This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
식물 부분의 무결성을 유지하는 세포, 조직, 또는 기관 수준에서 해부학 적 구조의 상세한 연구를 위해 필수적이다. 그러나, 일부 식물 세포는 단단한 세포벽 강인한 섬유 결정을 (옥살산 칼슘, 실리카 등), 및 높은 수분 함량은 종종 식물 조직 절편 동안 조직의 무결성을 파괴하는.
이 연구는 간단한 하이브리드 잘라 조직 절편 방법을 설정합니다. 이 프로토콜은 파라핀 계 단면 기법을 수정 및 다른 식물의 조직 절편의 무결성을 향상시킨다. 식물 조직은 -16 ℃에서 저온 유지 장치 (cryostat)에 절편 전에 파라핀 하였다. 파라핀 블록, 감소 찢어 및 긁힘, 크게 개선 된 조직의 무결성은 낮은 온도에서을 경화 단면. 이 프로토콜은 성공적으로 생식 ORGA 칼슘 옥살 레이트 풍부한 호 접 난초 조직뿐만 아니라 난 분해성 조직에 적용 하였다NS, 쌀, 옥수수, 밀 잎. 또한, 하이브리드 컷 조직 절편의 높은 품질은 관심 유전자의 발현 패턴의 공간을 제공하기 위해 원위치 혼성화 (ISH)의 병용 할 수있다. 결론적으로,이 프로토콜은 높은 결정 실리카 함량을 함유 분해성 식물 조직에 특히 유용하다. 좋은 품질의 조직 섹션은 형태 학적 및 기타 생물학적 연구를 할 수 있습니다.
파라핀 계 단면 처리 방법은, 해부학 적 연구가 광범위하게 사용되는 기술이다. 손상 조직의 해부학의 보존 형태 학적 및 생물학적 연구에 중요하다. 파라핀이 매립 세포 및 조직 형태를 유지하고 있기 때문에, 파라핀 포매 절편 기술이 유리하다. 또한, 파라핀 블록은 오랫동안 편리하게 저장 될 수있다. 그러나, 파라핀 절편 세포 내 결정을 포함하는 식물 조직에 적합하지 않다. 세포 내 결정은 종종 절편 동안 파라핀 리본과 손상 조직의 무결성을 찢어.
파라핀 절편 달리 저온 절편 비교적 빠르며 섹션은 고정 직렬 탈수 또는 중간 침투 한 매립하지 않고 얻을 수있다. 저온부 많은 같은 면역와 같은 응용 프로그램에서 현장 하이브리드 및 효소 조직 화학와 호환됩니다. 냉동 절편의 또 다른 장점은이 방법은 높은 온도와 화학적 처리 등의 잠재적 인 변성 과정을 통과하지 않는, 그래서 세포 분자 잘 조직 2 항 내에서 유지됩니다. 냉동 절편은 일반적으로 파라핀 계 동물 조직에서의 연구에 절편 위에 바람직하다. 온도 차는 것은 때때로 부분의 무결성의 품질에 영향을 얼음 결정의 형성을 초래하기 때문에, 저온 절편 식물의 첫번째 선택이 아니다. 삼투는 수 크로스 용액, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 글리세롤 (3)로 동결 조건 결정 얼음 형성을 감소하는 것으로보고되었지만, 개선 최적 이하이다.
서로 다른 환경에 적응하기 위해 다른 식물은 종종 별개의 조직 질감과 식물 세포가 단단한 세포벽, 거친 섬유 및 결정 4,5를 형성하기 위해 진화해야합니다. 예를 들어, 불용성 칼슘 옥살 레이트 결정 실리카 몸은 비슷한 공통식물 6. 규산 몸은 / 결정 공장 건축, erectness을 유지하는 데 도움이, 시리얼 공장 7-9에서 질병이나 해충을 방지하기 위해보고되었다.
화분에 심는 난초와 컷 꽃 난초 시장이 번성하고, 그것은 성장하는 산업이다. 접 아프로디테 (엄 난초)는 대만에서 가장 중요한 수출 관상용 식물 중 하나입니다. 상당한 노력이 접 난초의 꽃 프로세스의 형태 학적 및 생리 학적 변화를 이해하게되었습니다. 호 접 난초의 꽃 스파이크는 잎 기지에서 겨드랑이 싹에서 시작됩니다. 멋진 주변 온도의 기간 후에 (약 반 개월), 겨드랑이 싹이 확대, 휴면 휴식, 젊은 꽃 스파이크로 개발하기 위해 잎 기지에서 돌출. 생리 학적, 세포 및 스파이크 개시 분자 과정을 이해하기 위해서는 visua하는 해부학 강력한 기술을 개발하는 것이 필수적이다적시에 리제 조직 또는 마커. 그러나, 런 조직에서 편재 결정의 존재는 특히 겨드랑이 싹 해부학 작업이 곤란한다.
여기에서 우리는 지금까지 기술적 도전으로 간주 된 난 분해성 식물 조직의 섹션의 무결성을 개선하기 위해 노력했다. 여기에서 우리는 하이브리드 컷라는 이름의 개선 된 프로토콜을 보여줍니다. 이는 저온 유지 장치를 이용하여 수행되는 파라핀 계 단면 처리 방법이다. 파라핀 삽입은 식물 조직에서 높은 수분 함량을 해결합니다. 파라핀 블록은 낮은 온도에서 경화 단면, 문제를 찢어 결정을 줄이고, 상당히 조직의 무결성을 향상시킨다. 이 프로토콜은 크게 완강히 저항하는 식물 샘플에 대한 조직의 무결성을 향상시킨다.
식물 세포는 식물 조직 절편 동안 조직 인열 문제를 일으킬 단단한 세포벽 강인한 섬유, 결정, 높은 수분 함량을 갖는다. 파라핀 계 단면 자주 식물 조직에 사용 되더라도 내인성 결정들은 (도 1) 절편 동안 식물 조직을 가르기. 때문에 식물 세포 내에서 본질적으로 높은 수분 함량, 저온 유지 절편 기반 자주 끊어 세포 금 조직 절편시킨다.
본 연구에서는 하이브리드 컷라는 이름의 결합 파라핀 삽입 및 동결 절단 (Cryosections) 프로토콜을 개발하고 좋은 품질의 조직 절편을 얻었다. 이 프로토콜은 파라핀 삽입을 도입하여 높은 수분 함량과 관련된 문제를 해결하고, (그림 3) 절편 동안 낮은 온도에서 파라핀 왁스를 경화에 의해 찢어 효과를 감소시킨다. 따라서이 수정 된 프로토콜은 하나 파라핀 기반 SECTIO 이상 유리하다닝 또는 식물 조직의 무결성을 유지하기위한 냉동 절편.
이 원고는 하이브리드 컷 방법 결정 (그림 3-4)의 높은 수준을 포함하는 등 겨드랑이 새싹, 씨앗, 그리고 PLB, 같은 호 접 난초의 많은 조직에서 조직의 무결성을 유지 것을 보여줍니다. 또한,이 프로토콜은 높은 실리카 (그림 5-6)를 포함 생식 기관, 쌀, 옥수수 잎, 밀 같은 곡물 의무가 있습니다. 아마도,이 프로토콜은 높은 섬유를 함유하는 우디 플랜트에 적용될 수있다.
일반적으로, 고정 조직은 철저히 하이브리드 컷 매우 중요하다. 우리는 포름 알데히드 알코올 산성 산 (FAA) 정착는 PFA는 축 방향 등 싹, 뿌리, 그러나, PFA는 RNA의 무결성을 보존에 FAA보다 더 나은 작품으로 일부 완강히 저항하는 조직의 조직 무결성을 유지하는 것보다 낫다 발견했다. 따라서 PFA는 해결하는 것이 좋습니다현장 하이브리드에서 (ISH) 작업 샘플. 여기에 설명 된 프로토콜을 RNA ISH 실험을 위해 설계된다. 따라서, 모든 시약은 DEPC 처리 된 RNase하여 오염을 제거하여 RNA 분해를 방지하기 위해 제조 하였다. 하이브리드 컷 부분은 해부학 적 연구, 일반 역 삼투압 (RO) 물과 파생 버퍼 또는 시약은 허용합니다.
3 mm 이하로 시험편 크기 및 두께를 감소하기위한 침투 유용하다. 또한, 탈수 및 침투에 대한 증가 침지 시간은 하드 질감 조직을 위해 필요하다. 이 프로토콜의 제한은 불충분 한 고정, 탈수, 그리고 시편의 침투로 인한 문제로 인해 수 있습니다. 따라서, 각 단계에 대한 처리 시간의 조정은 우수한 파라핀 블록을 생성하는 것이 중요하다. 일반적으로, 더 열심히 조직은 부드러운 조직보다 처리 시간 이상이 필요합니다.
또한, 우리는 하이브리드 컷 조합 위스콘신에서 성공적 일 것으로 나타났다제 ISH 선택된 사체 (도 7)의 공간 분포를 제공한다. 요약하면,이 프로토콜은 식물 해부학의 연구에 유용하고, 선택된 유전자의 조직 특이 적 RNA지도를 제공합니다. 또한 그러한 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석, 형광성 원위치 하이브리드 화 (FISH), 및 면역 기술과 같은 다른 분자 연구에 적용될 수있다. 결론적으로,이 개선 된 조직 절편 프로토콜은 유용하고 식물 사회 연구원에 도움이 둘입니다.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |