This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Bitki bölüm bütünlüğünü korumak hücre, doku, hatta Organ düzeyde detaylı anatomik yapıları incelemek için esastır. Ancak, bazı bitki hücreleri sert hücre duvarlarını, sert lifler ve kristaller var (kalsiyum oksalat, silika, vb) ve yüksek su içeriği genellikle bitki doku kesit sırasında doku bütünlüğünü bozmaya söyledi.
Bu çalışma, basit bir Hibrid-Cut doku kesit yöntemi kurar. Bu protokol, parafin esaslı kesit tekniği değiştirir ve farklı bitki doku kesitleriyle bütünlüğünü arttırır. Bitkisel dokular -16 ° C'de kriyostat içinde kesit önce parafine gömüldü. parafin blokları, azaltılmış yırtılma ve çizilmeye ve önemli ölçüde geliştirilmiş doku bütünlüğü düşük sıcaklık altında sertleştirilmiş Kesit. Bu protokol başarıyla gibi üreme Orga gibi kalsiyum oksalat bakımından zengin Phalaenopsis orkide dokuların yanı sıra inatçı dokulara uygulananNS, pirinç, mısır ve buğday yaprak. Buna ek olarak, hibrid-Cut doku bölümleri yüksek kalitede ilgili genlerin mekansal ekspresyonu sağlamak için in situ hibridizasyon (ISH) ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, yüksek bir kristal ya da silika içeriği içeren dirençli bitki dokusu için özellikle yararlıdır. Kaliteli doku bölümleri morfolojik ve diğer biyolojik çalışmalar etkinleştirin.
parafin esaslı kesit Bu metod, anatomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. sağlam doku anatomisine korunması morfolojik ve biyolojik çalışmalar için önemlidir. parafin-gömme hücre ve doku morfolojisi korur çünkü parafine gömülü kesit tekniği avantajlıdır. Buna ek olarak, parafın bloklar uzun süreler boyunca uygun bir şekilde muhafaza edilebilir. Bununla birlikte, parafine gömülü kesit hücre içi kristalleri içeren bitki dokuları için uygun değildir. hücrelerin içinde Kristaller genellikle kesit sırasında parafin kurdeleler ve hasar doku bütünlüğünün gözyaşı.
Parafin kesit aksine, krio-bölümleme nispeten hızlı ve bölümler fiksasyon, seri dehidrasyon veya orta infiltrasyon 1 gömmeden elde edilebilir. Donuk kesitler bir çok örneğin immünohistokimya gibi uygulamalar, in-situ hibridizasyon ve enzim histokimya ile uyumludur. cryosectioning diğer avantajıBu yöntem, yüksek sıcaklık ve kimyasal tedaviler olarak potansiyel bir denatürasyon süreçleri yoluyla gitmez o kadar hücresel moleküller de doku kesitlerinde 2 içinde korunur. Cryosectioning genellikle parafin esaslı hayvan dokularında çalışmalar için kesit tercih edilir. sıcaklığı donma bazen bölüm bütünlüğünün kalitesini etkileyen buz kristallerinin oluşumuna yol açar Ancak, krio-bölümleme bitkilerde ilk seçenek değildir. Ozmoregülasyon sükroz çözeltiler, polietilen glikol (PEG), ya da gliserol 3 arasındaki dondurma koşulları altında, kristal buz oluşumunu azaltmak için rapor edilmiştir, ancak bir gelişme uygun daha azdır.
Farklı ortamlara uyum, farklı bitkiler genellikle farklı doku doku ve bitki hücreleri sert hücre duvarlarını, sert lifler ve kristaller 4,5 oluşturmak üzere gelişmiştir var. Örneğin, çözünmeyen kalsiyum oksalat kristalleri ve silika organları oldukça yaygındırBitkiler 6. Silikat kurum / kristaller bitki mimarisini, dürüstlük korumaya yardımcı ve tahıl bitkileri 7-9 hastalık veya haşere önlemek için rapor edilmiştir.
Saksı orkide ve kesme çiçek orkide pazar yayıldığını ve büyüyen bir endüstridir. Phalaenopsis aphrodite (güve orkide) Tayvan en önemli ihracat süs bitkileri biridir. Önemli çabalar Phalaenopsis orkide çiçekli süreçlerinin morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri anlamak için yapılmıştır. Phalaenopsis orkide çiçek sivri yaprak dibinde aksiller tomurcuklarından başlatılır. Serin ortam sıcaklığı bir süre sonra (yaklaşık bir buçuk ay), aksiller tomurcuklar büyütmek, dormansi kırmak ve genç çiçek sivri haline yaprak tabanından çıkıntı. fizyolojik, hücresel ve başak inisiyasyon moleküler süreçleri anlamak için, visua sağlam bir anatomik tekniğini geliştirmeye esastırzamanında Lize doku ya da işaretleri. Ancak, orkide dokularda yerde kristallerin varlığı, özellikle koltuk altı tomurcukları, anatomik çalışma zorlaştırır.
Burada şimdiye kadar teknik açıdan zor olarak kabul edilmiştir inatçı bitki dokularının bölüm bütünlüğünü geliştirmek için çalıştı. Burada Hibrid-Cut adlı gelişmiş bir protokol göstermektedir. Bir kriyostat kullanarak gerçekleştirilen bir parafin esaslı kesit bir yöntemdir. Parafin gömme bitki dokusunda yüksek su içeriği giderir. parafin blok düşük sıcaklık altında sertleşir Kesit sorunu yırtılma kristal azaltır ve önemli ölçüde doku bütünlüğünü artırır. Bu protokol ölçüde inatçı bitki örnekleri için doku bütünlüğünü geliştirir.
Bitki hücreleri bitki dokusu kesit sırasında doku yırtılma sorunlara neden sert hücre duvarları, sert elyaflar, kristaller, ve yüksek su içeriğine sahiptir. Parafin esaslı kesit genellikle bitki dokuları kullanılır da, endojen kristaller genellikle (Şekil 1) kesit sırasında bitki dokuyu yırtabilir. Çünkü, bitki hücreleri içinde doğal olarak yüksek su içeriği, kriyostat tabanlı kesit genellikle kırık hücreleri ve kırık doku bölümleri neden olur.
Bu çalışmada, Hibrid-Cut adlı bir kombine parafin-gömme ve cryosection protokolü geliştirildi ve kaliteli doku kesitlerinde elde edilmiştir. Bu protokol parafin gömme tanıtarak yüksek su içeriği ile ilgili sorunu giderir, ve (Şekil 3) kesit sırasında düşük sıcaklık altında parafin sertleştirerek yırtılma etkisini azaltır. Bu nedenle, bu değiştirilmiş protokolünü parafin esaslı sezaryen avantajlıdırning veya bitki dokusu bütünlüğünün korunması için cryosectioning.
Bu yazının Hybrid-Cut yöntemi kristalleri (Şekil 3-4) yüksek düzeyde içeren vb aksiller tomurcuk, tohum ve PLB gibi Phalaenopsis orkide birçok dokuda doku bütünlüğünü koruduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu protokol, yüksek silis (Şekil 5-6) içeren üreme organları ve pirinç, mısır yaprakları ve buğday gibi hububat bitkileri ile uyumludur. Muhtemelen, bu protokol, yüksek elyaf içeren bitkiler odunsu tatbik edilebilir.
Genel olarak, sabitleme doku iyice Hibrid-Cut için çok önemlidir. O formaldehit-alkol-asidik asit (FAA) sabitleştirici PFA gibi eksenel vb tomurcukları, kökler, Ancak, PFA RNA bütünlüğünü koruyarak FAA daha iyi çalışır gibi bazı inatçı dokuların doku bütünlüğünü korumak için daha iyidir bulundu. Bu nedenle PFA düzeltmek için tavsiye edilirin situ hibridizasyon (ISH) çalışma örneği. Burada açıklanan protokol RNA ISH deney için tasarlanmıştır. Bu nedenle, tüm reaktifler DEPC işlenerek RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırarak RNA bozulmasını önlemek için hazırlanmıştır. Hibrid-Cut bölümü anatomik çalışmalar, düzenli ters osmoz (RO) su ve onun türevi tampon veya reaktif kabul edin.
en az 3 mm numune boyutu ve kalınlığının azaltılması infiltrasyon için yararlıdır. Ayrıca, dehidratasyon ve infiltrasyon artan daldırma süresi sert doku dokular için gereklidir. Bu protokolün Sınırlaması yetersiz fiksasyon, dehidratasyon ve numunenin sızması kaynaklanan sorunlar nedeniyle olabilir. Bu nedenle, her basamak için işlem süresi ayarı kaliteli parafın bir bloğun üretilmesi için çok önemlidir. Normal olarak, sert doku yumuşak dokuya göre işlem süresi daha uzun gerekmektedir.
Ayrıca, Hibrid-Cut kombinasyonu wi başarıyla çalışmış olduğunu gösterdiinci ISH seçilen transkript (Şekil 7) dağılımını sağlamak. Özet olarak, bu protokol, bitki anatomisinin çalışma için yararlıdır ve seçilen gen, bir doku-spesifik RNA haritasını sağlar. Buna ek olarak bu tür terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç işaretleme analizi (TÜNEL) deneyi, floresan in situ melezleme (FISH) ve immün teknikleri gibi diğer moleküler çalışmalar tatbik edilebilir. Sonuç olarak, bu gelişmiş doku kesit protokolü kullanışlı ve bitki toplulukları araştırmacılar için yararlı hem de.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |