Summary
evaluación no invasiva de la función endotelial en el ser humano puede ser determinada por la técnica de la dilatación mediada por flujo. Aunque miles de estudios han utilizado esta técnica, ningún estudio ha realizado esta técnica no invasiva en ratas. El siguiente artículo describe la medición no invasiva de la dilatación mediada por flujo en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas.
Introduction
El endotelio vascular es una monocapa celular que recubre el lumen de las arterias y es un regulador importante de la función vascular. Hay numerosas moléculas liberadas desde el endotelio que resultan en la modulación de diámetro del vaso sanguíneo. Entre estas moléculas, el óxido nítrico (NO), que parece ser la molécula vasodilatadora primario liberado del endotelio vascular en respuesta a la estimulación (por ejemplo, insulina, la acetilcolina, o cambios en la tensión de cizallamiento) 1. En el endotelio vascular, NO es producido por la enzima NO sintasa endotelial (eNOS) y se libera posteriormente a partir de células endoteliales 2. NO se difunde en el músculo liso vascular donde causa la relajación y el aumento de diámetro recipiente 3.
La disfunción endotelial se puede evaluar de forma no invasiva en humanos utilizando la técnica de 4,5 dilatación mediada por flujo (FMD). Fiebre aftosa se ha propuesto para representar un bioensayo funcional para derivado del endotelioNO biodisponibilidad en seres humanos, y se evalúa típicamente en la arteria braquial o femoral superficial en respuesta a la hiperemia reactiva siguiente a ~ 5 min de oclusión del miembro 6. Hiperemia reactiva aumenta las fuerzas de cizalla laminar que se transducen a la célula endotelial 7, señalización de una liberación de NO 8. Aunque en los últimos años, la proporción de la vasodilatación iniciado por la liberación de NO se ha debatido 9,10, la fiebre aftosa es indicativo de la dilatación dependiente del endotelio y consistentemente se ha demostrado para predecir eventos cardiovasculares 11-13.
Hasta la fecha, miles de estudios han empleado la técnica de la fiebre aftosa para la medición no invasiva de la función endotelial en los seres humanos. Teniendo en cuenta el reciente cambio en el enfoque de la investigación traslacional, directrices para la medición no invasiva de la fiebre aftosa en los roedores serían extremadamente valiosa. Siguiendo con un enfoque traslacional, se estableció este protocolo para la medición de la fiebre aftosa en braquial y supearterias femorales rficial de ratas, como estos sitios se miden más comúnmente en los seres humanos. Este protocolo da como resultado un sólido y repetible respuesta de la fiebre aftosa en ratas, sin embargo, la medición de la fiebre aftosa en ratas es técnicamente exigente y puede ser difícil para que otros investigadores puedan replicarse sin demostración en vídeo. Por lo tanto, el siguiente artículo demostrará un método para la medición no invasiva de la fiebre aftosa en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas.
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Protocol
Todos los animales procedimientos conformes a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y 14 fueron aprobados por la Universidad de Utah y Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Cuidado de Animales y el empleo.
1. Preparación de los animales
- Lugar de los animales en la cámara de inducción de la anestesia que contiene 3% de isoflurano en oxígeno al 100%. Dejar al animal en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos.
- Retire el animal de la cámara de inducción y colocarlo sobre una mesa de examen climatizada equipada con electrodos de electrocardiograma (ECG). Mantener la anestesia en el 3% isoflurano en oxígeno al 100%. arteria femoral y braquial superficial de la fiebre aftosa no se puede realizar de forma simultánea. Por lo tanto, las instrucciones de preparación para cada medición se enumeran a continuación.
2. Preparación de la arteria braquial
- Coloque el supina animal y frenar el miembro superior izquierdo y cada miembro inferior de la unatremo de la mesa de examen con cinta quirúrgica.
- Restringir el miembro superior derecho del animal, de modo que la porción inferior del miembro superior se eleva ligeramente (~ 0,2-0,5 cm) por encima de la plataforma.
- Aplicar agente depilatorio (por ejemplo, Nair) para miembro superior derecho del animal para eliminar el vello.
- Posicionar un manguito de oclusión (10 mm de diámetro de la luz de oclusión vascular estándar) a la derecha distal del miembro superior hasta el codo. No se apoye con el oclusor en la plataforma, ya que la inflación / deflación mover la extremidad y perturbar las imágenes de ultrasonido.
- Ajuste la máquina de ultrasonido a modo B usando el teclado de ultrasonido.
- Aplicar una pequeña cantidad de gel de ultrasonido para la extremidad superior del animal, proximal al manguito oclusión.
- alinear manualmente un transductor de ultra-alta frecuencia lineal unido a un soporte estereotáctico con la extremidad superior. La arteria braquial debe ser visible 2-3 mm de profundidad.
- Para confirmar que la arteria braquial, no la vena braquial, se estáfotografiado, cambiar a PW-modo de usar el teclado de ultrasonido. La arteria tendrá flujo sanguíneo pulsátil en oposición a la vena adyacente que tendrá el flujo de sangre continuo.
3. Preparación de la arteria femoral superficial
- Coloque el supina animal y frenar las extremidades superiores y el miembro inferior izquierda a la mesa de examen con cinta quirúrgica.
- Frenar el miembro inferior derecho del animal a una posición elevada (~ 0,5-1 cm) por encima de la plataforma utilizando una almohadilla (por ejemplo, toallas de papel plegadas).
- Aplicar agente depilatorio (por ejemplo, Nair) a la derecha del animal miembro inferior para eliminar el vello. Después de la eliminación del vello de la vena femoral debe ser claramente visible en la parte interior del muslo.
- Posicionar un manguito de oclusión (10 mm de diámetro de la luz de oclusión vascular estándar) proximal al tobillo derecho. No se apoye con el oclusor en la plataforma, ya que la inflación / deflación se moverá el miembro inferior y perturbar las imágenes de ultrasonido.
- Configurar la máquina de ultrasonido paraB-mode.
- Aplicar una pequeña cantidad de gel de ultrasonido a la extremidad inferior del animal, proximal al manguito oclusión.
- alinear manualmente un transductor de ultra-alta frecuencia lineal unido a un soporte estereotáctico con la vena femoral, que es visible a través de la piel. La arteria femoral superficial debe ser visible <1 mm de profundidad.
- Para confirmar que la arteria femoral superficial, no la vena femoral, se está formando la imagen, cambiar a PW-mode. La arteria tendrá flujo sanguíneo pulsátil en oposición a la vena adyacente que tendrá el flujo de sangre continuo.
4. fase basal
- Optimizar la imagen en modo B, similar a la forma en que se llevaría a cabo en humanos 15. Asegúrese de que se observa una imagen horizontal longitudinal del buque con la íntima-media visualizados en ambas paredes. Optimizar la imagen ajustando ligeramente la colocación de la sonda de ultrasonido para asegurar que la mayor cantidad de la arteria como sea posible es visible en la ventana de captura.
- Como alternativa, ajustar la configuración de ultrasonido para obtener una imagen mejor al cambiar el brillo / contraste, zonas focales, frecuencia, rango dinámico, y la densidad de líneas. Hay otras maneras de optimizar la imagen de ultrasonido, pero descripción detallada de los están más allá del alcance de este protocolo.
- Después de la optimización de las imágenes de las arterias, gire en el ECG-gating para mostrar sólo las imágenes capturadas durante la onda R para asegurar que sólo un marco de diámetro se recoge son en cada porción diastólica de un ciclo cardiaco.
NOTA: ECG-gating está disponible en la máquina de ultrasonido utilizado en este protocolo mediante la selección de ECG-gating en la opción de ajustes fisiológicos, sin embargo, esta característica no esté disponible en todas las máquinas de ultrasonido. ECG-gating debe ser activado después de que la imagen está optimizado, ya que es difícil obtener una imagen a velocidades de cuadro más bajas (es decir, una vez por la onda R). Sin ECG-gating, la combinación de una alta frecuencia cardiaca en ratas y el requisito de un bastidor de altatasa para capturar la parte diastólica del ciclo cardíaco sólo permite ~ 10-20 segundos de clips. El tamaño engorroso y cantidad de datos en cada clip aumenta la carga de análisis sustancialmente. - La ficha 60 segundos de datos de referencia utilizando el modo B.
NOTA: La máquina de ultrasonido siempre está grabando, sin embargo, no todas las imágenes se almacenan en la máquina de ultrasonido, ya que hay un límite en el número de fotogramas que se pueden grabar en un clip de ultrasonido. La longitud del clip (es decir, número de tramas) se puede ajustar en la configuración. Se sugiere establecer para el número máximo de fotogramas por clip. Cuando la grabación está en el extremo de un clip (es decir, el número máximo de tramas alcanza), la grabación continúa, pero el clip rollos hacia adelante la captura de los fotogramas más recientes. En este caso, las tramas anteriores que fueron capturados fuera del límite máximo de la trama se eliminan posteriormente. Si bien estas complejidades en la grabación difieren entre las máquinas, puede ser necesario un ajuste de la duración de la grabación. - Switch a PW-mode. Coloque el cursor en el centro del lumen. puertas de ejemplo se colocan automáticamente en referencia al cursor, pero se pueden ajustar para la anchura utilizando el teclado de ultrasonido. Mantener un ángulo de insonación ≤ 60 °.
- Ajustar el ángulo insonación alterando el ángulo del haz Doppler. Hacer ajustes precisos en el ángulo mediante el teclado de ultrasonido. Si ninguno de ellos proporcionan un ángulo adecuado para la medición, ajustar manualmente la sonda de ultrasonido por la inclinación de la arteria de un ángulo de más óptima. Si no se realiza ningún ajuste del ángulo de ultrasonido, recuperar imágenes en modo B.
- Grabar 10 segundos de datos de velocidad.
5. Fase de Oclusión
- Inflar el oclusor vascular utilizando una jeringa de 10 ml llena de aire. Para mantener constante la presión de aire en el dispositivo de oclusión vascular, doble el tubo sobre sí mismo y colocar un clip de la carpeta en el tubo plegado.
- Cambiar a PW-mode para confirmar la oclusión del manguito, como lo demuestrauna gran reducción de velocidad de la sangre.
- Cambiar a los datos en modo B y el récord en 60 segundos de clips, hasta las 4:45 min de oclusión.
- Cambiar a PW-mode. Mantener un registro de la frecuencia cardíaca y el tiempo de cada clip de ultrasonido para su análisis.
6. Fase hiperemia
- Suelte el manguito durante la grabación en el modo PW-quitando el clip de la carpeta del tubo plegado. La ficha 5 segundos antes y 5 segundos después de la liberación del manguito.
- Cambiar a los datos en modo B y el récord en 60 segundos de clips de hasta 3 minutos después de la oclusión. Mantener un registro de la frecuencia cardíaca y el tiempo de cada clip de ultrasonido para su análisis.
- Después de la terminación de la fiebre aftosa retire al animal de la mesa de examen y seguimiento hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
7. Análisis
- Para el análisis, el ultrasonido de exportación como archivos DICOM a un equipo fuera de línea equipado con el software de detección de bordes, que permite imparcial disuadirminación del diámetro de la arteria en cada fotograma. El análisis es posible en la máquina de ecografía, sin embargo, no es recomendable, ya que es extremadamente intensiva en tiempo y sujeto a sesgo del investigador.
- Analizar los datos de diámetro de la arteria en 60 segundos segmentos durante la fase de línea de base y la oclusión, y en 10 segundos segmentos durante la fase de hiperemia.
- Analizar los datos de velocidad de la sangre utilizando las capacidades de análisis de flujo del software automatizado de detección de bordes. Determinar la velocidad media de la sangre mediante la medición de 5 o más formas de onda consecutivos de apariencia uniforme durante las fases iniciales y de oclusión. Determinar la velocidad media de la sangre durante la hiperemia reactiva para velocidades de la sangre inmediatamente después de la liberación del manguito. La forma de onda con la más alta velocidad de la sangre se considera la velocidad sanguínea alta.
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Representative Results
la dilatación mediada por flujo se realizó en el braquial y la arteria femoral superficial de 8 ratas Wistar. Posicionamiento de una rata se muestra en la Figura 1.
Las imágenes por ultrasonido representativas de la arteria femoral superficial se muestran en la Figura 2.
Figura 1. Rata y el posicionamiento de ultrasonido.
Posicionamiento de rata para la medición del brazo (A) y femoral superficial (B) de la arteria de la fiebre aftosa. Posicionamiento de la sonda de ultrasonido y la oclusión arterial para la medición de brazo (C) y femoral superficial (D) de la arteria de la fiebre aftosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de ultrasonido.
imagen de ultrasonido de la arteria femoral superficial utilizando imágenes en modo B para la determinación del diámetro (A). velocidad de la sangre se determinó utilizando PW-mode. Se muestra en la figura son velocidad de la sangre al inicio del estudio (B), la reducción de la velocidad de la sangre durante la fase de oclusión (C), y el rápido aumento de la velocidad de la sangre en la liberación del manguito durante la fase de hiperemia (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se muestra en la Figura 3, hay una respuesta vasodilatadora similar entre el brazo y las arterias femorales superficiales. Cuando se expresa como un porcentaje de la línea de base, la fiebre aftosa fue similar entre las arterias, sin embargo, cuando explícitod como un cambio absoluto de la línea de base, la fiebre aftosa fue significativamente mayor en la arteria braquial (P <0,05). Esta diferencia se debe probablemente a un diámetro recipiente más grande en la arteria braquial que en la arteria femoral superficial (498 ± 28 frente a 397 ± 11 m, P <0,05). Al igual que en la medición de la fiebre aftosa en los seres humanos 16, coeficiente de variación para intersession braquial y la fiebre aftosa femoral superficial eran 9 ± 1 y 10 ± 4%, respectivamente. A pesar de las diferencias en el tamaño del buque, hubo una fuerte relación lineal entre el brazo y la fiebre aftosa arteria femoral superficial cuando se expresa como un porcentaje o cambio absoluto desde el valor inicial.
Dilatación Figura 3. Flow-mediada en ratas.
La vasodilatación de la braquial y femoralartery superficial después de un período de 5 min de isquemia de las extremidades expresa como porcentaje (A) y absoluto (B) Cambio desde el inicio. La fiebre aftosa fue similar entre las arterias cuando se expresa como un porcentaje del valor de referencia (C). Sin embargo, cuando se expresa como un cambio absoluto de la línea de base (D), la fiebre aftosa fue significativamente mayor en la arteria braquial. Ya sea expresado como un porcentaje (E) o cambio absoluto (F) desde el inicio, hubo una fuerte relación entre la presencia de fiebre aftosa braquial y femoral superficial. * P <0,05 frente a la arteria braquial. Los valores son medias ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se muestra en la Tabla 1, se midieron las variables cardiovasculares durante la línea base, la oclusión, y las fases hiperémicos. diámetro de la arteria se determinó utilizando la íntima de la íntima-a-o distancia de comunicación a los medios de comunicación durante la parte diastólica del ciclo cardíaco. diámetro de la arteria se midió durante 60 segundos en la línea base y continuamente in ~ 60 segundos intervalos a través de la oclusión y fases hiperémicos. velocidad de la sangre se determinó utilizando la velocidad arterial media de la sangre en el lumen durante un ciclo cardiaco. El flujo de sangre se calculó como por la ecuación: flujo sanguíneo (l / min) = (velocidad de la sangre (m / s) · π · [diámetro de los vasos (m) / 2] 2 · 60). Velocidad de cizallamiento se calculó según la ecuación: velocidad de cizallamiento (s -1) = velocidad de la sangre · diámetro 8 / recipiente. La fiebre aftosa se calculó según la ecuación: FA = (diámetro máximo buque - diámetro del vaso de referencia) / diámetro del vaso de referencia.
| Arteria braquial | Arteria femoral superficial | |
| fase basal | ||
| Del ritmo cardíaco, bpm | 367 ± 12 | 368 ± 16 |
| Diámetro, micras | 498 ± 28 | 397 ± 11 * |
| Velocidad de la sangre, m / seg | 85 ± 8 | 76 ± 11 |
| Flujo sanguíneo, l / min | 1.027 ± 147 | 568 ± 90 * |
| Velocidad de cizallamiento, s -1 | 1,4 ± 0,1 | 1,5 ± 0,2 |
| Fase de oclusión | ||
| Del ritmo cardíaco, bpm | 362 ± 12 | 359 ± 14 |
| Diámetro, micras | 499 ± 32 | 390 ± 11 * † |
| Velocidad de la sangre, m / seg | 63 ± 9 † | 38 ± 8 † |
| Flujo sanguíneo, l / min | 722 ± 122 † | 272 ± 62 * † |
| Velocidad de cizallamiento, s -1 | 1,0 ± 0,2 † | 0,8 ± 0,2 † |
| Fase hiperémica | ||
| Del ritmo cardíaco, bpm | 363 ± 12 | 357 ± 12 |
| Diámetro máximo, m | 586 ± 22 † ‡ | 457 ± 15 * † ‡ |
| Pico de velocidad de la sangre, m / seg | 149 ± 11 † ‡ | 205 ± 12 * † ‡ |
| Pico de Flujo sanguíneo, l / min | 1.778 ± 229 † ‡ | 1.495 ± 127 † ‡ |
| Pico de velocidad de cizalladura, s -1 | 2,5 ± 0,3 † ‡ | 3,7 ± 0,2 * † ‡ |
| * P <0,05 frente a la arteria braquial. </ Td> | ||
| † p <0,05 frente de línea de base de fase. | ||
| ‡ p <0,05 frente a la oclusión de fase. | ||
| Los valores son medias ± SEM. |
Tabla 1. Variables cardiovascular a través de cada fase del protocolo.
No hubo cambios en la frecuencia cardíaca a lo largo de cualquiera de los protocolos, así como entre las mediciones de la arteria (P> 0,05). El diámetro de la arteria braquial fue significativamente más grande que el de la arteria femoral superficial (P <0,05). Durante la fase de oclusión, hubo una reducción significativa en la velocidad de la sangre, el flujo de sangre, y la velocidad de cizalladura en comparación con la línea de base en ambas arterias (P <0,05). Tras la liberación del manguito, la velocidad máxima en sangre, el flujo de sangre, y la velocidad de cizalla fueron significativamente más altos que las fases iniciales o de oclusión de ambas arterias (P <0,05). De manera similar a la medición de la hiperemia reactiva en los seres humanos 16, coeficiente de intercesión de variación para braquial y superficial hiperemia reactiva femoral fueron 24 ± 9 y 19 ± 5%, respectivamente. Hubo diferencias en velocidad de la sangre, el flujo de sangre, y la velocidad de cizallamiento entre las arterias, debido en gran parte a la diferencia de diámetro de la arteria.
Después de normalizar a pico velocidad de cizallamiento, la vasodilatación fue mayor en la arteria braquial (Figura 4). Esto también es cierto para la fiebre aftosa expresa como un cambio absoluto de la línea de base. Sin embargo, a pesar de las diferencias en magnitud, había una relación lineal fuerte en porcentaje y absoluto de la fiebre aftosa normalizó a pico velocidad de cizallamiento entre el braquial y la arteria femoral superficial.
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La dilatación normalizado a su punto máximo la velocidad de cizallamiento en ratas Figura 4. mediada por flujo.
Después de la normalización para alcanzar su punto máximo la velocidad de cizallamiento, la fiebre aftosa expressedas un porcentaje (A) o cambio absoluto (B) respecto al valor basal fue mayor en la arteria braquial en comparación con la arteria femoral superficial.
A pesar de las diferencias entre las arterias en la fiebre aftosa normalizados a pico velocidad de cizallamiento, había una fuerte relación entre braquial y arterias femorales superficiales cuando la fiebre aftosa se expresó como un porcentaje (C) o cambio absoluto (D) de la línea de base. * P <0,05 frente a la arteria braquial. Los valores son medias ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el presente estudio, la medición no invasiva de la fiebre aftosa se demostró en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas. Al igual que en los seres humanos 6, después de un período de oclusión 5 min, hubo un rápido aumento de la velocidad de la sangre (es decir, la hiperemia reactiva) lo que aumenta la velocidad de cizallamiento en la pared arterial, lo que dio lugar a la vasodilatación posterior de la arteria. La fiebre aftosa se observó tanto en el braquial y femoral superficial. Además, hubo una fuerte relación entre la fiebre aftosa en las arterias. Aunque la tasa de cizallamiento máximo era más alta en la arteria femoral superficial, la fiebre aftosa normalizó a pico velocidad de cizallamiento mantiene una fuerte relación entre las arterias. En conjunto, estos resultados indican que la medición no invasiva de la fiebre aftosa puede realizarse con éxito en ratas.
Aunque la medición de la fiebre aftosa se realizó en dos arterias diferentes, la magnitud de la fiebre aftosa fue similar cuando se expresa como un porcentaje de cambio respecto al valor basal. however, cuando se expresa como un cambio absoluto de la línea de base, la fiebre aftosa fue mayor en la arteria braquial, como la arteria tenía un diámetro de descanso ~ 25% más grande que la arteria femoral superficial. Estos resultados son similares a los de los estudios en humanos en los que la fiebre aftosa se midió en el brazo y las arterias femorales superficiales en los mismos sujetos 17,18. A pesar de las diferencias en el diámetro arterial, la relación de la fiebre aftosa, expresado como un por ciento o cambio absoluto de la línea de base, era extremadamente fuerte entre las arterias.
La dilatación mediada por flujo se ha propuesto para representar un bioensayo funcional para NO derivado del endotelio biodisponibilidad en humanos 6, como se produce la vasodilatación a través de la liberación de NO desde el endotelio en respuesta a un aumento de la velocidad de cizallamiento de 1,3. Por lo tanto, una mayor fiebre aftosa normalizó a pico velocidad de cizallamiento representa un endotelio que se ha incrementado la sensibilidad de un determinado incremento de la velocidad de cizallamiento. Después de la normalización de la fiebre aftosa a pico velocidad de cizallamiento, la fiebre aftosa fue mayor en el Bracharteria ial, independientemente de si éste se expresa como un porcentaje o cambio absoluto de la línea de base. A pesar de las diferencias en la magnitud de la fiebre aftosa normalizaron a pico velocidad de cizallamiento entre braquial y arterias femorales superficiales, había una fuerte relación lineal en porcentaje y absoluto de la fiebre aftosa normalizó a pico velocidad de cizallamiento entre las arterias.
En el presente estudio, la medición no invasiva de la fiebre aftosa se describe en el braquial y femoral superficial con manguito distal oclusión de la sonda de ultrasonido. Esta colocación del manguito fue seleccionado por varias razones, 1.) en los seres humanos, esto es más comúnmente método utilizado para medir la fiebre aftosa, 2.) la contribución de NO a la fiebre aftosa se ha demostrado que ser mayor cuando la medición del diámetro de la arteria es proximal al sitio de la oclusión 9 y 3.) hubo dificultades en el mantenimiento de la imagen de ultrasonido después de inflado del manguito cuando el lugar de medición fue distal a la oclusión. Aunque este procedimiento representa una medición no invasiva de la fiebre aftosa,otros han realizado de la fiebre aftosa en ratas vivas mediante una oclusión quirúrgica de la arteria ilíaca común con distal de medición de ultrasonido a la oclusión en la arteria femoral 19. La fiebre aftosa de respuestas utilizando el protocolo descrito por primera vez por Heiss y col. fue inhibida por la infusión de inhibidores de la eNOS. De hecho, este procedimiento se ha utilizado para demostrar que los aumentos farmacológicos en NO intracelular mejora de la fiebre aftosa en dos modelos de rata de la disfunción endotelial y la hipertensión 20, y la exposición al humo de segunda mano los resultados en un deterioro de la fiebre aftosa en ratas 21,22. Estos estudios demuestran la contribución de NO a la fiebre aftosa en ratas y establecer la relación de la fiebre aftosa a la salud cardiovascular. Sin embargo, ya que esta técnica es invasiva, que podría limitar la capacidad de medir la fiebre aftosa longitudinalmente en las mismas ratas durante un período de semanas a años. Utilizando un método similar al del presente estudio, dos estudios recientes han realizado la medición no invasiva de la fiebre aftosa en la extremidad posterior de ratones 23,24,pero hubo algunas variaciones entre los estudios técnicos (es decir, por supuesto tiempo de medición y la colocación de la sonda de ultrasonido y oclusión arterial). Debido a las discrepancias entre estos estudios y la dificultad de replicar estos resultados, la medición no invasiva de la fiebre aftosa en ratas se intentó en cambio, como las ratas se utilizan comúnmente en la investigación traslacional, pero tienen un tamaño corporal y de los vasos sanguíneos grandes que los ratones. Si bien la medición de la fiebre aftosa en la arteria femoral de roedores en general no es novela, ningún estudio ha realizado la medición de la fiebre aftosa en la arteria braquial de los roedores vivos. La fuerte relación de la fiebre aftosa entre las extremidades en el presente estudio puede ilustrar el carácter sistémico de la función endotelial, sino que también proporciona un método para no invasiva de medir la fiebre aftosa en los animales que han interrumpido el flujo sanguíneo en las extremidades posteriores (por ejemplo, femoral fístula arteriovenosa).
La optimización y el mantenimiento de unas imágenes de ultrasonido de alta calidad son habilidades críticas requeridas para este procedire y requiere mucha práctica. Por ejemplo, para la medición de la fiebre aftosa en los seres humanos, se sugiere que al menos 100 exploraciones supervisadas se realizan antes de escanear de forma independiente 5. En ocasiones, la imagen puede cambiar durante la oclusión del manguito y requieren pequeños ajustes de la sonda de ultrasonido. Un paso crítico en este protocolo está cambiando entre el modo B y PW-mode en momentos específicos. B-modo simultáneo e imágenes PW-mode no son posibles en la máquina de ultrasonido utilizado en este protocolo. Por lo tanto, se requiere para cambiar rápidamente entre los modos de ultrasonido para capturar mediciones de velocidad y de diámetro durante segmentos de tiempo específicos. Tener un protocolo escrito y practicar la realización del protocolo mejorará en gran medida la eficiencia de cambiar entre los modos de ultrasonido. Teniendo en cuenta la naturaleza sensible al tiempo de grabaciones de ultrasonido durante este protocolo, se producen errores, así que esté preparado para anotar cualquier anomalía de protocolo, como el olvido de capturar un clip de ultrasonido.Falta un clip de ultrasonido durante la fase de oclusión no es crítica, sin embargo, si una grabación se pierde durante la fase de hiperemia reactiva se sugiere para llevar a cabo el procedimiento de nuevo después de al menos 30 min han pasado 25.
Como con cualquier estudio hay limitaciones en el protocolo experimental. En este estudio, la anestesia se administró a ratas bajo 100% de oxígeno, por lo tanto, las mediciones de la fiebre aftosa pueden también reflejar vasorreactividad a la hiperoxia. Otras formas de anestesia, tales como pentobarbital de sodio podría ser utilizado para crear un perfil de gas más sangre representante para los seres humanos y eliminar esta preocupación. La presión arterial no se controla en cualquier punto de este protocolo. Aunque la presión de la sangre no cambia en respuesta a la oclusión del manguito aguda en humanos, se desconoce si cualquier cambio transitorio de la presión arterial se produciría en ratas. Además, se utiliza aire comprimido para llenar el oclusor vascular, sin embargo, el llenado con agua puede haber dado lugar a una oclusión más firmede flujo de la sangre como el agua no es tan compresible como el aire. Por último, la medición no invasiva de la fiebre aftosa en condiciones en las que se inhibe la eNOS (es decir, la infusión de L-NMMA) No se han realizado. Por lo tanto, la contribución de NO a la fiebre aftosa, ya que se lleva a cabo en este protocolo, no se ha determinado.
En conclusión, este artículo ha demostrado un protocolo para la medición no invasiva de la fiebre aftosa en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas. En conjunción con el reciente cambio en el enfoque de la investigación traslacional, la evaluación de la fiebre aftosa en ratas puede proporcionar una valiosa herramienta para convertir los resultados en los seres humanos a las ratas, así como proporcionar la capacidad para evaluar la función endotelial en varios puntos temporales en los estudios longitudinales de ratas recibir diferentes tratamientos. De hecho, la reducción de la fiebre aftosa se acompañan de rigidez arterial aórtica se han observado después de daño renal en un modelo de rata de insuficiencia renal crónica (resultados no publicados), lo que demuestra la aplicaciónlicación de la fiebre aftosa no invasiva como un marcador de la función vascular en estudios con animales longitudinales. Los estudios futuros para investigar los mecanismos de la fiebre aftosa en ratas están garantizados y se proporcionará más información sobre la medición no invasiva de la fiebre aftosa en los seres humanos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optional |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore surgical tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatory cream (e.g., Nair) | General supply | ||
| Cotton swabs | General supply | ||
| Ultrasound gel | General supply | ||
| Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml syringe with Luer-Lok tip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Paperclip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Hypodermic needle – 18 gauge | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Medium binder clip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus |
References
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S.
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C.
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070 (2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
