Summary
valutazione non invasiva della funzione endoteliale in esseri umani può essere determinata mediante la tecnica dilatazione flusso-mediata. Anche se migliaia di studi hanno utilizzato questa tecnica, nessuno studio ha eseguito questa tecnica non invasiva nei ratti. Il seguente articolo descrive la misurazione non invasiva della dilatazione flusso-mediata nel brachiale e superficiali arterie femorali di ratti.
Introduction
L'endotelio vascolare è un monostrato cellulare che riveste la lume delle arterie ed è un importante regolatore della funzione vascolare. Ci sono numerose molecole rilasciate dal endotelio che provocano modulazione del diametro del vaso sanguigno. Tra queste molecole, ossido nitrico (NO), sembra essere la molecola vasodilatatrice primario rilasciato dall'endotelio vascolare in risposta alla stimolazione (ad esempio, insulina, acetilcolina, o cambiamenti nella sollecitazione di taglio) 1. Nel endotelio vascolare, NO è prodotto dall'enzima NO sintetasi endoteliale (eNOS) e viene successivamente rilasciato dalle cellule endoteliali 2. Diffonde NO al muscolo liscia vascolare dove provoca il rilassamento e l'aumento vaso di diametro 3.
La disfunzione endoteliale può essere valutato in modo non invasivo negli esseri umani usando la dilatazione flusso-mediata (FMD) tecnica di 4,5. FMD è stato proposto per rappresentare un saggio biologico funzionale per endotelio-derivatoNO biodisponibilità negli esseri umani, ed è tipicamente valutato al brachiale o femorale superficiale in risposta ad iperemia reattiva in seguito a ~ 5 min arto occlusione 6. Iperemia reattiva aumenta le forze di taglio laminare che sono trasduzione al cellule endoteliali 7, segnalando un rilascio di NO 8. Anche se negli ultimi anni, la percentuale di vasodilatazione avviato dal rilascio di NO è stata dibattuta 9,10, l'afta epizootica è indicativo della dilatazione endotelio-dipendente ed è stato costantemente dimostrato di predire gli eventi cardiovascolari 11-13.
Ad oggi, migliaia di studi hanno impiegato la tecnica FMD per la misurazione non invasiva della funzione endoteliale nell'uomo. Considerando il recente cambiamento di messa a fuoco per la ricerca traslazionale, le linee guida per la misurazione non invasiva di afta epizootica nei roditori sarebbe estremamente prezioso. Mantenere con un approccio traslazionale, questo protocollo è stato istituito per la misura di afta epizootica in brachiale e superficial arterie femorali di ratti, come quei siti sono più comunemente misurati negli esseri umani. Questo protocollo si traduce in un robusto e ripetibile risposta afta epizootica nei ratti, tuttavia, la misura di afta epizootica nei ratti è tecnicamente impegnativo e può essere difficile per gli altri investigatori di replicare senza video dimostrativo. Pertanto, l'articolo dimostrerà un metodo per la misurazione non invasiva della FMD nel brachiale e superficiali arterie femorali di ratti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali conformi alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio 14 e sono stati approvati dalla University of Utah e Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center cura degli animali e Usa.
1. Preparazione degli animali
- Posizionare animale nella camera di induzione dell'anestesia contenente 3% isoflurano in ossigeno al 100%. Lasciare l'animale in camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni.
- Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo su un lettino riscaldato dotato di elettrodi dell'elettrocardiogramma (ECG). Mantenere l'anestesia al 3% isoflurano in ossigeno al 100%. Brachiale e femorale superficiale afta epizootica non può essere eseguita contemporaneamente. Pertanto, le istruzioni di preparazione per ogni misurazione sono elencati di seguito.
2. brachiale Preparazione
- Posizionare la supina animale e trattenere l'arto superiore sinistro e ciascun arto inferiore della unIMAL al lettino con del nastro adesivo chirurgico.
- Trattenere l'arto superiore destro dell'animale, in modo che la porzione inferiore dell'arto superiore è leggermente elevata (~ 0,2-0,5 cm) sopra la piattaforma.
- Applicare agente depilatorio (ad esempio, Nair) per arto superiore destro dell'animale per rimuovere i capelli.
- Posizionare un bracciale occlusione (10 mm di diametro del lume vascolare occlusore standard) a destra arto distale superiore al gomito. Non appoggiare il occlusore sulla piattaforma, come gonfiaggio / sgonfiaggio si muoverà l'arto e disturbare le immagini ad ultrasuoni.
- Impostare la macchina ad ultrasuoni per B-mode utilizzando la tastiera ultrasuoni.
- Applicare una piccola quantità di gel ultrasuoni per l'arto superiore dell'animale, prossimale al bracciale occlusione.
- allineare manualmente un trasduttore lineare di frequenza ultra-alta attaccato ad un supporto stereotassica con l'arto superiore. L'arteria brachiale dovrebbe essere visibile 2-3 mm di profondità.
- Per confermare che l'arteria brachiale, non la vena brachiale, è in corsoripreso, passare alla PW-mode utilizzando la tastiera ultrasuoni. L'arteria avrà flusso sanguigno pulsatile rispetto alla vena adiacente che avrà il flusso di sangue continuo.
3. superficiale femorale Arteria Preparazione
- Posizionare la supina animale e trattenere gli arti superiori e l'arto inferiore sinistro al lettino con nastro chirurgico.
- Trattenere inferiore destro dell'animale ad una posizione elevata (~ 0,5-1 cm) al di sopra della piattaforma utilizzando un pad (ad esempio, asciugamani di carta piegati).
- Applicare agente depilatorio (ad esempio, Nair) per il diritto degli animali arto inferiore per rimuovere i capelli. Dopo la rimozione dei capelli vena femorale deve essere chiaramente visibile nella coscia superiore.
- Posizionare un bracciale occlusione (10 mm di diametro del lume vascolare occlusore standard) prossimale alla caviglia destra. Non appoggiare il occlusore sulla piattaforma, come gonfiaggio / sgonfiaggio si sposterà l'arto inferiore e disturbare le immagini ad ultrasuoni.
- Impostare la macchina ad ultrasuoni perB-mode.
- Applicare una piccola quantità di gel ultrasuoni per l'arto inferiore dell'animale, prossimale al bracciale occlusione.
- allineare manualmente un trasduttore lineare di frequenza ultraelevata attaccato ad un supporto stereotassica con la vena femorale, che è visibile attraverso la pelle. L'arteria femorale superficiale dovrebbe essere visibile <1 mm di profondità.
- Per confermare che l'arteria femorale superficiale, non la vena femorale, viene esposta, passare alla PW-mode. L'arteria avrà flusso sanguigno pulsatile rispetto alla vena adiacente che avrà il flusso di sangue continuo.
4. Fase di base
- Ottimizzare l'immagine B-mode, simile a come sarebbe stato fatto negli esseri umani 15. Assicurarsi che una orizzontale, immagine longitudinale della nave con intima-media visualizzati in entrambe le pareti si osserva. Ottimizzare l'immagine leggermente regolando il posizionamento della sonda ecografica per garantire che il maggior numero di arterie possibile è visibile nella finestra di acquisizione.
- In alternativa, regolare le impostazioni ultrasuoni per ottenere una migliore immagine cambiando la luminosità / contrasto, zone focali, la frequenza, la gamma dinamica e la densità di linea. Ci sono altri modi per ottimizzare l'immagine ecografica, ma la descrizione dettagliata di questi sono oltre la portata di questo protocollo.
- Dopo l'ottimizzazione delle immagini delle arterie, accendere ECG-gating per visualizzare solo le immagini acquisite durante l'onda R per garantire che solo un fotogramma di diametro vengono raccolti sono in ogni porzione diastolica del ciclo cardiaco.
NOTA: ECG-gating è disponibile sulla macchina a ultrasuoni utilizzati in questo protocollo selezionando ECG-gating sotto l'opzione Impostazioni fisiologici, tuttavia, questa funzione potrebbe non essere disponibile su tutte le macchine a ultrasuoni. ECG-gating deve essere attivata dopo che l'immagine è ottimizzato, in quanto è difficile ottenere un'immagine a basso frame rate (cioè, una volta per onda R). Senza ECG-gating, la combinazione di una frequenza cardiaca elevata nei ratti e l'esigenza di un telaio altorate per catturare la porzione diastolica del ciclo cardiaco consente solo ~ 10-20 secondi di clip. Le dimensioni ingombranti e la quantità di dati in ogni clip aumenta il carico di analisi sostanzialmente. - Record 60 secondi di dati di base utilizzando B-mode.
NOTA: La macchina ad ultrasuoni è sempre registrando, però, non tutte le immagini sono memorizzate sulla macchina ad ultrasuoni, in quanto vi è un limite al numero di fotogrammi che è possibile registrare in un clip ad ultrasuoni. La lunghezza della clip (cioè, il numero di fotogrammi) può essere regolata nelle impostazioni. Si suggerisce di impostare per il numero massimo di fotogrammi al clip. Quando la registrazione è alla fine di una clip (cioè, il numero massimo di frame raggiunto), la registrazione continua, ma la clip rotola in avanti catturare i frame più recenti. In questo caso, frame precedenti che sono stati catturati all'esterno del limite massimo fotogramma vengono successivamente eliminati. Mentre queste complessità di registrazione differiscono tra le macchine, regolazione della lunghezza della registrazione può essere necessario. - Switch di PW-mode. Posizionare il cursore al centro del lume. cancelli campione saranno inseriti automaticamente in riferimento al cursore, ma possono essere regolati per la larghezza utilizzando la tastiera ultrasuoni. Mantenere un angolo insonazione di ≤60 °.
- Regolare l'angolo insonazione alterando l'angolo del fascio Doppler. Effettuare regolazioni fini l'angolo utilizzando la tastiera ultrasuoni. Se nessuno di questi forniscono un angolo adatto per la misurazione, regolare manualmente la sonda ecografica inclinando l'arteria ad un angolo più ottimale. Se viene eseguita alcuna regolazione dell'angolo di ultrasuoni, riprendere le immagini B-mode.
- Registrare 10 secondi di dati di velocità.
5. occlusione Phase
- Gonfiare il occlusore vascolare utilizzando un siringa da 10 ml piena di aria. Per mantenere costante la pressione dell'aria nel occluder vascolare, piegare il tubo su se stessa e posizionare un legante clip sul tubo piegato.
- Passa alla PW-mode per confermare l'occlusione della cuffia, come dimostrauna grande riduzione della velocità del sangue.
- Passare ai dati B-mode e registrare in 60 secondi di clip, fino 4:45 min di occlusione.
- Passa alla PW-mode. Tenere un registro di frequenza cardiaca e il tempo di ogni clip ultrasuoni per l'analisi.
6. Fase iperemiche
- Rilasciare il bracciale durante la registrazione in PW-mode rimuovendo la clip legante dal tubo piegato. Registrare 5 secondi prima e 5 secondi dopo il rilascio del bracciale.
- Passare ai dati B-mode e registrare in 60 secondi di clip fino a 3 minuti dopo l'occlusione. Tenere un registro di frequenza cardiaca e il tempo di ogni clip ultrasuoni per l'analisi.
- Dopo il completamento di afta epizootica rimuovere l'animale dal lettino e monitorare fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
7. Analisi
- Per l'analisi, l'esportazione ad ultrasuoni come file DICOM a un computer collegato dotato di software bordo di rilevamento, che permette di scoraggiare imparzialeminazione del diametro dell'arteria ad ogni frame. L'analisi è possibile sulla macchina ad ultrasuoni, tuttavia, non consigliabile, in quanto è estremamente dispendio di tempo e soggetti a bias ricercatore.
- Analizzare i dati delle arterie di diametro in 60 secondi segmenti durante il basale e l'occlusione di fase, e in 10 secondi segmenti durante la fase iperemica.
- Analizzare i dati di velocità del sangue utilizzando le funzionalità di analisi del flusso del software bordo di rilevamento automatico. Determinare la velocità del sangue media misurando 5 o più forme d'onda consecutivi di aspetto uniforme durante le fasi di base e di occlusione. Determinare velocità media di sangue durante iperemia reattiva per velocità di sangue subito dopo il rilascio della cuffia. La forma d'onda con la velocità del sangue più alta è considerata la velocità del sangue di picco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dilatazione flusso-mediata è stata eseguita sulla brachiale e femorale superficiale di 8 ratti Wistar. Posizionamento di un ratto è mostrato in Figura 1.
Immagini ecografiche rappresentative dell'arteria femorale superficiale sono mostrati nella Figura 2.
Figura 1. Ratto e il posizionamento ad ultrasuoni.
Posizionamento di ratto per la misurazione del braccio (A) e femorale superficiale (B) dell'arteria FMD. Posizionamento della sonda ecografica e polsino di occlusione per la misurazione del braccio (C) e femorale superficiale (D) l'arteria afta epizootica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rappresentante immagini ecografiche.
immagine ecografica dell'arteria femorale superficiale utilizzando immagini B-mode per la determinazione del diametro (A). velocità del sangue è stato determinato utilizzando PW-mode. Indicato in figura sono la velocità del sangue al basale (B), la riduzione della velocità del sangue durante la fase di occlusione (C), e il rapido aumento della velocità del sangue al momento del rilascio del bracciale durante la fase iperemica (D). Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
Come mostrato in figura 3, vi è una risposta vasodilatatrice simile tra brachiale e le arterie femorali superficiali. Quando espressi come percentuale del valore basale, l'afta epizootica era simile tra arterie, tuttavia quando expressed come variazione assoluta rispetto al basale, l'afta epizootica è stata significativamente più alta nel arteria brachiale (P <0,05). Questa differenza è probabilmente dovuto ad un diametro più grande vaso in arteria brachiale rispetto l'arteria femorale superficiale (498 ± 28 vs 397 ± 11 micron, P <0,05). Simile alla misurazione di afta epizootica negli esseri umani 16, il coefficiente di variazione per intercessione brachiale e FMD femorale superficiale sono stati rispettivamente 9 ± 1 e 10 ± 4%,. Nonostante le differenze di dimensioni nave, c'è stata una forte relazione lineare tra brachiale e superficiale FMD femorale se espresso come percentuale o variazione assoluta rispetto al basale.
Dilatazione Figura 3. flusso-mediata nei ratti.
Vasodilatazione brachiale e femoralartery superficiale dopo un periodo di 5 minuti di ischemia espressa come percentuale (A) e assoluta (B) Cambiare rispetto al basale. FMD è risultata simile tra le arterie quando espresso come percentuale del valore basale (C). Tuttavia, se espresso come variazione assoluta rispetto al basale (D), l'afta epizootica è stata significativamente più alta nel arteria brachiale. Sia espressa come percentuale (E) o assoluto (F) variazione rispetto al basale, c'è stata una forte relazione per l'afta epizootica tra brachiale e le arterie femorali superficiali. * P <0.05 vs arteria brachiale. I valori sono media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Come indicato nella tabella 1, le variabili cardiovascolari sono stati misurati durante la linea di base, l'occlusione, e le fasi iperemiche. diametro dell'arteria è stato determinato usando l'intima intima-to-o media-per-media distanza durante la porzione diastolica del ciclo cardiaco. diametro dell'arteria è stata misurata per 60 secondi al basale e continuamente in ~ 60 secondi intervalli attraverso l'occlusione e fasi iperemiche. velocità del sangue è stata determinata usando la velocità arteriosa media del sangue nel lume durante un ciclo cardiaco. Il flusso di sangue è stata calcolata secondo l'equazione: flusso ematico (ml / min) = (velocità del sangue (micron / sec) · π · [diametro del vaso (micron) / 2] 2 · 60). Gradiente di velocità è stata calcolata secondo l'equazione: velocità di taglio (s -1) = velocità del sangue · diametro 8 / nave. Afta epizootica è stato calcolato in base all'equazione: FMD = (diametro di picco nave - diametro del vaso di riferimento) / diametro del vaso di riferimento.
| Arteria brachiale | Femorale superficiale | |
| Baseline Phase | ||
| Frequenza cardiaca, bpm | 367 ± 12 | 368 ± 16 |
| Diametro, micron | 498 ± 28 | 397 ± 11 * |
| Velocità del sangue, micron / sec | 85 ± 8 | 76 ± 11 |
| Flusso sanguigno, ul / min | 1.027 ± 147 | 568 ± 90 * |
| Velocità di taglio, s -1 | 1.4 ± 0.1 | 1.5 ± 0.2 |
| occlusione Phase | ||
| Frequenza cardiaca, bpm | 362 ± 12 | 359 ± 14 |
| Diametro, micron | 499 ± 32 | 390 ± 11 * † |
| Velocità del sangue, micron / sec | 63 ± 9 † | 38 ± 8 † |
| Flusso sanguigno, ul / min | 722 ± 122 † | 272 ± 62 * † |
| Velocità di taglio, s -1 | 1.0 ± 0.2 † | 0.8 ± 0.2 † |
| iperemiche Phase | ||
| Frequenza cardiaca, bpm | 363 ± 12 | 357 ± 12 |
| Diametro Peak, micron | 586 ± 22 † ‡ | 457 ± 15 * † ‡ |
| Velocità del sangue Peak, micron / sec | 149 ± 11 † ‡ | 205 ± 12 * † ‡ |
| Picco di flusso sanguigno, ul / min | 1.778 ± 229 † ‡ | 1.495 ± 127 † ‡ |
| Picco Velocità di taglio, s -1 | 2.5 ± 0.3 † ‡ | 3.7 ± 0.2 * † ‡ |
| * P <0.05 vs arteria brachiale. </ Td> | ||
| † p <0.05 vs basale di fase. | ||
| ‡ p <0.05 vs occlusione di fase. | ||
| I valori sono media ± SEM. |
Tabella 1. variabili cardiovascolari attraverso ogni fase del protocollo.
Non ci sono stati cambiamenti nella frequenza cardiaca in tutta entrambi i protocolli, così come tra le misurazioni delle arterie (p> 0.05). Il diametro dell'arteria brachiale era significativamente più grande l'arteria femorale superficiale (P <0.05). Durante la fase di occlusione, c'è stata una significativa riduzione della velocità del sangue, il flusso di sangue, e velocità di taglio rispetto al basale in entrambe le arterie (P <0.05). Dopo il rilascio della cuffia, la velocità del sangue di picco, il flusso di sangue, e velocità di taglio erano tutti significativamente superiore fasi iniziali o occlusione in entrambe le arterie (P <0.05). Simile alla misurazione di iperemia reattiva nell'uomo 16, il coefficiente di variazione per intercessione brachiale e superficiale iperemia reattiva femorale erano 24 ± 9 e 19 ± 5%, rispettivamente. C'erano differenze di velocità del sangue, il flusso di sangue, e la frequenza di taglio tra arterie, dovuta in gran parte alla differenza di diametro dell'arteria.
Dopo la normalizzazione a picco velocità di taglio, la vasodilatazione è stata maggiore nel arteria brachiale (Figura 4). Questo era vero anche per l'afta epizootica espresso come variazione assoluta rispetto al basale. Tuttavia, nonostante le differenze di grandezza, c'è stata una forte relazione lineare in percentuale e assoluta FMD normalizzato a picco velocità di taglio tra il brachiale e femorale superficiale.
/54762fig4.jpg "/>
Dilatazione normalizzato a picco gradiente di velocità nei ratti Figura 4. flusso-mediata.
Dopo la normalizzazione a picco velocità di taglio, l'afta epizootica expressedas una percentuale (A) o variazione assoluta (B) dal basale è stata più elevata a livello dell'arteria brachiale rispetto all'arteria femorale superficiale.
Nonostante le differenze tra le arterie FMD normalizzati a picco velocità di taglio, c'è stata una forte relazione tra brachiale e le arterie femorali superficiali quando afta epizootica è stato espresso come percentuale (C) o variazione assoluta (D) rispetto al basale. * P <0.05 vs arteria brachiale. I valori sono media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nel presente studio, una misurazione non invasiva della afta epizootica è stata dimostrata in brachiale e superficiali arterie femorali di ratti. Simili agli esseri umani 6, dopo un periodo di occlusione 5 min, c'è stato un rapido aumento della velocità del sangue (cioè, iperemia reattiva) aumentando così velocità di taglio sulla parete arteriosa che ha portato alla successiva vasodilatazione dell'arteria. Afta epizootica è stata osservata in entrambi i brachiale e le arterie femorali superficiali. Inoltre, c'è stata una forte relazione nel FMD tra le arterie. Anche se gradiente di velocità di punta era più alto a livello dell'arteria femorale superficiale, FMD normalizzato a picco velocità di taglio mantenuto una forte relazione tra le arterie. Insieme, questi risultati indicano che la misurazione non invasiva della afta epizootica può essere eseguito con successo nei ratti.
Anche se la misura di afta epizootica è stato eseguito su due arterie diverse, la grandezza di afta epizootica è stato simile quando espresso come variazione percentuale rispetto al basale. However, se espresso come variazione assoluta rispetto al basale, FMD era maggiore in arteria brachiale, come quella dell'arteria aveva un diametro di riposo ~ 25% più grande femorale superficiale. Questi risultati sono simili a quelli di studi sull'uomo in cui FMD è stata misurata nel brachiale e arterie femorali superficiali negli stessi soggetti 17,18. Nonostante le differenze di diametro arteriosa, il rapporto di FMD, espressa come percentuale o variazione assoluta rispetto al basale, era estremamente forte tra arterie.
Dilatazione flusso-mediata è stata proposta per rappresentare un saggio biologico funzionale per derivazione endoteliale NO biodisponibilità nell'uomo 6, come avviene vasodilatazione tramite il rilascio di NO da endotelio in risposta all'aumento tasso di taglio 1,3. Così, una maggiore FMD normalizzato a picco gradiente di velocità rappresenta un endotelio che ha una maggiore sensibilità di un determinato aumento della frequenza di taglio. Dopo la normalizzazione FMD a picco velocità di taglio, l'afta epizootica è stata maggiore nel Bracharteria ial, indipendentemente dal fatto che sia espresso come percentuale o variazione assoluta rispetto al basale. Nonostante le differenze di grandezza di afta epizootica normalizzati a velocità di picco del taglio tra brachiale e le arterie femorali superficiali, c'è stata una forte relazione lineare in percentuale e assoluta FMD normalizzato a picco gradiente di velocità tra le arterie.
Nel presente studio, la misurazione non invasiva del FMD è descritto nel brachiale e arterie femorali superficiali con il polsino di occlusione distale della sonda ecografica. Questo posizionamento bracciale è stato scelto per diverse ragioni, 1.) negli esseri umani, questo è più comunemente metodo utilizzato per misurare FMD, 2.) il contributo di NO al FMD ha dimostrato di essere maggiore quando la misura del diametro dell'arteria è prossimale al sito dell'occlusione 9 e 3.) c'era difficoltà nel mantenere l'immagine ecografica dopo gonfiaggio della cuffia quando il sito di misura era distale all'occlusione. Anche se questa procedura rappresenta una misurazione non invasiva di afta epizootica,altri hanno eseguito l'afta epizootica in ratti che vivono con una occlusione chirurgica dell'arteria iliaca comune con distale di misura ad ultrasuoni per l'occlusione in arteria femorale 19. La FMD risposta utilizzando il protocollo prima descritto da Heiss et al. è stata inibita mediante infusione di inibitori eNOS. In effetti, questa procedura è stata utilizzata per dimostrare che gli aumenti farmacologici in NO intracellulare migliora l'afta epizootica in due modelli di ratto di disfunzione endoteliale e ipertensione 20, e l'esposizione al fumo passivo risultati in una perdita di valore di afta epizootica nei ratti 21,22. Questi studi dimostrano il contributo di NO al afta epizootica in ratti e stabilire il rapporto di afta epizootica per la salute cardiovascolare. Tuttavia, poiché questa tecnica è invasiva, potrebbe limitare la capacità di misurare FMD longitudinalmente negli stessi ratti per un periodo di settimane per anni. Utilizzando un metodo simile a quello attuale studio, due studi recenti hanno eseguito la misura non invasiva di afta epizootica nel dell'arto posteriore di topi 23,24,ma c'erano diverse varianti tecniche tra gli studi (ad esempio, naturalmente tempo di misura e il posizionamento di sonda ecografica e bracciale occlusione). A causa di discrepanze tra questi studi e difficoltà di replicare questi risultati, la misurazione non invasiva di afta epizootica nei ratti e ha tentato invece, come i ratti sono comunemente utilizzati nella ricerca traslazionale, ma avere un corpo e vaso sanguigno dimensioni maggiori rispetto ai topi. Mentre la misurazione della FMD nell'arteria femorale di roditori in genere non è romanzo, nessuno studio ha eseguito la misura di afta epizootica in arteria brachiale di eventuali roditori viventi. Il forte rapporto di afta epizootica tra le arti nel presente studio può illustrare la natura sistemica della funzione endoteliale, ma fornisce anche un metodo per non invasivo misurare afta epizootica negli animali che hanno interrotto il flusso di sangue negli arti posteriori (ad esempio, femorale fistola artero-venosa).
L'ottimizzazione e la manutenzione di un immagini ecografiche di alta qualità sono competenze critiche necessarie per questo Operaziri e richiede pratica estesa. Ad esempio, per la misurazione della FMD nell'uomo, si suggerisce che almeno 100 scansioni supervisione vengono eseguite prima scansione indipendente 5. A volte, l'immagine potrebbe spostarsi durante l'occlusione bracciale e richiedono piccole regolazioni della sonda ecografica. Un passo fondamentale in questo protocollo è il passaggio tra B-mode e PW-mode in punti temporali specifici. Simultanea B-mode e l'imaging PW-mode non sono possibili sulla macchina a ultrasuoni utilizzati in questo protocollo. Pertanto, è necessario per passare rapidamente da una modalità ad ultrasuoni per catturare misure di velocità e diametro durante segmenti di tempo specifici. Avere un protocollo scritto fuori e mettere in pratica l'esecuzione del protocollo migliorerà notevolmente l'efficienza di passare da una modalità ad ultrasuoni. Considerando la natura sensibile al tempo delle registrazioni ad ultrasuoni nel corso di questo protocollo, si verificano degli errori, in modo da essere pronti a annotare eventuali anomalie di protocollo, come dimenticare per catturare una clip ad ultrasuoni.Manca una clip ultrasuoni durante la fase di occlusione non è critica, tuttavia, se la registrazione viene persa durante la fase di iperemia reattiva si consiglia di ripetere la procedura dopo almeno 30 minuti sono passati 25.
Come per ogni studio ci sono limitazioni al protocollo sperimentale. In questo studio, l'anestesia è stata somministrata a ratti in 100% di ossigeno, pertanto, le misurazioni di FMD potrebbero anche riflettere vasoreattività all'iperossia. Altre forme di anestesia, come sodio pentobarbital potrebbero essere utilizzati per creare un profilo più gas del sangue rappresentante all'uomo ed eliminare questo problema. La pressione arteriosa non è stata monitorata in qualsiasi punto di questo protocollo. Anche se la pressione sanguigna non cambia in risposta a occlusione bracciale acuta nell'uomo, non è noto se qualsiasi variazione transitoria nella pressione sanguigna sarebbe verificato nei ratti. Inoltre, l'aria compressa è stata usata per riempire il occluder vascolare, tuttavia, il riempimento con acqua può aver portato ad occlusione più solidadi flusso di sangue come l'acqua non è così comprimibile come l'aria. Infine, la misura non invasiva della FMD in condizioni in cui eNOS è inibita (cioè, L-NMMA infusione) non sono stati effettuati. Pertanto, il contributo di NO al FMD, come viene eseguito in questo protocollo, non è stata determinata.
In conclusione, questo articolo ha dimostrato un protocollo per la misurazione non invasiva di afta epizootica nel brachiale e superficiali arterie femorali di ratti. In concomitanza con il recente cambiamento di messa a fuoco per la ricerca traslazionale, la valutazione di afta epizootica in ratti può fornire un valido strumento per tradurre i risultati negli esseri umani per ratti, oltre a fornire la possibilità di valutare la funzione endoteliale in diversi punti temporali in studi longitudinali di ratti ricevere trattamenti diversi. Infatti, riduzioni di afta epizootica sono accompagnate da un irrigidimento delle arterie aortica sono stati osservati a seguito danno renale in un modello murino di insufficienza renale cronica (risultati non pubblicati), che dimostra l'applicazionepubblica- di afta epizootica non invasiva come marker di funzione vascolare negli studi sugli animali longitudinali. Futuri studi per indagare i meccanismi di afta epizootica nei ratti sono garantiti e dovrebbero fornire ulteriori indicazioni circa la misura FMD non invasivo negli esseri umani.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optional |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore surgical tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatory cream (e.g., Nair) | General supply | ||
| Cotton swabs | General supply | ||
| Ultrasound gel | General supply | ||
| Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml syringe with Luer-Lok tip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Paperclip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Hypodermic needle – 18 gauge | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Medium binder clip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus |
References
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S.
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C.
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070 (2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
