंग विधि
      1. , (धारा 1.6.2 में एक ही आकार के) एक मोल्ड के शीर्ष पर एक embedding कैसेट रखकर एक मोम आधार बनाने पिघला हुआ मोम के साथ भरने और बाद मोम जम जाता है मोल्ड को हटा दें।
        नोट: embedding कैसेट नमूना पैराफिन ब्लॉक लंगर के लिए एक मोम का आधार बनेगी।
      2. एक उचित आकार और आकार में पैराफिन ब्लॉक ट्रिम, और एक फ्लैट रंग पर कुछ मोम टुकड़े जगह है। मोम पिघला देता है जब तक एक शराब बर्नर का उपयोग मोम टुकड़े गरम करें और फिर धारा 2.1.1 में मोम आधार पर पिघला हुआ मोम जगह ब्लॉक पालन करने के लिए। microtome में यह दबाना।
      3. microtome पर एक नया ब्लेड प्लेस, और microtome में सेक्शनिंग की सुविधा के लिए 5 डिग्री के कोण समायोजित करें।
      4. पतले स्लाइस (10 माइक्रोन) में नमूना पैराफिन ब्लॉक, के रूप में पहले 11 में वर्णित कट।
        5. </ राजभाषा>
      5. हाइब्रिड कट सेक्शनिंग विधि
        1. एक उपयुक्त आकार एक रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए शीर्ष पर एक चतुर्भुज सतह के साथ एक स्तंभ के लिए कदम 1.6.4 से नमूना पैराफिन ब्लॉक ट्रिम।
        2. कुछ इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर) cryostat मंच के केंद्र में जोड़े। cryostat चरण के लिए आयल ब्लॉक देते हैं और फिर जल्दी से वांछित स्थिति में ऊतक ब्लॉक उन्मुख।
        3. एक cryostat कक्ष में पैराफिन ब्लॉक / चरण स्थानांतरण। OCT 10 मिनट के लिए -42 डिग्री सेल्सियस पर त्वरित फ्रीज पट्टी पर जमना करने की अनुमति दें। अक्टूबर (चित्रा 2 सी) के solidification दौरान ब्लॉक कदम नहीं है।
        4. cryostat एडाप्टर और चैम्बर तापमान cryostat एडाप्टर के लिए आयल ब्लॉक / चरण संलग्न करने से पहले करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस और -16 डिग्री सेल्सियस क्रमशः शांत करने की अनुमति दें। मोटाई में 10 माइक्रोन के लिए धारा ऊतकों।
        5. संदंश के साथ ऊतक वर्गों उठाओ। एक पाली में 800 μl DEPC इलाज पानी पर वर्गों फ्लोट - एल - लाइसिन सीओएटेड स्लाइड और 42 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर स्लाइड हस्तांतरण।
        6. वर्गों 42 डिग्री सेल्सियस पर DEPC इलाज पानी पर समतल करने के लिए अनुमति दें। किनारे से पानी बंद के निकास के लिए फिल्टर पेपर का प्रयोग करें।
        7. रात भर एक 42 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर स्लाइड रखकर स्लाइड पर माउंट ऊतक।

      3. ऊतक धुंधला

      1. Deparaffinization
        1. गर्म थाली से स्लाइड ले लीजिए और उन्हें एक धुंधला रैक में जगह है। धूआं हुड में एक धुंधला जार में 150 मिलीलीटर xylene जोड़ें और 5 मिनट के लिए xylene में रैक विसर्जित कर दिया।
      2. पुनर्जलीकरण
        1. DEPC इलाज पानी में इथेनॉल समाधान के विभिन्न सांद्रता (100%, 95%, 70%, 50%, 30%) तैयार है और क्रमश: अलग धुंधला जार में समाधान की 150 मिलीलीटर भरने,।
        2. इथेनॉल एकाग्रता, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए हर कदम को कम करने की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूने rehydrate। धुंधला में स्लाइड स्थानांतरण एक और जार युक्त विकास के लिए एक जार रैकifferent इथेनॉल सांद्रता: 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, और 30% इथेनॉल।
        3. पुनर्जलीकरण के बाद, 3 मिनट के लिए DDH 2 हे में नमूनों को विसर्जित कर दिया।
      3. hematoxylin धुंधला
        1. 1.5 मिनट के लिए hematoxylin समाधान में ऊतक स्लाइड्स डुबो कर दाग ऊतकों के नमूनों।
        2. DDH में संक्षेप में कुल्ला 2 1 युक्त ओ - कुछ सेकंड के लिए 12 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के 2 बूँदें, और फिर DDH 2 ओ में संक्षेप में धोने
      4. निर्जलीकरण
        1. 30% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, और 100% इथेनॉल: कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण। 5 मिनट के लिए धूआं हुड में xylene साथ नमूनों साफ़ करें।
      5. बढ़ते
        1. स्लाइड पर xylene आधारित बढ़ते मध्यम का उचित रूप से 600 μl गिरा। ध्यान से नमूना पर एक coverslip जगह। अच्छी गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के गठन हवा के बुलबुले से बचें।
        2. स्लाइड सूखी रात भर हवा के लिए अनुमति दें। अगले दिन एक खुर्दबीन के नीचे नमूना निरीक्षण करें।
          नोट: छवियों नमूनों के आकार पर निर्भर करता 400X बढ़ाई 25X पर कब्जा कर लिया गया।

      4. स्वस्थानी संकरण में

      1. जांच संश्लेषण
        1. क्लोन Phalaenopsis Aphrodite एक्टिन जीन विशेष कोडिंग अनुक्रम का उपयोग प्राइमरों 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC -3 'और 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (242 बीपी पीसीआर amplicon पाने के लिए) और CyclinB1; प्राइमरों 1 जीन विशेष कोडिंग अनुक्रम का उपयोग 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG -3 ' और 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(327 बीपी पीसीआर amplicon पाने के लिए) में वर्णित 12 के रूप में।
        2. वैक्टर में विशेष कोडिंग दृश्यों ligate (जैसे, pGEMT) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार।
        3. digoxigenin उत्पन्न (डीआईजी) निर्माता अनुदेश के अनुसार लेबल SP6 / T7 डीआईजी शाही सेना लेबलिंग किट का उपयोग भावना और antisense जांचएस।
      2. सीटू संकरण में
        1. 2 एन डी और 3 तीसरी कक्षा कली ऊतक स्लाइस (10 माइक्रोन मोटाई) में कटौती का उपयोग कर उत्पन्न हाइब्रिड कट विधि, और लेपित स्लाइड पर स्लाइस माउंट।
        2. xylene में Deparaffinize ऊतक वर्गों (3.1.1 देखें), इथेनॉल की सांद्रता (3.2.2 देखें) को कम करने में rehydrate, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर साथ 2 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर को पचाने।
        3. प्रोटोकॉल के अनुसार सीटू संकरण में प्रदर्शन पहले के रूप में 59 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस CyclinB1 के लिए actin के लिए कुछ संशोधनों के, यानी साथ 11,13 वर्णित है, संकरण तापमान के साथ;। 1 संकरण 40 एनजी डीआईजी लेबल शाही सेना जांच के साथ स्लाइड।
        4. के रूप में वर्णित 11 संकरण संकेतों का पता लगाने के लिए nitroblue tetrazolium / 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl फॉस्फेट (एनबीटी / BCIP) समाधान का प्रयोग करें।

    Representative Results

    हाइब्रिड कट ऊतक वर्गों की वफ़ादारी बढ़ाता

    प्रजनन पुष्प संरचना का शरीर रचना विज्ञान को समझना ऑर्किड फूल में दीक्षा की अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, Phalaenopsis ऑर्किड में intracellular कैल्शियम oxalate क्रिस्टल के संचय इस तरह के अध्ययन के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम में आता है। सेक्शनिंग प्रक्रिया (चित्रा 1) के दौरान क्रिस्टल की वजह से फाड़ के साथ जुड़े समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, हम एक प्रणाली हम हाइब्रिड कट नामित विकसित की है। इस प्रोटोकॉल पारंपरिक आयल embedding और cryosection तकनीकों को जोड़ती है। हम पहली संकर कट Phalaenopsis आर्किड की कक्षा कलियों में, क्योंकि वे ऊतक कठोरता और उच्च क्रिस्टल सामग्री के लिए कुख्यात रहे हैं परीक्षण किया। (प्रोटोकॉल, 1.3 चरण देखें) कक्षा कली ऊतक 4% पीएफए ​​में तय की गई थी। सीरियल इथेनॉल निर्जलीकरण और पैराफिन मोम मैं के बादnfiltration, कक्षा कली एक आयल ब्लॉक में एम्बेडेड था। ब्लॉक सेक्शनिंग (2A चित्रा) से पहले एक उपयुक्त आकार के लिए छंटनी की गई थी। अक्टूबर के एक छोटी राशि तो cryostat चरण (चित्रा 2 बी) के केंद्र के लिए लागू किया गया था। पैराफिन ब्लॉक तो अक्टूबर के माध्यम से मंच का पालन किया गया था। चरण 10 मिनट के लिए एक cryostat में incubated था सेक्शनिंग (चित्रा -2) से पहले Oct की पूरी solidification अनुमति देने के लिए और फिर cryosection एक -16 में प्रदर्शन किया गया था डिग्री सेल्सियस कक्ष (चित्रा 2 डी)।

    एक तुलना के रूप में, एक आयल Phalaenopsis आर्किड की एक कक्षा कली युक्त ब्लॉक नियमित microtome सेक्शनिंग के अधीन था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, आयल रिबन के गंभीर फाड़ microtome सेक्शनिंग के बाद मनाया गया। ऊतक अखंडता और सेलुलर संरचना भी समझौता किया था (चित्रा 1 बी)। हाइब्रिड-कट, दूसरे हाथ पर,उत्पादन बरकरार ऊतक वर्गों (चित्रा 3 ए) संरक्षित संरचनात्मक अखंडता (चित्रा 3 बी) के साथ।

    के अनुप्रयोग पी के विभिन्न ऊतकों को हाइब्रिड कट Aphrodite

    आगे की हाइब्रिड कट ज़िम्मा का परीक्षण करने के लिए, हम Phalaenopsis ऑर्किड के विभिन्न ऊतकों का परीक्षण किया। यह अक्सर क्योंकि कठोर बीज कोट का अच्छा ऊतक अखंडता के साथ बीज के कुछ वर्गों में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, बीज की विस्तृत संरचनाओं सेक्शनिंग (चित्रा -4 ए) के बाद संरक्षित किया गया। जैसा कि चित्र -4 ए, प्रोटीन शरीर में दिखाया गया है, आम भंडारण उत्पादों 14, स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। हाइब्रिड कट भी सफलतापूर्वक काम किया है और एक महीने पुराने protocorm की शूटिंग के शिखर विभज्योतक (एक बीज से अंकुरित संरचना) (चित्रा 4 बी) के विस्तृत संरचनाओं दिखाया औरprotocorm तरह-निकायों (PLBs, चित्रा 4C)। Intracellular क्रिस्टल मोटी और रसीला पत्तियों पीएलबी। Phalaenopsis ऑर्किड के वर्गों में मनाया गया है और वे Crassulacean एसिड चयापचय (सीएएम) प्रकार प्रकाश संश्लेषण के 15 प्रदर्शन करते हैं। पत्ती की अनुप्रस्थ अनुभाग बड़े पर्णमध्यक कोशिकाओं और जाइलम और फ्लोएम (चित्रा 4D) युक्त संवहनी बंडलों दिखाया। कुछ रंध्र के उद्घाटन के दिन (चित्रा 4D) के दौरान abaxial पत्ती की सतह पर मनाया गया। वास्तव में, सीएएम पौधों कार्बन लाभ को अधिकतम करने के लिए, लेकिन एक साथ शुष्क परिस्थितियों 15,16 के तहत रात में अपने stomates खोलने के द्वारा पानी की कमी को कम विकसित हुआ। पी की जड़ शिखर विभज्योतक Aphrodite चित्रा 4E में दिखाया गया है। जड़ टिप कोशिकाओं क्रिस्टल, जो बहुत अच्छी तरह से सेक्शनिंग (चित्रा 4E) के बाद संरक्षित किया गया की एक महत्वपूर्ण संख्या को रोकने के लिए दिखाई दिया। युवा पुष्प spikes के अनुदैर्ध्य वर्गों informat प्रदान कीयुवा पुष्प primordials (चित्रा 4F) की वास्तुकला के बारे में आयन। इसके अलावा, बाह्यदल, पंखुड़ी, labellum, और pollinia स्पष्ट रूप से युवा फूल कलियों कि इस 5 मिमी फूल कली (चित्रा 4 जी) में भेदभाव पूरा कर लिया है के अनुदैर्ध्य अनुभाग से पहचाना जा सकता है। सूचना है कि क्रिस्टल युवा पुष्प कलियों के बाह्यदल में जमा किए गए थे। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल लगातार काम करता है ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए और संरचनात्मक और संभव सेलुलर अध्ययन को सक्षम करने बरकरार आकृति विज्ञान पैदा करता है।

    हाइब्रिड कट अनाज फसलों में ऊतक अखंडता को बरकरार रखता है

    हम यह भी हाइब्रिड कट जैसे चावल, गेहूं और मक्का के रूप में अनाज फसलों कि उच्च सिलिका सामग्री 17,18 होते हैं पर परीक्षण किया। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 5, चावल, गेहूं, मक्का और पत्तियों की अनुप्रस्थ वर्गों के ऊतक अखंडता काफी लुका द्वारा सुधार किया गयाBrid कट विधि। जाइलम, फ्लोएम, पर्णमध्यक कोशिकाओं, stomates, और bulliform कोशिकाओं है कि पत्ती पानी की कमी से बचने के लिए रोलिंग नियंत्रण स्पष्ट रूप से चावल के पत्तों के वर्गों से पहचान की गई। Kranz शरीर रचना विज्ञान, पर्णमध्यक कोशिकाओं, और मक्का पत्ती 19,20 के संवहनी बंडलों स्पष्ट रूप से पहचान की गई। यह मक्का पत्तियों (चित्रा 5) के दोनों adaxial और abaxial पक्षों पर stomates के एक उच्च घनत्व लगाने के लिए पेचीदा था। मक्का में 0.7 की adaxial और abaxial रंध्र के अनुपात से पहले 21 सूचित किया गया है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी चावल, गेहूं, मक्का और चित्रा (6) से spikelets की विस्तृत सेल आकृति विज्ञान प्रदान करने के लिए सफलतापूर्वक काम किया। Spikelets प्रचुर मात्रा में सिलिका 9 को रोकने के लिए जाना जाता है। आम तौर पर, कि ऊतक सेक्शनिंग के संचालन में कठिनाई का कारण बनता है।

    स्वस्थानी संकरण में

    में सीटू संकरण (ISH) ऊतक स्तर 11 पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न स्थानीयकरण करने के लिए विकसित किया गया है, 22-25। इसके अलावा, ईश सेलुलर प्रदान कर सकते हैं, और कुछ मामलों में उप सेलुलर, बहुकोशिकीय जीव 26 में mRNA वितरण का संकल्प। ISH के दौरान शाही सेना और ऊतक अखंडता का चयन किया प्रतिलेख के बारे में विश्वसनीय स्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। हम हाइब्रिड कट प्रोटोकॉल का उपयोग ISH परीक्षण किया एक्टिन जीन (PATC157348) प्राइमरों 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC -3 'और 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' 242 बीपी पीसीआर amplicon Cyclin बी 1 का उपयोग कर पाने के लिए क्लोन किया गया था:।। 1 (PATC146999) जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कोडिंग अनुक्रम 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'और 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC -3' पीसीआर amplicon 327 बीपी पाने के लिए। बाद ish, actin और Cyclin बी 1: 1 जीन अभिव्यक्ति युवा और परिपक्व कक्षा कलियों में नजर रखी थी (चित्रा 7)। दोनों जीन मजबूत संकेतों के साथ 3 कक्षा कलियों में पता चला, 2 एन डी और 3 तीसरी कक्षा कलियों की मेरिस्टेमेटिक कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे थे। ये परिणाम दिखा दिया है कि हाइब्रिड कट अच्छा शरीर रचना को बनाए रखने और स्थानिक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदान करते हैं।

    आकृति 1
    चित्रा 1: पारंपरिक आयल धारा ऊतक के गंभीर फाड़ कारण एक आयल Phalaenopsis आर्किड की एक कक्षा कली युक्त ब्लॉक नियमित microtome सेक्शनिंग के अधीन था।। पैराफिन रिबन के गंभीर फाड़ पारंपरिक microtome सेक्शनिंग के बाद मनाया गया (ए) (बी)। तीर ऊतक टुकड़ा के गंभीर फाड़ दिखा। Arrowhead क्रिस्टल शव पता चलता है। स्केल बार 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2:। हाइब्रिड कट सेक्शनिंग विधि एक कक्षा कली ऊतक पीएफए में तय की गई थी और ऊतकों, निर्जलित थे पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ, और एक तेल ब्लॉक में एम्बेडेड। पैराफिन ब्लॉक एक उपयुक्त आकार (ए) के लिए छंटनी की गई थी। इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर) cryostat मंच (बी) के केंद्र के लिए लागू किया गया था। पैराफिन ब्लॉक cryostat मंच पर अक्टूबर के जुड़ा था। कम तापमान के तहत, आयल ब्लॉक अक्टूबर (सी) के माध्यम से cryostat चरण का पालन किया गया था। ऊतक स्लाइस -16 डिग्री सेल्सियस (डी) पर cryostat कक्ष में sectioned थे। स्केल सलाखों 0.5 सेमी (ए), और 1 सेमी (बी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: हाइब्रिड कट धारा वफ़ादारी बढ़ाता एक आयल Phalaenopsis आर्किड की एक कक्षा कली युक्त ब्लॉक (ए) सेक्शनिंग करने के लिए हाइब्रिड कट अधीन था और हाइब्रिड कट विधि का उत्पादन उत्कृष्ट ऊतक अखंडता (बी) के साथ वर्गों।। नोक अंतर्जात क्रिस्टल शव कक्षा कली के ऊतकों में एम्बेडेड पता चलता है। स्केल बार 100 माइक्रोन।rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4:। हाइब्रिड कट Phalaenopsis ऑर्किड के विभिन्न ऊतक वर्गों के लिए अलग आर्किड के आवेदन ऊतकों ऐसे परिपक्व अवस्था (ए), protocorm के अनुदैर्ध्य खंड (बी), protocorm-जैसे निकायों के अनुदैर्ध्य खंड (पीएलबी) (सी), की अनुप्रस्थ अनुभाग के दौरान आर्किड बीज के अनुदैर्ध्य खंड के रूप में, हाइब्रिड कट विधि का प्रयोग कर रहे थे sectioned पत्ती (डी), रूट (ई) के अनुदैर्ध्य अनुभाग, युवा फूल कील (एफ), और युवा फूल कलियों (जी) के अनुदैर्ध्य अनुभाग के अनुदैर्ध्य अनुभाग। ऊतक वर्गों hematoxylin से दाग रहे थे। अनुसूचित जाति, बीज कोट; पंजाब, प्रोटीन शरीर; एम,विभज्योतक; सांसद, मां पीएलबी; डी पी, बेटी पीएलबी; विज्ञापन, adaxial पत्ती की सतह; Ab, abaxial पत्ती की सतह; सेंट, रंध्र; एम सी, पर्णमध्यक सेल; वीबी, नाड़ी बंडल; आर सी, जड़ टोपी; अमेरिकन प्लान, फूल कली; एसई, बाह्यदल; पे, पत्ती; ला, labellum; पो, pollinia; आरओ, rostellum; सीए, घट्टा। तीर क्रिस्टल दिखा। स्केल सलाखों प्रतिनिधित्व 20 माइक्रोन (एई) और 200 माइक्रोन (FG)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5:। हाइब्रिड कट कई अनाज फसलों में पत्ता ऊतक अखंडता को बरकरार रखता पारंपरिक आयल विधि (बाईं ओर के पैनल) और हाइब्रिड कट तकनीक इस अध्ययन (दाएँ हाथ के पैनल) में विकसित का उपयोग कर पत्ता ऊतक की तुलना। छवियाँ चावल, गेहूं, मक्का और पत्ती की अनुप्रस्थ वर्गों दिखा। एम सी, पर्णमध्यक सेल; पीएचडी, फ्लोएम; सेंट, रंध्र; ईसा पूर्व, बू lliform सेल। तीर ऊतक टुकड़ा फाड़ दिखा। तीर सिलिका शरीर दिखाने के लिए। नीले धराशायी हलकों सी 4 मक्का में Kranz शरीर रचना विज्ञान संकेत मिलता है। स्केल 20 माइक्रोन सलाखों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6:। हाइब्रिड कट कई अनाज फसलों में छोटी बाल ऊतक अखंडता को बरकरार रखता पारंपरिक आयल और हाइब्रिड कट तरीकों के बीच छोटी बाल वर्गों के ऊतक अखंडता की तुलना। तीर ऊतक टुकड़ा फाड़ दिखा। तीर सिलिका शव संकेत मिलता है। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन (चावल), और 200 माइक्रोन (गेहूं और मक्का)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 7
    चित्रा 7: actin और CyclinB1 की स्वस्थानी संकरण में; का Phalaenopsis आर्किड 2 एन डी कक्षा कलियों और 3 तीसरी कक्षा कली के ऊतक स्लाइस हाइब्रिड कट पद्धति का उपयोग करके तैयार किए गए कक्षा कली में 1 अभिव्यक्ति पैटर्न।। Actin और CyclinB1 के 40 एनजी के कुल, 1 डीआईजी लेबल जांच संकरण के लिए इस्तेमाल किया गया। भावना जांच एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। तीर कक्षा कली की प्रजनन विभज्योतक संकेत मिलता है। स्केल 100 माइक्रोन सलाखों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    Discussion

    संयंत्र कोशिकाओं कठोर सेल दीवारों, मुश्किल फाइबर, क्रिस्टल, और उच्च पानी सामग्री है कि संयंत्र के ऊतकों सेक्शनिंग दौरान ऊतक फाड़ समस्याओं का कारण है। हालांकि आयल आधारित सेक्शनिंग अक्सर संयंत्र के ऊतकों के लिए प्रयोग किया जाता है, अंतर्जात क्रिस्टल अक्सर (चित्रा 1) सेक्शनिंग के दौरान संयंत्र के ऊतकों फाड़ना। संयंत्र कोशिकाओं के भीतर स्वाभाविक उच्च पानी सामग्री की वजह से, cryostat आधारित सेक्शनिंग अक्सर टूटी हुई कोशिकाओं और टूट ऊतक वर्गों का कारण बनता है।

    वर्तमान अध्ययन में, एक संयुक्त आयल embedding और cryosection नामित हाइब्रिड कट प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और अच्छी गुणवत्ता के ऊतक वर्गों प्राप्त किया गया। इस प्रोटोकॉल आयल एम्बेडिंग शुरू करने से उच्च पानी सामग्री के साथ जुड़े समस्या का निराकरण करता है, और (चित्रा 3) सेक्शनिंग के दौरान कम तापमान के तहत पैराफिन मोम सख्त से फाड़ प्रभाव कम कर देता है। इसलिए, इस संशोधित प्रोटोकॉल या तो आयल आधारित धारा से ज्यादा फायदेमंद हैनिंग या संयंत्र के ऊतकों अखंडता बनाए रखने के लिए cryosectioning।

    इस पांडुलिपि को दर्शाता है कि हाइब्रिड कट तरीका है कि क्रिस्टल (आंकड़े 3-4) के उच्च स्तर होते हैं ऐसे कक्षा कली, बीज, और पीएलबी, आदि के रूप में Phalaenopsis ऑर्किड के कई ऊतकों में ऊतक अखंडता को बरकरार रखता है। इसके अलावा, इस तरह के प्रोटोकॉल का प्रजनन अंगों और चावल, मक्का के पत्ते, और गेहूं कि उच्च सिलिका (आंकड़े 5-6) होते हैं के रूप में अनाज फसलों के लिए उत्तरदायी है। मुमकिन है, इस प्रोटोकॉल उच्च फाइबर युक्त पौधों वुडी के लिए लागू किया जा सकता है।

    सामान्य तौर पर, फिक्सिंग के ऊतकों को अच्छी तरह से करने के लिए हाइब्रिड कट बहुत महत्वपूर्ण है। हमने पाया है कि formaldehyde-शराब-अम्लीय एसिड (एफएए) लगानेवाला से पीएफए ऐसे अक्षीय कलियों, जड़ें, आदि हालांकि, पीएफए आरएनए अखंडता बनाए रखने में एफएए से बेहतर काम करता के रूप में कुछ अड़ियल ऊतकों के ऊतक अखंडता की रक्षा करने के लिए बेहतर है। इसलिए पीएफए ​​ठीक करने के लिए सिफारिश की हैके लिए सीटू संकरण में (ISH) काम नमूना। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए ISH प्रयोग के लिए बनाया गया है। इसलिए, सभी अभिकर्मकों DEPC उपचार द्वारा RNase संदूषण को नष्ट करने से आरएनए गिरावट से बचने के लिए तैयार थे। हाइब्रिड कट अनुभाग संरचनात्मक अध्ययन, नियमित रूप से रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी के लिए ही है और उसके व्युत्पन्न बफर या अभिकर्मकों स्वीकार्य हैं।

    कम से कम 3 मिमी के लिए नमूना आकार और मोटाई कम करने घुसपैठ के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, निर्जलीकरण और घुसपैठ के लिए विसर्जन के समय बढ़ कठिन बनावट ऊतकों के लिए जरूरी हैं। इस प्रोटोकॉल की सीमा अपर्याप्त निर्धारण, निर्जलीकरण, और नमूना की घुसपैठ की वजह से समस्याओं के कारण हो सकता है। इसलिए, प्रत्येक चरण के लिए प्रसंस्करण समय का समायोजन अच्छी गुणवत्ता पैराफिन ब्लॉक के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। आम तौर पर, कठिन ऊतक लंबे समय तक नरम ऊतक से समय संसाधन की जरूरत है।

    इसके अलावा, हम पता चला है कि हाइब्रिड कट संयोजन वाई में सफलतापूर्वक काम कियावें ISH चुने गए टेप (चित्रा 7) के स्थानिक वितरण प्रदान करने के लिए। सारांश में, इस प्रोटोकॉल संयंत्र शरीर रचना विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयोगी है और चयनित जीनों के एक ऊतक विशेष आरएनए नक्शा प्रदान करता है। इसके अलावा यह इस तरह के टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांसफेरेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) परख, प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण में (मछली), और immunostaining तकनीक के रूप में अन्य आणविक अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। अंत में, यह सुधार ऊतक सेक्शनिंग प्रोटोकॉल दोनों उपयोगी और संयंत्र समुदायों में शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Embedding Center model EC780-1 CSA
    Microtome model RM2255 Leica
    Cryostat model CM 1950 Leica
    Axio Scope A1 microscope  Zeiss
    Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemia M0222.0050
    RNase free surface decontaminant Apex 10-228
    Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Bio Basic Inc.  D801154
    Sodium chloride (NaCl) MDBio, Inc. 101-7647-14-5
    Potassium chloride, crystal (KCl) J.T. Baker 7447-40-7
    Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
    Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 7778-77-0
    Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 16005
    Sodium hydroxide (NaOH) Showa 19430160
    Sulfuric acid (H2SO4) Sigma-Aldrich 7664-93-9
    Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich 111-30-8
    Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) J.T. Baker 9005-64-5
    Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) J.T. Baker 9002-93-1
    Glass scintillation vials Newastar DG60805-00020
    Desiccator vacuum Violet Bioscience Inc. TS-402030
    Rotary vane pump RZ2.5 Vacuubrand 36149406
    Ethanol J.T. Baker 64-17-5
    Sub-X  Leica Surgipath 3803670 Xylene substitute
    Paraplast Plus  Leica Surgipath 39602004 Tissue embedding paraffin
    SUPERFROST micro slide glass Matsunami S7441
    FSC 22 Clear  Leica Surgipath 3801480 Optimal Cutting Temperature compound (OCT) 
    Xylenes, Purified Leica Surgipath 3803665
    Hematoxylin Merck HX305311
    Hydrochloric acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
    Micromount Leica Surgipath 3801731 Mounting medium
    pGEM T-easy vector Promega A1360
    Proteinase K Roche 3115879001
    SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit Roche 11175025910
    NBT/BCIP stock solution Roche 11681451001

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
    2. Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
    3. Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
    4. Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
    5. Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
    6. Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
    7. Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
    8. Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
    9. Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
    10. Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
    11. Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
    12. Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
    13. Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
    14. Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
    15. Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
    16. Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
    17. Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
    18. Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
    19. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
    20. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
    21. Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
    22. Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
    23. Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
    24. Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
    25. Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
    26. Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).

    Tags

    प्लांट बायोलॉजी अंक 117 ऊतक अनुभाग क्रिस्टल सिलिका आयल microtome cryostat शरीर रचना विज्ञान आर्किड अनाज फसलों, जैविक अध्ययन
    हाइब्रिड-कट: अड़ियल संयंत्र के ऊतकों के नमूनों के लिए एक बेहतर सेक्शनिंग विधि
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Chen, T. K., Yang, H. T., Fang, S.… More

    Chen, T. K., Yang, H. T., Fang, S. C., Lien, Y. C., Yang, T. T., Ko, S. S. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. J. Vis. Exp. (117), e54754, doi:10.3791/54754 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter