This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Fastholdelse plante sektion integritet er væsentlig for at studere detaljerede anatomiske strukturer på cellulært, væv, eller endda organ niveau. Men nogle planteceller har stive cellevægge, hårde fibre og krystaller (calciumoxalat, silica, etc.), og højt vandindhold, der ofte forstyrrer væv integritet under plantevæv sektionering.
Denne undersøgelse etablerer en simpel Hybrid-Cut væv sektionering metode. Denne protokol ændrer en paraffin-baseret sektionering teknik og forbedrer integriteten af vævssnit fra forskellige planter. Plantevæv blev indlejret i paraffin, før sektionering i en kryostat ved -16 ° C. Sektionering under lav temperatur forhærdede paraffinblokke, reduceret tåreflåd og skrabe, og forbedret væv integritet væsentligt. Denne protokol blev anvendt med succes til calcium oxalat-rige Phalaenopsis orkidé væv samt genstridige væv såsom reproduktiv organs og blade af ris, majs, og hvede. Desuden kunne den høje kvalitet af vævssnit fra Hybrid-Cut anvendes i kombination med in situ hybridisering (ISH) for at tilvejebringe rumlige ekspressionsmønstre for gener af interesse. Afslutningsvis denne protokol er særlig nyttig til genstridige plantevæv med høj krystal eller silicaindhold. Gode vævssnit kvalitet muliggøre morfologiske og andre biologiske undersøgelser.
Den paraffin-baserede sektionering metoden er en udbredt teknik til anatomiske studier. Bevarelse af intakt væv anatomi er vigtig for morfologiske og biologiske undersøgelser. Den paraffinindlejret sektionering teknik er fordelagtig, fordi paraffin-embedding bevarer celler og væv morfologi. Desuden kan paraffinblokke opbevares bekvemt i lange perioder. Imidlertid paraffinindlejret sektionering er ikke egnet til plantevæv indeholdende intracellulære krystaller. Krystaller i cellerne ofte rive paraffin bånd og vævsskader integritet under sektionering.
I modsætning til paraffin sektionering, cryosectioning er relativt hurtig og sektioner kan opnås uden fiksering, seriel dehydrering eller indlejring medium infiltration 1. Kryosektioner er kompatible med mange anvendelser, såsom immunhistokemi, in situ-hybridisering og enzym histokemi. Den anden fordel ved cryosectioning erat denne metode ikke går igennem en potentiel denaturering processer såsom høj temperatur og kemiske behandlinger, er så cellulære molekyler velbevarede inden vævssnittene 2. Cryosectioning foretrækkes generelt frem paraffin-baseret sektionering til studier i dyrevæv. Men cryosectioning er ikke første valg i planter, fordi frysning temperatur til tider forårsager dannelse af iskrystaller, der påvirker kvaliteten af afsnittet integritet. Selvom osmoregulering såsom saccharose opløsninger, polyethylenglycol (PEG), eller glycerol-3 er rapporteret at reducere krystal isdannelse under frysebetingelser, forbedringen er mindre end optimal.
For at tilpasse sig forskellige miljøer, forskellige planter har ofte forskellige væv tekstur og planteceller har udviklet sig til at danne stive cellevægge, hårde fibre og krystaller 4,5. For eksempel uopløselige calcium oxalat krystaller og silica organer er ret almindelig iplanter 6. Silikat organer / krystaller er blevet rapporteret til at hjælpe med at opretholde plante arkitektur, erectness, og forebygge sygdom eller skadedyr i korn planter 7-9.
De syltet orkideer og cut-blomst orkidé markedet blomstrer, og det er en voksende industri. Phalaenopsis aphrodite (orkidé) er en af de vigtigste eksportmarkeder prydplanter i Taiwan. Der er gjort en betydelig indsats for at forstå de morfologiske og fysiologiske ændringer i de blomstrende processer i Phalaenopsis orkidéer. Blomster pigge Phalaenopsis orkidéer initieres fra armhulen knopper på bladet base. Efter en periode med køligt omgivende temperatur (ca. halvanden måned), armhulen knopper forstørre, bryde vækstdvale, og rage fra bladet basen at udvikle sig til unge blomster pigge. For at forstå de fysiologiske, cellulære og molekylære processer i spike indledning, er det nødvendigt at udvikle en robust anatomisk teknik til udstyr og forretniLize væv eller markører i tide. Tilstedeværelsen af allestedsnærværende krystaller i orchid væv, især i armhulen knopper, gør anatomiske arbejde vanskelig.
Her søgte vi at forbedre sektion integriteten af genstridige plantevæv, der hidtil har været betragtet som teknisk udfordrende. Her viser vi en forbedret protokol hedder Hybrid-Cut. Det er en paraffin-baseret sektionering metode, der udføres ved anvendelse af en kryostat. Paraffin indlejring løser højt vandindhold i plantevæv. Sektionering under lav temperatur hærder paraffinblokken, reducerer krystal rive problem, og forbedrer vævsintegritet betydeligt. Denne protokol forbedrer vævsintegritet for genstridige vegetabilske prøver betydeligt.
Plant celler har stive cellevægge, hårde fibre, krystaller, og højt vandindhold, der forårsager væv rive problemer under plantevæv sektionering. Selvom paraffin-baserede sektionering bruges ofte til plantevæv, de endogene krystaller ofte lacerate plantevævet ved skæring (figur 1). På grund af den iboende høje vandindhold i plantecellerne, kryostat-baserede sektionering ofte forårsager brudte celler og krakket vævssnit.
I den foreliggende undersøgelse blev en kombineret paraffin-indlejring og kryosektion protokol navngivet Hybrid-Cut udviklet og god vævssnit kvalitet blev opnået. Denne protokol løser problemet forbundet med højt vandindhold ved indføring paraffinindlejring og reducerer rivning virkning ved hærdning paraffinvoks under lav temperatur under sektionering (figur 3). Derfor er denne modificeret protokol er fordelagtig i forhold enten paraffin-baseret sektionning eller cryosectioning for at bevare plantevæv integritet.
Dette håndskrift viser, at Hybrid-Cut metode bevarer væv integritet i mange væv af Phalaenopsis orkidé såsom aksillær opløbet, frø, og PLB mv, der indeholder høje niveauer af krystaller (figur 3-4). Desuden er denne protokol er modtagelig for kornafgrøder såsom reproduktionsorganer og blade af ris, majs og hvede, der indeholder høj silica (figur 5-6). Formentlig kan denne protokol anvendes på træagtige planter, der indeholder højt fiberindhold.
Generelt fastsættelse væv grundigt er meget vigtigt for Hybrid-Cut. Vi fandt, at formaldehyd-alkohol-sure syre (FAA) fiksativ er bedre end PFA til at bevare vævet integritet nogle genstridige væv såsom aksialt knopper, rødder, osv Men virker bedre end FAA i at bevare RNA integritet, PFA. Derfor anbefales PFA at fastsætteprøve til in situ hybridisering (ISH) arbejde. Protokollen beskrevet her er designet til RNA ISH eksperiment. Derfor blev alle reagenser fremstillet for at undgå RNA-nedbrydning ved at fjerne RNase forurening med DEPC behandling. Hvis Hybrid-Cut afsnit er for anatomiske studier, regelmæssig omvendt osmose (RO) vand og dets afledte buffer eller reagenser er acceptable.
Reduktion eksemplar størrelse og tykkelse til mindre end 3 mm er nyttigt for infiltration. Desuden øger nedsænkning tid til dehydrering og infiltration er nødvendige for hårde tekstur væv. Begrænsning af denne protokol kan på grund af problemer forårsaget af utilstrækkelig fiksering, dehydrering, og infiltration af prøven. Derfor justering af behandlingstiden for hvert trin er afgørende for at producere god kvalitet paraffin blok. Normalt hårdere væv kræver længere behandlingstid end blødere væv.
Desuden viste vi, at Hybrid-Cut fungeret tilfredsstillende i kombination with ISH at tilvejebringe rumlige fordeling af de udvalgte transkripter (figur 7). Sammenfattende denne protokol er nyttig til studiet af planten anatomi og tilvejebringer en vævsspecifik RNA kort over de udvalgte gener. Derudover kan det anvendes til andre molekylære undersøgelser såsom terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og Immunofarvning teknikker. Afslutningsvis denne forbedrede væv sektionering protokollen er både nyttig og hjælpsom for forskere i plantesamfund.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |