This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Upprätthålla växt sektion integritet är väsentlig för att studera detaljerade anatomiska strukturer på cellulär, vävnad, eller till och med organnivå. Men vissa växtceller har styva cellväggar, tuffa fibrer och kristaller (kalciumoxalat, kiseldioxid, etc.), och hög vattenhalt som ofta störa vävnadsintegritet under växtvävnadssnittning.
Denna studie etablerar en enkel hybrid-Cut vävnad sektione metod. Detta protokoll ändrar en paraffinbaserad snitt teknik och förbättrar integriteten hos vävnadssnitt från olika växter. Växtvävnader bäddades in i paraffin innan snittning i en kryostat vid -16 ° C. Sektionering i låg temperatur hårdnat paraffinblock, minskad riva och klia, samt förbättrad vävnadsintegritet avsevärt. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på kalciumoxalat rika Phalaenopsis orkidé vävnader samt motsträviga vävnader såsom reproduktiv organs och blad av ris, majs och vete. Dessutom kan den höga kvaliteten på vävnadssnitt från Hybrid-Cut användas i kombination med in situ hybridisering (ISH) för att tillhandahålla spatiala expressionsmönster av gener av intresse. Sammanfattningsvis är detta protokoll speciellt användbar för motsträviga växtvävnad som innehåller höga kristall eller kiseldioxid innehåll. Bra vävnadssnitt kvalitet möjliggör morfologiska och andra biologiska studier.
Fotogenbaserade snittmetoden är en allmänt använd teknik för anatomiska studier. Bevarandet av intakt vävnad anatomi är viktigt för morfologiska och biologiska studier. Den paraffininbäddade snitt teknik är fördelaktig eftersom paraffin-inbäddning behåller cell- och vävnads morfologi. Dessutom kan paraffinblock lagras bekvämt under långa tidsperioder. Dock är paraffininbäddade sektionering inte lämpar sig för växtvävnader innehåller intracellulära kristaller. Kristaller i cellerna riva ofta paraffin band och vävnadsskada integritet under snittning.
Till skillnad från paraffin sektionering, är cryosectioning relativt snabbt och sektioner kan erhållas utan fixering, seriell uttorkning eller bädda medel infiltration 1. Kryosnitt är kompatibla med många applikationer såsom immunohistokemi, in situ hybridisering, och enzym histokemi. Den andra fördelen med cryosectioning äratt denna metod inte går igenom en potentiell denatureringsprocesser såsom hög temperatur och kemiska behandlingar, är så cellulära molekyler väl bevarade i vävnadssnitt 2. Cryosectioning allmänhet att föredra framför paraffinbaserad sektionering för studier i djurvävnader. Dock är cryosectioning inte förstahandsvalet i växter eftersom frystemperatur orsakar ibland bildning av iskristaller som påverkar kvaliteten i avsnitt integritet. Fastän osmoregulation såsom sackaroslösningar, polyetylenglykol (PEG), eller glycerol 3 har rapporterats att minska kristall isbildning enligt frysbetingelser, är förbättringen mindre än optimal.
Att anpassa sig till olika miljöer, olika växter har ofta olika vävnads textur och växtceller har utvecklats för att bilda styva cellväggar, tuffa fibrer och kristaller 4,5. Till exempel, olösliga kalciumoxalat kristaller och kiseldioxid organ är ganska vanligt iväxter 6. Silikat organ / kristaller har rapporterats för att upprätthålla växt arkitektur, UPPRÄTT STÄLLNING, och förebygga sjukdom eller skadedjur i spannmålsväxter 7-9.
De krukväxter orkidéer och cut-blomma orkidé marknaden blomstrar och det är en växande bransch. Phalaenopsis Afrodite (orkidé) är en av de viktigaste exportprydnadsväxter i Taiwan. Betydande ansträngningar har gjorts för att förstå de morfologiska och fysiologiska förändringar av blommande processerna i Phalaenopsis orkidéer. Blommor spikar av Phalaenopsis orkidéer initieras från armhålan knoppar på bladbasen. Efter en period av sval omgivningstemperatur (ca en och en halv månad), axillära knoppar förstoring, bryta dvala, och skjuter ut från bladbasen att utvecklas till unga blom spikar. För att förstå den fysiologiska, cellulära och molekylära processer spik initiering är det viktigt att utveckla en robust anatomisk teknik för att videoanläggningLize vävnader eller markörer i tid. Emellertid närvaron av allmänt förekommande kristaller i orkidé vävnader, speciellt i axillära knoppar, gör anatomiska arbetet svårt.
Här har vi försökt förbättra avsnitt integritet motsträviga växtvävnader som har hittills ansetts som tekniskt utmanande. Här visar vi en förbättrad protokoll som heter Hybrid-Cut. Det är en paraffinbaserad sektione metod som utförs med hjälp av en kryostat. Paraffininbäddning löser hög vattenhalt i växtvävnad. Sektionering i låg temperatur härdar paraffinblocket, minskar kristall riva problem och förbättrar vävnadsintegritet avsevärt. Detta protokoll avsevärt förbättrar vävnadsintegritet för motsträviga växtprover.
Växtceller har styva cellväggar, tuffa fibrer, kristaller och hög vattenhalt som orsakar vävnads slita problem under växtvävnad snittning. Även om paraffinbaserad sektionering används ofta för växtvävnader, de endogena kristaller SARGA ofta växtvävnaden under sektionering (Figur 1). På grund av den inneboende höga vattenhalten inom växtcellerna, orsakar kryostat baserade sektione ofta brutna celler och spruckna vävnadssektioner.
I den aktuella studien var en kombinerad paraffin-inbäddning och kryosektion protokoll som heter Hybrid-Cut utvecklat och god vävnadssnitt kvalitet erhölls. Detta protokoll löser problemet i samband med högt vatteninnehåll genom att införa paraffininbäddning, och minskar bristningar effekt genom härdning paraffinvax under låg temperatur vid snittning (Figur 3). Därför är fördelaktig jämfört med antingen paraffin-baserad ITT denna modifierade protokollning eller cryosectioning för att bevara växtvävnad integritet.
Detta manuskript visar att Hybrid-Cut-metoden bevarar vävnadsintegritet i många vävnader hos Phalaenopsis orkidé såsom armhålan knopp, frö, och PLB, etc. som innehåller höga halter av kristaller (figurer 3-4). Dessutom är detta protokoll mottaglig för spannmål som reproduktionsorgan och blad av ris, majs och vete som innehåller höga kiseldioxid (figurerna 5-6). Förmodligen kan detta protokoll tillämpas på vedartade växter som innehåller höga fiber.
I allmänhet är fastställande vävnad ordentligt mycket viktig för Hybrid-Cut. Vi fann att formaldehyd-alkohol-sur syra (FAA) fixativ är bättre än PFA att bevara vävnad integritet vissa motsträviga vävnader såsom axiellt knoppar, rötter, etc. Men fungerar PFA bättre än FAA att bevara RNA integritet. Därför PFA rekommenderas att åtgärdaprov för in situ hybridisering (ISH) arbete. Protokollet som beskrivs här är utformad för RNA ISH experiment. Därför var alla reagens beredda att undvika RNA nedbrytning genom att eliminera RNas förorening av DEPC behandling. Om Hybrid-Cut sektionen är för anatomiska studier, regelbunden omvänd osmos (RO) vatten och dess härledda buffert eller reagens är acceptabla.
Minska prov storlek och tjocklek till mindre än 3 mm är till hjälp för infiltration. Dessutom ökar nedsänkningstid för dehydrering och infiltration är nödvändiga för hård konsistens vävnader. Begränsning av detta protokoll kan bero på problem som orsakas av otillräcklig fixering, dehydrering, och infiltration av provet. Därför är justering av behandlingstiden för varje steg kritiskt att producera bra kvalitet paraffin block. Normalt behöver hårdare vävnad längre bearbetningstid än mjukare vävnad.
Dessutom visade vi att Hybrid-Cut arbetat framgångsrikt i kombination with ISH att ge rumslig fördelning av de utvalda transkript (Figur 7). Sammanfattningsvis är detta protokoll användbara för studier av växtanatomi och tillhandahåller en vävnadsspecifik RNA-karta över de valda generna. Dessutom kan den appliceras till andra molekylära studier såsom terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end märkning (TUNEL) -analys, fluorescerande in situ-hybridisering (FISH), och immunfärgning tekniker. Sammanfattningsvis är denna förbättrade vävnad snitt protokoll både användbar och till hjälp för forskare inom växtsamhällen.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |