This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Поддержание целостности раздела растений имеет важное значение для изучения детальных анатомических структур на клеточном, тканевом, или даже органной уровне. Тем не менее, некоторые растительные клетки имеют жесткие клеточные стенки, жесткие волокна и кристаллы (оксалат кальция, диоксид кремния и т.д.), и высокое содержание воды , что часто нарушают целостность ткани в процессе секционирования растительной ткани.
Это исследование устанавливает простой Гибрид-Cut ткани метод секционирования. Этот протокол изменяет основе парафина метод секционирования и улучшает целостность срезов тканей из различных растений. Растительные ткани заключали в парафин, прежде чем секционирования в криостате при -16 ° С. Секционирование при низкой температуре закаленные парафиновые блоки, уменьшается разрыв и ломают, а также улучшение целостности ткани значительно. Этот протокол был успешно применен для кальция оксалата богатых тканей фаленопсис орхидеи, а также непокорных тканей , таких как репродуктивное органинс и листья риса, кукурузы и пшеницы. Кроме того, высокое качество срезов ткани гибридно-Cut может быть использован в сочетании с гибридизация (МОГ) , чтобы обеспечить пространственное характер экспрессии генов , представляющих интерес. В заключение, этот протокол особенно полезен для непокорной ткани растений с высоким содержанием кристалл или содержание кремнезема. Хорошие срезы ткани качества позволяют морфологические и другие биологические исследования.
Основе парафина метод секционирования является широко используемым методом для анатомических исследований. Сохранение анатомии неповрежденной ткани имеет важное значение для морфологических и биологических исследований. Парафин метод секционирования является предпочтительным, так как парафин-вложение сохраняет клеток и тканей морфологии. Кроме того, парафиновые блоки могут быть сохранены удобно в течение длительных периодов времени. Тем не менее, парафин секционирования не подходит для тканей растений, содержащих внутриклеточные кристаллы. Кристаллы в клетках часто слезу парафиновые ленты и целостности повреждения тканей во время секционирования.
В отличие от парафина секционирования, cryosectioning сравнительно быстро и секций можно получить без фиксации, серийный дегидратации или вложение среды инфильтрацию 1. Криосрезах совместимы со многими приложениями , такими как иммуногистохимии, на месте гибридизации и фермента гистохимии. Другим преимуществом является cryosectioningчто этот метод не проходит через потенциальный процессы денатурации , таких как высокая температура и химической обработки, так что клеточные молекулы хорошо сохранились в срезах ткани 2. Cryosectioning, как правило, предпочтительнее на основе парафина секционирования для исследований в тканях животных. Однако cryosectioning не первый выбор в растениях, так как температура замерзания иногда вызывает образование кристаллов льда, которые влияют на качество целостности раздела. Хотя осморегуляция такие как растворы сахарозы, полиэтиленгликоль (PEG) или глицерин 3 Сообщалось , чтобы уменьшить образование кристаллов льда в условиях замораживания, улучшение меньше оптимального.
Для того, чтобы адаптироваться к различным средам, разные растения часто имеют различные текстуры ткани и клетки растений развились , чтобы сформировать жесткие клеточные стенки, жесткие волокна и кристаллы 4,5. Например, нерастворимые кристаллы оксалата кальция и кремния тела являются довольно распространенными врастения 6. Силикатные тела / кристаллов сообщили , чтобы помочь сохранить архитектуру растений, erectness и профилактики заболеваний или вредителей в злаковых растений 7-9.
Горшечных орхидей и вырезать цветок орхидеи рынок процветает , и это растущая отрасль. Фаленопсис Aphrodite (моли орхидеи) является одним из наиболее важных экспортных декоративных растений в Тайване. Значительные усилия были предприняты , чтобы понять морфологические и физиологические изменения цветущих процессов в Phalaenopsis орхидеи. Цветочные шипы Phalaenopsis орхидеи инициируются из пазушных почек у основания листа. После периода прохладной температуры окружающей среды (примерно полтора месяца), пазушные почки увеличить, нарушения покоя, и выступать из основания листа, чтобы превратиться в молодых цветочных шипов. Чтобы понять физиологические, клеточном и молекулярные процессы инициации спайка, необходимо разработать надежную анатомическую технику для visuaткани или маркеры тивно своевременно. Тем не менее, присутствие вездесущих кристаллов в тканях орхидеи, особенно в пазушных почек, делает анатомический работу трудно.
Здесь мы стремились улучшить целостность сечения непокорных растительных тканей, которые были до настоящего времени считались технически сложной задачей. Здесь мы показываем улучшенный протокол под названием Hybrid-Cut. Это на основе парафина метод секционирования, который выполняется с помощью криостата. Парафин вложение устраняет высокое содержание воды в растительной ткани. Секционирование при низкой температуре твердеет парафиновый блок, уменьшает слезотечение кристалл проблемы, а также значительно улучшает целостность тканей. Этот протокол значительно улучшает целостность тканей для непокорных образцов растений.
Клетки растений имеют жесткие клеточные стенки, жесткие волокна, кристаллы, и высокое содержание воды, которые вызывают проблемы, разрывая ткани во время секционирования растительной ткани. Несмотря на то, парафин на основе секционирования часто используется для растительных тканей, эндогенные кристаллы часто разрывают ткани растений во время секционирования (Рисунок 1). Из-за своей природе высоким содержанием воды в клетках растений, криостат на основе секционирования часто вызывает разрушенных клеток и шершавой срезах тканей.
В настоящем исследовании, комбинированный протокол парафино-вложение и cryosection названный Гибрид-Cut был разработан и были получены хорошие срезы ткани качества. Этот протокол решает проблему , связанную с высоким содержанием воды путем введения в парафин, а также уменьшает эффект разрывания закалкой парафина при низкой температуре в течение секционирования (рисунок 3). Таким образом, этот модифицированный протокол имеет преимущество по сравнению либо на основе парафина Sectioнин или cryosectioning для сохранения целостности тканей растений.
Эта рукопись показывает , что метод Гибридный-Cut сохраняет целостность тканей во многих тканях Фаленопсис , таких как подмышечной почка, семена и PLB и т.д. , которые содержат высокие уровни кристаллов (рис 3-4). Кроме того, этот протокол поддается зерновых культур , таких как репродуктивных органов и листьев риса, кукурузы и пшеницы , которые содержат высокое содержание кремнезема (цифры 5-6). По-видимому, этот протокол может быть применен к древесных растений, содержащих высоким содержанием клетчатки.
В общем, фиксируя ткань тщательно очень важно для гибридно-Cut. Мы обнаружили , что формальдегид-спирт-уксусная кислота (FAA) закрепляющий лучше , чем PFA для сохранения целостности тканей некоторых непокорных тканей , таких как аксиально почки, корни и т.д. Тем не менее, PFA работает лучше , чем ФАУ в сохранении целостности РНК. Поэтому PFA рекомендуется зафиксироватьОбразец для в гибридизация (МОГ) работы. Протокол, описанный здесь, предназначен для РНК ISH эксперимента. Таким образом, все реагенты были подготовлены, чтобы избежать деградации РНК путем устранения загрязнения РНКазы путем обработки DEPC. Если Hybrid-Cut раздел для анатомических исследований, регулярное обратного осмоса воды (RO) и его производным буфер или реагенты являются приемлемыми.
Уменьшение размера и толщины образца до менее чем 3 мм, полезно для инфильтрации. Кроме того, увеличение времени погружения для обезвоживания и инфильтрации необходимы для твердых тканей текстуры. Ограничение этого протокола может из-за проблем, вызванных недостаточной фиксации, дегидратации и инфильтрации образца. Таким образом, регулировка времени обработки для каждого шага имеет решающее значение для получения парафинового блока хорошего качества. Как правило, труднее ткани требуется больше времени, чем обработка более мягкой ткани.
Кроме того, мы показали, что Hybrid-Cut успешно работал в комбинации Wiго ISH , чтобы обеспечить пространственное распределение выбранных транскриптов (рисунок 7). Таким образом, этот протокол используется для изучения анатомии растений и обеспечивает тканеспецифическую РНК карту выбранных генов. Кроме того , он может быть применен к другим молекулярных исследований , таких как терминал дезоксинуклеотидтрансферазу дУТФ ник конец маркировки (TUNEL) анализа, флуоресценции в гибридизация (FISH) и методов иммунной окраски. В заключение, это улучшенный протокол ткани секционирования является полезным и полезным для исследователей в растительных сообществах.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |