This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
बनाए रखने संयंत्र खंड अखंडता सेलुलर, ऊतक, या भी अंग स्तर पर विस्तृत शारीरिक संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, कुछ संयंत्र कोशिकाओं कठोर सेल दीवारों, मुश्किल फाइबर और क्रिस्टल (कैल्शियम oxalate, सिलिका, आदि), और उच्च पानी सामग्री अक्सर संयंत्र के ऊतकों सेक्शनिंग दौरान ऊतक अखंडता को बाधित करता है।
इस अध्ययन के लिए एक सरल हाइब्रिड कट ऊतक सेक्शनिंग विधि स्थापित करता है। इस प्रोटोकॉल एक आयल आधारित सेक्शनिंग तकनीक को संशोधित करता है और विभिन्न पौधों से ऊतक वर्गों की अखंडता को बेहतर बनाता है। संयंत्र के ऊतकों -16 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat में सेक्शनिंग पहले पैराफिन में एम्बेडेड थे। कम तापमान के तहत सेक्शनिंग पैराफिन ब्लॉकों, कम फाड़ और scratching, और बेहतर ऊतक अखंडता काफी कठोर। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्रजनन संगठनों के रूप में कैल्शियम oxalate युक्त Phalaenopsis आर्किड ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से अड़ियल ऊतकों को लागू किया गया थाएनएस और चावल, मक्का और गेहूं की पत्तियों। इसके अलावा, हाइब्रिड से कट ऊतक वर्गों की उच्च गुणवत्ता सीटू संकरण (ISH) के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है ब्याज की जीन के स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदान करने के लिए। अंत में, इस प्रोटोकॉल उच्च क्रिस्टल या सिलिका सामग्री युक्त अड़ियल संयंत्र के ऊतकों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। अच्छी गुणवत्ता ऊतक वर्गों रूपात्मक और अन्य जैविक अध्ययन सक्षम करें।
आयल आधारित सेक्शनिंग विधि संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है। बरकरार ऊतक शरीर रचना विज्ञान के संरक्षण रूपात्मक और जैविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि आयल एम्बेडिंग सेल और ऊतक आकृति विज्ञान को बरकरार रखे हुए आयल एम्बेडेड सेक्शनिंग तकनीक फायदेमंद है। इसके अलावा, आयल ब्लॉकों समय की लंबी अवधि के लिए आसानी से संग्रहित किया जा सकता है। हालांकि, आयल एम्बेडेड सेक्शनिंग संयंत्र intracellular क्रिस्टल युक्त ऊतकों के लिए उपयुक्त नहीं है। कोशिकाओं के भीतर क्रिस्टल अक्सर सेक्शनिंग दौरान आयल रिबन और नुकसान ऊतक अखंडता आंसू।
पैराफिन सेक्शनिंग के विपरीत, cryosectioning अपेक्षाकृत तेज है और वर्गों के निर्धारण, सीरियल निर्जलीकरण या मध्यम घुसपैठ 1 embedding के बिना प्राप्त किया जा सकता है। Cryosections में सीटू संकरण ऐसे immunohistochemistry के रूप में कई अनुप्रयोगों, और एंजाइम ऊतकरसायनविज्ञान के साथ संगत कर रहे हैं। cryosectioning के अन्य लाभ यह हैकि इस विधि में इस तरह के उच्च तापमान और रासायनिक उपचार के रूप में एक संभावित विकृतीकरण प्रक्रियाओं के माध्यम से जाना नहीं है, तो सेलुलर अणुओं अच्छी तरह से ऊतक वर्गों 2 के भीतर संरक्षित कर रहे हैं। Cryosectioning आम तौर पर आयल आधारित जानवरों के ऊतकों में पढ़ाई के लिए सेक्शनिंग अधिक पसंद है। हालांकि, cryosectioning पौधों में पहली पसंद है क्योंकि ठंड तापमान कभी कभी बर्फ क्रिस्टल कि खंड अखंडता की गुणवत्ता को प्रभावित के गठन का कारण बनता नहीं है। हालांकि इस तरह के osmoregulation सूक्रोज समाधान, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), या ग्लिसरॉल 3 के रूप में ठंड की स्थिति के तहत क्रिस्टल बर्फ गठन को कम करने के लिए सूचित किया गया है, सुधार इष्टतम से कम है।
विभिन्न वातावरण के लिए अनुकूल करने के लिए, विभिन्न पौधों अक्सर अलग ऊतक बनावट और संयंत्र कोशिकाओं कठोर सेल दीवारों, मुश्किल फाइबर, और क्रिस्टल 4,5 फार्म के लिए विकसित किया है। उदाहरण के लिए, अघुलनशील कैल्शियम oxalate क्रिस्टल और सिलिका निकायों में काफी आम हैंपौधों 6। सिलिकेट निकायों / क्रिस्टल मदद संयंत्र वास्तुकला, सीधापन को बनाए रखने, और अनाज के पौधे 7-9 में रोग या कीट को रोकने के लिए सूचित किया गया है।
कमरों का ऑर्किड और कट-फूल आर्किड बाजार पनप रहा है और यह एक उद्योग बढ़ रहा है। Phalaenopsis Aphrodite (कीट आर्किड) ताइवान में सबसे महत्वपूर्ण निर्यात सजावटी पौधों में से एक है। महत्वपूर्ण प्रयास Phalaenopsis ऑर्किड में फूल प्रक्रियाओं की रूपात्मक और शारीरिक परिवर्तन को समझने के लिए बनाया गया है। Phalaenopsis ऑर्किड के पुष्प spikes पत्ता आधार पर कक्षा कलियों से शुरू कर रहे हैं। शांत परिवेश के तापमान की अवधि के बाद (लगभग डेढ़ महीने), कक्षा कलियों विस्तार, निद्रा को तोड़ने, और पत्ता आधार से बहर युवा पुष्प spikes में विकसित करने के लिए। शारीरिक, सेलुलर, और कील दीक्षा की आणविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए, यह visua के लिए एक मजबूत शारीरिक तकनीक विकसित करने के लिए आवश्यक हैLize ऊतकों या एक समय पर ढंग से मार्करों। हालांकि, आर्किड ऊतकों में सर्वव्यापी क्रिस्टल की उपस्थिति, विशेष रूप से कक्षा कलियों में, संरचनात्मक काम कठिन बना देता है।
यहाँ हम अड़ियल संयंत्र के ऊतकों है कि अब तक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण के रूप में माना गया की धारा अखंडता में सुधार करने की मांग की। यहाँ हम एक बेहतर प्रोटोकॉल नामित हाइब्रिड कट दिखा। यह एक आयल आधारित सेक्शनिंग तरीका है कि एक cryostat का उपयोग किया जाता है। आयल एम्बेडिंग संयंत्र के ऊतकों में उच्च पानी सामग्री का निराकरण। कम तापमान के तहत सेक्शनिंग पैराफिन ब्लॉक मज़बूत बनाता है, समस्या फाड़ क्रिस्टल कम कर देता है, और काफी ऊतक अखंडता को बेहतर बनाता है। इस प्रोटोकॉल में काफी अड़ियल संयंत्र के नमूने के लिए ऊतक अखंडता को बेहतर बनाता है।
संयंत्र कोशिकाओं कठोर सेल दीवारों, मुश्किल फाइबर, क्रिस्टल, और उच्च पानी सामग्री है कि संयंत्र के ऊतकों सेक्शनिंग दौरान ऊतक फाड़ समस्याओं का कारण है। हालांकि आयल आधारित सेक्शनिंग अक्सर संयंत्र के ऊतकों के लिए प्रयोग किया जाता है, अंतर्जात क्रिस्टल अक्सर (चित्रा 1) सेक्शनिंग के दौरान संयंत्र के ऊतकों फाड़ना। संयंत्र कोशिकाओं के भीतर स्वाभाविक उच्च पानी सामग्री की वजह से, cryostat आधारित सेक्शनिंग अक्सर टूटी हुई कोशिकाओं और टूट ऊतक वर्गों का कारण बनता है।
वर्तमान अध्ययन में, एक संयुक्त आयल embedding और cryosection नामित हाइब्रिड कट प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और अच्छी गुणवत्ता के ऊतक वर्गों प्राप्त किया गया। इस प्रोटोकॉल आयल एम्बेडिंग शुरू करने से उच्च पानी सामग्री के साथ जुड़े समस्या का निराकरण करता है, और (चित्रा 3) सेक्शनिंग के दौरान कम तापमान के तहत पैराफिन मोम सख्त से फाड़ प्रभाव कम कर देता है। इसलिए, इस संशोधित प्रोटोकॉल या तो आयल आधारित धारा से ज्यादा फायदेमंद हैनिंग या संयंत्र के ऊतकों अखंडता बनाए रखने के लिए cryosectioning।
इस पांडुलिपि को दर्शाता है कि हाइब्रिड कट तरीका है कि क्रिस्टल (आंकड़े 3-4) के उच्च स्तर होते हैं ऐसे कक्षा कली, बीज, और पीएलबी, आदि के रूप में Phalaenopsis ऑर्किड के कई ऊतकों में ऊतक अखंडता को बरकरार रखता है। इसके अलावा, इस तरह के प्रोटोकॉल का प्रजनन अंगों और चावल, मक्का के पत्ते, और गेहूं कि उच्च सिलिका (आंकड़े 5-6) होते हैं के रूप में अनाज फसलों के लिए उत्तरदायी है। मुमकिन है, इस प्रोटोकॉल उच्च फाइबर युक्त पौधों वुडी के लिए लागू किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, फिक्सिंग के ऊतकों को अच्छी तरह से करने के लिए हाइब्रिड कट बहुत महत्वपूर्ण है। हमने पाया है कि formaldehyde-शराब-अम्लीय एसिड (एफएए) लगानेवाला से पीएफए ऐसे अक्षीय कलियों, जड़ें, आदि हालांकि, पीएफए आरएनए अखंडता बनाए रखने में एफएए से बेहतर काम करता के रूप में कुछ अड़ियल ऊतकों के ऊतक अखंडता की रक्षा करने के लिए बेहतर है। इसलिए पीएफए ठीक करने के लिए सिफारिश की हैके लिए सीटू संकरण में (ISH) काम नमूना। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए ISH प्रयोग के लिए बनाया गया है। इसलिए, सभी अभिकर्मकों DEPC उपचार द्वारा RNase संदूषण को नष्ट करने से आरएनए गिरावट से बचने के लिए तैयार थे। हाइब्रिड कट अनुभाग संरचनात्मक अध्ययन, नियमित रूप से रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी के लिए ही है और उसके व्युत्पन्न बफर या अभिकर्मकों स्वीकार्य हैं।
कम से कम 3 मिमी के लिए नमूना आकार और मोटाई कम करने घुसपैठ के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, निर्जलीकरण और घुसपैठ के लिए विसर्जन के समय बढ़ कठिन बनावट ऊतकों के लिए जरूरी हैं। इस प्रोटोकॉल की सीमा अपर्याप्त निर्धारण, निर्जलीकरण, और नमूना की घुसपैठ की वजह से समस्याओं के कारण हो सकता है। इसलिए, प्रत्येक चरण के लिए प्रसंस्करण समय का समायोजन अच्छी गुणवत्ता पैराफिन ब्लॉक के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। आम तौर पर, कठिन ऊतक लंबे समय तक नरम ऊतक से समय संसाधन की जरूरत है।
इसके अलावा, हम पता चला है कि हाइब्रिड कट संयोजन वाई में सफलतापूर्वक काम कियावें ISH चुने गए टेप (चित्रा 7) के स्थानिक वितरण प्रदान करने के लिए। सारांश में, इस प्रोटोकॉल संयंत्र शरीर रचना विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयोगी है और चयनित जीनों के एक ऊतक विशेष आरएनए नक्शा प्रदान करता है। इसके अलावा यह इस तरह के टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांसफेरेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) परख, प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण में (मछली), और immunostaining तकनीक के रूप में अन्य आणविक अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। अंत में, यह सुधार ऊतक सेक्शनिंग प्रोटोकॉल दोनों उपयोगी और संयंत्र समुदायों में शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है।
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |