Summary
Icke-invasiv bedömning av endotelfunktion hos människor kan bestämmas genom flödesmedierad dilatation teknik. Trots att tusentals studier har använt denna teknik, har ingen studie utförd denna teknik icke-invasivt i råttor. Följande artikel beskriver icke-invasiv mätning av flödesmedierad utvidgning i brachialis och ytliga lårbensartärer hos råttor.
Introduction
Det vaskulära endotelet är ett cellulärt monolager som linjer lumen av blodkärlen och är en viktig regulator av vaskulär funktion. Det finns många molekyler som frigörs från endotelet som resulterar i modulering av blodkärl diameter. Bland dessa molekyler, kväveoxid (NO), synes vara den primära vasodilaterande molekylen frisätts från det vaskulära endotelet som svar på stimulering (t.ex., insulin, acetylkolin, eller förändringar i skjuvspänning) 1. I kärlendotel är NO som produceras av enzymet endotelceller NO-syntas (eNOS) och därefter befrias från endotelceller 2. NEJ diffunderar till den vaskulära glatta muskulaturen där det orsakar avslappning och ökad kärldiametern 3.
Endoteldysfunktion kan bedömas icke-invasivt i människor som använder flödesmedierad dilatation (FMD) teknik 4,5 den. Mul- och klövsjuka har föreslagits för att representera en funktionell bioanalys för endotelhärleddNO biotillgänglighet hos människor, och är normalt bedöms på brachialis eller ytliga lårbensartären som svar på reaktiv hyperemi efter en ~ 5 min lem ocklusion 6. Reaktiv hyperemi ökar laminärt skjuvkrafter som är omvandlade till endotelceller 7, vilket signalerar en frisättning av NO 8. Även under de senaste åren, har andelen vasodilation initierats av NO-frisättning har diskuterats 9,10, är mul- och klövsjuka som indikerar endotelberoende utvidgning och har genomgående visat sig förutsäga kardiovaskulära händelser 11-13.
Hittills har tusentals studier användes FMD teknik för icke-invasiv mätning av endotelfunktion hos människor. Med tanke på den senaste tidens förskjutning i fokus för translationell forskning, skulle riktlinjer för icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka i gnagare vara oerhört värdefullt. Att hålla med en translationell tillvägagångssätt, var detta protokoll som upprättades för mätning av mul- och klövsjuka i brachialis och superficial lårbensartärerna hos råttor, som dessa platser är oftast mäts i människor. Detta protokoll resulterar i en robust och repeterbar mul- och klövsjuka svar hos råttor är dock mätning av mul- och klövsjuka hos råttor tekniskt krävande och kan vara svårt för andra forskare att replikera utan video demonstration. Därför kommer följande artikeln visar en metod för icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka i brachialis och ytliga lårbensartärer hos råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök överensstämde med handledningen för vård och användning av försöksdjur 14 och godkändes av University of Utah och Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care och användning.
1. Animaliska Beredning
- Placera djur i anestesi induktion kammare som innehåller 3% isofluran i 100% syre. Lämna djuret i induktionskammaren tills den inte svarar på yttre stimuli.
- Ta bort djuret från induktionskammare och placera den på en uppvärmd undersökningsbord utrustad med elektrokardiogram (EKG) elektroder. Upprätthålla anestesi vid 3% isofluran i 100% syre. Brachialis och ytliga lårbensartären MKS kan inte utföras samtidigt. Därför är beredningsinstruktionerna för varje mätning som anges nedan.
2. armartären Förberedelse
- Placera djuret liggande och hålla den vänstra övre extremiteterna och varje nedre delen av enimal till undersökningsbordet med kirurgtejp.
- Hålla tillbaka den högra övre extremiteten av djuret, så att den nedre delen av den övre extremiteten är något förhöjd (~ 0,2 till 0,5 cm) ovanför plattformen.
- Applicera hårborttagningsmedel (t.ex. Nair) till djurets högra övre extremiteten att ta bort hår.
- Placera en ocklusion manschetten (10 mm lumendiameter standard kärltillslutning) på högra övre extremiteten distalt armbågen. Vila inte tillslutningen på plattformen, som inflation / deflation kommer att flytta lem och störa ultraljudsbilder.
- Ställ ultraljud maskin till B-läge med hjälp av ultraljud tangentbordet.
- Använda en liten mängd av ultraljud gel till den övre delen av djuret, proximalt till ocklusion manschetten.
- justera manuellt en ultrahög frekvens linjär array omvandlare ansluten till en stereotaktisk hållare med de övre extremiteterna. Armartären ska vara synlig 2-3 mm djup.
- För att bekräfta att armartären, inte den brachial vein, är att varaavbildas, byta till PW-läge med hjälp av ultraljud tangentbordet. Artären kommer att ha pulserande blodflödet i motsats till den intilliggande ven som kommer att ha kontinuerlig blodflödet.
3. Ytlig lårbensartären Förberedelse
- Placera djuret liggande och hålla armar och vänster nedre extremiteterna till undersökningsbordet med kirurgtejp.
- Hålla tillbaka höger nedre delen av djuret till ett högt läge (~ 0,5-1 cm) ovanför plattformen med hjälp av en dyna (t.ex. vikta pappershanddukar).
- Tillämpa hårborttagningsmedel (t.ex. Nair) till djurets högra nedre extremiteten för att ta bort hår. Efter hårborttagning lårbensvenen bör vara väl synlig på den övre insidan av låren.
- Placera en ocklusion manschetten (10 mm lumendiameter standard kärltillslutning) proximalt till höger fotled. Vila inte tillslutningen på plattformen, som inflation / deflation kommer att flytta nedre extremiteterna och störa ultraljudsbilder.
- Ställa in ultraljud maskinen tillB-mode.
- Använda en liten mängd av ultraljud gel till den nedre delen av djuret, proximalt till ocklusion manschetten.
- justera manuellt en ultrahög frekvens linjär array omvandlare ansluten till en stereotaktisk hållare med lårvenen, som är synlig genom huden. Den ytliga lårbensartären ska synas <1 mm djup.
- För att bekräfta att den ytliga lårbensartären, inte höftbensvenen är som avbildas, byta till PW-läge. Artären kommer att ha pulserande blodflödet i motsats till den intilliggande ven som kommer att ha kontinuerlig blodflödet.
4. Baslinje Fas
- Optimera B-mode bilden liknar hur det skulle ske i människor 15. Se till att en horisontell, längsgående bild av kärlet med intima-media visualiseras i båda väggarna observeras. Optimera bilden genom att något justera ultraljudssonden placering för att säkerställa att så mycket av artären som möjligt är synlig i inspelningsfönstret.
- Alternativt justera ultraljudsinställningar för att få en bättre bild genom att ändra ljusstyrka / kontrast, fokalzonerna, frekvens, dynamiskt omfång, och linjedensitet. Det finns andra sätt att optimera ultraljudsbilden, men detaljerad beskrivning av dem är utanför ramen för detta protokoll.
- Efter optimering av artärbildspråk, slå på EKG-gating att bara visa bilder som tagits under R-vågen för att säkerställa att endast en diameter ram samlas är under varje diastoliska del av en hjärtcykel.
OBS: EKG-gating finns på ultraljud maskin som används i detta protokoll genom att välja EKG-gating under alternativet fysiologiska inställningar, men den här funktionen kanske inte är tillgänglig på alla ultraljud maskiner. EKG-gating bör slås på efter det att bilden är optimerad, eftersom det är svårt att få en bild med lägre bildhastighet (dvs en gång per R-våg). Utan EKG-gating, kombinationen av en hög hjärtfrekvens hos råttor och kravet på en hög ramhastighet för att fånga den diastoliska delen av hjärtcykeln tillåter endast för ~ 10-20 sekundersklipp. Den besvärliga storlek och mängden data i varje klipp ökar bördan analysen avsevärt. - Record 60 sekunder baslinjedata använder B-mode.
OBS! Ultraljud maskin alltid inspelning, dock inte alla bilder lagrade på ultraljud maskin, eftersom det finns en gräns för hur många bilder som kan spelas in i en ultraljuds klipp. Klämman längd (dvs., antalet ramar) kan justeras i inställningarna. Det föreslås att ställa för maximalt antal bilder per klipp. När inspelningen är i slutet av en klämma (dvs maximalt antal ramar uppnåtts), inspelningen fortsätter, men klämman rullar framåt fånga de senaste ramarna. I det här fallet, är tidigare ramar som fångades utanför den högsta bildgränsen därefter raderas. Även om dessa krångligheter i inspelningen skiljer sig mellan maskiner, kan justering av inspelningslängd vara nödvändig. - switch till PW-läge. Placera markören i mitten av lumen. Prov portar kommer att placeras automatiskt i förhållande till markören, men kan justeras i bredd med hjälp av ultraljud tangentbordet. Upprätthålla en insonation vinkel på ≤60 °.
- Justera insonation vinkel genom att förändra Doppler spridningsvinkel. Finjustera vinkeln med hjälp av ultraljud tangentbordet. Om ingen av dessa ger en vinkel lämplig för mätning, justera ultraljudssonden manuellt genom att luta artären till en mer optimal vinkel. Om någon justering av ultraljudsvinkeln utförs återta B-mode bilder.
- Spela 10 sekunders hastighetsdata.
5. Ocklusion Fas
- Pumpa kärltillslutnings hjälp av en luftfylld 10 ml spruta. För att hålla lufttrycket konstant i kärltillslutning, vika röret på sig själv och placera en pappersklämma på den vikta röret.
- Växla till PW-läge för att bekräfta manschetten ocklusion, vilket framgår aven stor minskning av blodhastigheten.
- Växla till B-läge och registrera data i 60-sekundersklipp, tills 4:45 min av ocklusion.
- Växla till PW-läge. Håll reda på hjärtfrekvens och tiden för varje ultraljuds klipp för analys.
6. hyperemiska Fas
- Släpp manschetten under inspelning i PW-läge genom att avlägsna bindemedel klipp från det vikta röret. Spela 5 sekunder före och 5 sekunder efter manschetten frisättning.
- Växla till B-läge och registrera data i 60-sekundersklipp till 3 minuter efter ocklusion. Håll reda på hjärtfrekvens och tiden för varje ultraljuds klipp för analys.
- Efter slutförandet av mul- och klövsjuka ta bort djuret från undersökningsbordet och kontrollera tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
7. Analys
- För analys, export ultraljud som DICOM-filer till en offline dator utrustad med kantdetektering programvara som möjliggör objektiv avskräckaställandet av artär diameter vid varje ram. Analys är möjlig på ultraljudsmaskinen, rekommenderas dock inte det, eftersom det är mycket tidskrävande och föremål för utredare partiskhet.
- Analysera data artärdiameter på 60 andra segment under baslinjen och ocklusion fas och i 10 andra segment under hyperemiska fasen.
- Analysera blodhastighetsdata med hjälp av flödesanalys kapacitet automatisk kantdetektering programvara. Bestämma genomsnittlig blodhastigheten genom att mäta 5 eller flera på varandra följande vågformer av enhetligt utseende under baslinjen och ocklusion faser. Bestäm genomsnittliga blodhastigheten under reaktiv hyperemi för blodhastigheter omedelbart efter manschetten release. Vågformen med högsta blodhastigheten anses toppblodhastigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flow-medierad utvidgning utfördes på brachialis och ytliga lårbensartären av 8 Wistar råttor. Positionering av en råtta visas i figur 1.
Representativa ultraljudsbilder av den ytliga lårbensartären visas i figur 2.
Figur 1. Rat och ultraljud positionering.
Positionering av råtta för mätning av brakial (A) och ytliga lårbens (B) artär MKS. Placering av ultraljudssonden och ocklusion manschetten för mätning av brakial (C) och ytlig lårbens (D) artär FMD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa ultraljudsbilder.
Ultraljudsbild av den ytliga lårbensartären med användning av B-mode scanning för bestämning av diametern (A). Blodhastigheten bestämdes med användning av PW-mode. Visas i figuren är blod hastighet vid baslinjen (B), en minskning av blodhastigheten under ocklusion fas (C), och den snabba ökningen av blodhastigheten på manschetten frisättning under hyperemiska fasen (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som visas i figur 3, finns en liknande vasodilaterande svar mellan brachialis och ytliga lårbensartärer. Uttryckt i procent av baslinjen, mul- och klövsjuka var likartad mellan artärer, men när expressed som en absolut förändring från baslinjen, mul- och klövsjuka var signifikant högre i armartären (P <0,05). Denna skillnad beror sannolikt på en större fartyg diameter i armartären än i den ytliga lårbensartären (498 ± 28 mot 397 ± 11 um, P <0,05). I likhet med mätning av mul- och klövsjuka hos människor 16, intersession variationskoefficient för brachialis och ytliga lårbens mul- och klövsjuka var 9 ± 1 och 10 ± 4%, respektive. Trots skillnader i fartygsstorlek, fanns en stark linjärt förhållande mellan brachialis och ytlig lårbensartären FMD uttryckt i procent eller absoluta förändringen från baslinjen.
Figur 3. Flödes medierad utvidgning hos råttor.
Vasodilatation av brachialis och ytlig femoralartery efter en 5 min period av ischemi i extremiteterna, uttryckt som procent (A) och absolut (B) Ändras från baslinjen. Mul- och klövsjuka var likartad mellan artärer uttryckt som procent av baslinje (C). Men när den uttrycks som en absolut förändring från baseline (D), mul- och klövsjuka var signifikant högre i armartären. Uttryckta i procent (E) eller absolut (F) förändring från baslinjen, det fanns en stark relation för mul- och klövsjuka mellan brachialis och ytliga lårbensartärer. * P <0,05 vs. armartären. Värdena är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som framgår av tabell 1, var kardiovaskulära variabler som uppmätts under baslinjen, ocklusion, och hyperemisk faser. Artärdiameter bestämdes med användning intiman-to-intima eller media-till-media avstånd under det diastoliska delen av hjärtcykeln. Artery diameter mättes under 60 sekunder vid baslinjen och kontinuerligt in ~ 60 sekunders intervall genom ocklusion och hyperemisk faser. Blodhastigheten bestämdes med användning av det arteriella medelhastigheten för blod i lumen under en hjärtcykel. Blodflödet beräknades som per ekvationen: blodflödet (| il / min) = (blodhastighet (^ m / sek) · π · [kärldiameter (| im) / 2] 2 · 60). Skjuvhastighet beräknades enligt ekvationen: skjuvhastighet (s -1) = blodhastigheten · diameter 8 / kärl. Mul- och klövsjuka beräknades enligt ekvationen: FMD = (topp fartyg diameter - baseline fartyg diameter) / baslinje fartyg diameter.
| armartären | Ytlig lårbensartären | |
| baslinje fas | ||
| Hjärtfrekvens, bpm | 367 ± 12 | 368 ± 16 |
| Diameter, um | 498 ± 28 | 397 ± 11 * |
| Blodhastigheten, pm / sek | 85 ± 8 | 76 ± 11 |
| Blodflöde, ul / min | 1027 ± 147 | 568 ± 90 * |
| Skjuvhastighet, s -1 | 1,4 ± 0,1 | 1,5 ± 0,2 |
| ocklusion fas | ||
| Hjärtfrekvens, bpm | 362 ± 12 | 359 ± 14 |
| Diameter, um | 499 ± 32 | 390 ± 11 * † |
| Blodhastigheten, pm / sek | 63 ± 9 † | 38 ± 8 † |
| Blodflöde, ul / min | 722 ± 122 † | 272 ± 62 * † |
| Skjuvhastighet, s -1 | 1,0 ± 0,2 † | 0,8 ± 0,2 † |
| hyperemiska fas | ||
| Hjärtfrekvens, bpm | 363 ± 12 | 357 ± 12 |
| Peak Diameter pm | 586 ± 22 † ‡ | 457 ± 15 * † ‡ |
| Peak blodhastigheten, um / sek | 149 ± 11 † ‡ | 205 ± 12 * † ‡ |
| Peak blodflöde, ul / min | 1778 ± 229 † ‡ | 1495 ± 127 † ‡ |
| Peak Shear Rate, s -1 | 2,5 ± 0,3 † ‡ | 3,7 ± 0,2 * † ‡ |
| * P <0,05 vs. armartären. </ Td> | ||
| † P <0,05 vs. Baslinje fas. | ||
| ‡ P <0,05 vs. Ocklusion fas. | ||
| Värdena är medelvärde ± SEM. |
Tabell 1. Kardiovaskulära variabler genom varje fas av protokollet.
Det fanns inga förändringar i hjärtfrekvens under antingen protokoll, liksom mellan artär mätningar (P> 0,05). Diametern av armartären var betydligt större än den ytliga lårbensartären (P <0,05). Under ocklusion fasen, var det en signifikant minskning av blodhastigheten, blodflöde, och skjuvningshastighet jämfört med utgångsvärdet i båda artärer (P <0,05). Efter manschetten release, toppblodhastigheten, blodflödet och skjuvhastighet var alla signifikant högre än baslinjen eller ocklusion faser i både artärer (p <0,05). I likhet med mätning av reaktiv hyperemi hos människor 16, intersession variationskoefficient för brachialis och ytliga lårbens reaktiv hyperemi var 24 ± 9 och 19 ± 5%, respektive. Det fanns skillnader i blodhastigheten, blodflödet, och skjuvhastigheten mellan artärer, beroende till stor del på skillnaden i artären diameter.
Efter normalisering till topp skjuvhastighet, vasodilation var högre i armartären (Figur 4). Detta var också sant för mul- och klövsjuka, uttryckt som en absolut förändring från baslinjen. Trots skillnader i storlek, det fanns en stark linjärt förhållande i procent och absoluta mul- och klövsjuka normaliseras till topp skjuvhastighet mellan brachialis och ytliga lårbensartären.
/54762fig4.jpg "/>
Figur 4. Flow-medierad dilation normaliserad till topp skjuvhastighet hos råttor.
Efter normalisering till topp skjuvhastighet, expressedas FMD en procent (A) eller absoluta förändringen (B) från utgångsvärdet var högre i armartären jämfört med den ytliga lårbensartären.
Trots skillnader mellan artärer i mul- och klövsjuka normaliserade till topp skjuvhastighet, fanns ett starkt samband mellan brachialis och ytliga lårbensartärer när mul- och klövsjuka uttrycktes som en procent (C) eller absoluta förändringen (D) från baslinjen. * P <0,05 vs. armartären. Värdena är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I föreliggande studie, var en icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka påvisats i brachialis och ytliga lårbensartärer från råtta. Lika människor 6, efter en 5 min ocklusion perioden fanns det en snabb ökning av blodhastigheten (dvs reaktiv hyperemi) och därigenom öka skjuvhastighet på artärväggen som resulterade i den efterföljande vasodilation av artären. MKS observerades i både brachialis och ytliga lårbensartärerna. Dessutom fanns det en stark relation i mul- och klövsjuka mellan artärer. Även toppskjuvning var högre i den ytliga lårbensartären, mul- och klövsjuka normaliserat till topp skjuvhastighet bibehålls en stark relation mellan artärer. Tillsammans indikerar dessa resultat att icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka kan utföras framgångsrikt på råttor.
Även mätning av mul- och klövsjuka utfördes på två olika artärer, omfattningen av mul- och klövsjuka var liknande uttryckt i en procentuell förändring från baslinjen. However, uttryckt som en absolut förändring från baslinjen, mul- och klövsjuka var högre i armartären, som artär hade en ~ 25% större vilar diameter än den ytliga lårbensartären. Dessa resultat är liknande de för humanstudier där MKS mättes i brachialis och ytliga lårbensartärerna i samma ämnen 17,18. Trots skillnaderna i arteriell diameter, förhållandet mellan mul- och klövsjuka, uttryckt i procent eller absoluta förändringen från baslinjen, var extremt stark mellan artärer.
Flödesmedierad dilatation har föreslagits för att representera en funktionell bioanalys för endotelhärledd NO biotillgänglighet hos människa 6, såsom vasodilatation sker via NO-frisättning från endotelet som svar på ökad skjuvhastighet 1,3. Således, en högre FMD normaliserat till topp skjuvhastighet representerar en endotel som har ökad känslighet en viss ökning av skjuvhastigheten. Efter normalisering mul- och klövsjuka till topp skjuvhastighet, mul- och klövsjuka var högre i brachial artär, oavsett om den är uttryckt som en procent eller absoluta förändringen från baslinjen. Trots skillnader i omfattningen av mul- och klövsjuka normaliserade till topp skjuvningshastighet mellan brachialis och ytliga lårbensartärer, fanns det en stark linjärt förhållande i procent och absolut MKS normaliserade till topp skjuvningshastighet mellan artärer.
I föreliggande studie, är den icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka som beskrivs i brachialis och ytliga lårbensartärerna med manschetten ocklusion distalt till ultraljudssonden. Denna manschett placering valdes av flera skäl, 1.) hos människor, är detta vanligaste metoden för att mäta mul- och klövsjuka, 2.) bidrag av NO till mul- och klövsjuka har visat sig vara större när mätningen artär diameter är proximal till ocklusion plats 9 och 3.) fanns svårigheter i ultraljudsbilden upprätthålla efter manschettuppblåsning när mätplatsen var distalt ocklusion. Även om detta förfarande utgör en icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka,andra har utfört mul- och klövsjuka i levande råttor med hjälp av en kirurgisk ocklusion av den gemensamma höftartären med ultraljud mätning distalt ocklusion i lårbensartären 19. Mul- och klövsjukesvar med användning av protokollet som först beskrevs av Heiss et al. inhiberades genom infusion Enos hämmare. I själva verket har detta förfarande använts för att visa att farmakologiska ökningar i intracellulär NO förbättrar mul- och klövsjuka i två råttmodeller av endoteldysfunktion och högt blodtryck 20, och exponering för passiv rökning leder till en försämring av mul- och klövsjuka hos råttor 21,22. Dessa studier visar bidrag NO MKS i råttor och fastställa förhållandet mellan mul- och klövsjuka till kardiovaskulär hälsa. Eftersom denna teknik är invasiva, kan det begränsa möjligheten att mäta mul- och klövsjuka i längdriktningen i samma råttor över en period av veckor till år. Med hjälp av en liknande metod till den aktuella studien, har två nya studier utförs icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka i bakbenet hos möss 23,24,men det fanns flera tekniska variationer mellan studier (dvs mätning tidsförloppet och placering av ultraljudssonden och ocklusion manschetten). På grund av skillnader mellan dessa studier och svårigheter att replikera dessa resultat var icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka hos råttor försökte i stället, eftersom råttor används ofta i translationell forskning, men har en större kropp och blodkärl storlek än möss. Medan mätning av mul- och klövsjuka i lårbensartären hos gnagare är i allmänhet inte ny, har ingen studie utförd mätning av mul- och klövsjuka i armartären några levande gnagare. Den starka relationen mellan MKS mellan benen i denna studie kan illustrera hur systembetingad endotelfunktion, men ger också en metod för att icke-invasivt mäta mul- och klövsjuka hos djur som har stört blodflöde i bakbenen (t.ex. lårbens arteriovenös fistel).
Optimering och underhåll av en ultraljudsbilder av hög kvalitet är viktiga färdigheter som krävs för denna procedure och kräver omfattande praktik. Till exempel, för mätning av mul- och klövsjuka hos människor, föreslås det att minst 100 övervakade skannar utförs innan skanning oberoende 5. Ibland kan bilden flyttas under manschetten ocklusion och kräver små justeringar av ultraljudssonden. Ett kritiskt steg i detta protokoll växlar mellan B-mode och PW-läge vid specifika tidpunkter. Samtidig B-mode och PW-mode scanning inte möjligt på ultraljud maskin som används i detta protokoll. Därför är det nödvändigt att snabbt växla mellan ultraljudslägen att fånga hastighet och diameter mätningar under specifika tidssegment. Att ha en skriftlig ut protokoll och öva utför protokollet kommer att kraftigt förbättra effektiviteten i att växla mellan ultraljudslägen. Med tanke på tidskänsliga karaktär ultraljudsinspelningar under detta protokoll, kommer fel uppstår, så var beredd att anteckna något protokoll avvikelser, till exempel glömmer att ta en ultraljuds klipp.Saknas ett ultraljud klipp under ocklusion fasen är inte kritisk, men om en inspelning försvinner under den reaktiva hyperemia fasen föreslås att utföra proceduren igen efter minst 30 minuter har passerat 25.
Som med någon studie finns begränsningar för det experimentella protokollet. I denna studie var anestesi administrerades till råttor under 100% syre, alltså mätningar av mul- och klövsjuka kan också spegla vasoreactivity till hyperoxi. Andra former av anestesi, såsom natriumpentobarbital skulle kunna användas för att skapa en mer representativ blodgas profil till människor och eliminera detta bekymmer. Blodtryck inte kontrolleras vid någon punkt i detta protokoll. Även blodtryck inte ändras till följd av akut manschetten ocklusion hos människa, är det okänt om någon övergående förändring av blodtrycket skulle ske hos råttor. Dessutom var tryckluft används för att fylla kärltillslutning, men fylls med vatten kan ha lett till en fastare ocklusionav blodflödet eftersom vatten är det inte lika kompressibel som luft. Slutligen, icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka under förhållanden där eNOS hämmas (dvs L-NMMA infusion) har inte utförts. Således bidrag NO till mul- och klövsjuka, som utförs i detta protokoll, har inte fastställts.
Sammanfattningsvis har den här artikeln visat ett protokoll för icke-invasiv mätning av mul- och klövsjuka i brachialis och ytliga lårbensartärer hos råttor. I samband med den senaste tidens förskjutning i fokus för translationell forskning, kan bedömningen av mul- och klövsjuka hos råttor ge ett värdefullt verktyg för att översätta resultat hos människor till råttor, samt ge möjlighet att bedöma endotelfunktion vid flera tidpunkter i longitudinella studier av råttor mottagande av olika behandlingar. I själva verket är minskningar av mul- och klövsjuka tillsammans med aortaartärstyv har observerats efter njurskada i en råttmodell av kronisk njursvikt (opublicerade rön), vilket visar appengörandet av icke-invasiv MKS som en markör av vaskulär funktion i longitudinella djurstudier. Framtida studier för att undersöka mekanismerna för mul- och klövsjuka i råttor är motiverade och skulle ge ytterligare insikt i icke-invasiv FMD mätning i människa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optional |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore surgical tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatory cream (e.g., Nair) | General supply | ||
| Cotton swabs | General supply | ||
| Ultrasound gel | General supply | ||
| Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml syringe with Luer-Lok tip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Paperclip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Hypodermic needle – 18 gauge | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Medium binder clip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus |
References
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C. eNOS at a glance. J Cell Sci. 117, 2427-2429 (2004).
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070 (2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
