Summary
Denne protokollen beskriver utarbeidelse og karakterisering av en dendrimere magnetic resonance imaging (MRI) kontrastmiddel som bærer cyclen-basert makrosykliske chelater koordinerende para gadolinium-ioner. I en serie av MRI-eksperimenter in vitro, blir dette middel ga en forsterket MRI-signal i forhold til de kommersielt tilgjengelige monomere analog.
Abstract
Paramagnetiske komplekser av gadolinium (III) med asyklisk eller makrosykliske chelater er de mest brukte kontrastmidler (CAS) for magnetisk resonans imaging (MRI). Deres formål er å forbedre avslapning frekvensen av vann protoner i vev, og dermed øke MR bildekontrast og spesifisiteten av MR-målinger. Nåværende klinisk godkjent kontrastmidler er lavmolekylære molekyler som er raskt fjernet fra kroppen. Bruken av dendrimerer som bærere av paramagnetiske chelatorer kan spille en viktig rolle i den fremtidige utviklingen av mer effektive MRI-kontrastmidler. Nærmere bestemt, er økningen i lokale konsentrasjon av den paramagnetiske type resulterer i en høyere signal kontrast. Videre tilveiebringer dette en lengre CA vev retensjonstid på grunn av sin høye molekylvekt og størrelse. Her viser vi en praktisk fremgangsmåte for fremstilling av makromolekylære MRI-kontrastmidler basert på poly (amidoamin) (PAMAM-dendrimerer) med monomacrosykliske DOTA-type gelatorer (DOTA - 1,4,7,10--1,4,7,10-tetraacetate). Den chelaterende enheten ble tilføyd ved å utnytte reaktiviteten av isotiocyanatet (NCS) -gruppe mot aminoverflategruppene av PAMAM dendrimer å danne thiourea broer. Dendrimere produkter ble renset og analysert ved hjelp av kjernemagnetisk resonansspektroskopi, massespektrometri, og elementanalyse. Til slutt ble høyoppløselige MR-bilder registreres og signal kontrastene oppnådd fra den preparerte dendrimere og de kommersielt tilgjengelige monomere midler ble sammenlignet.
Introduction
Magnetic resonance imaging (MRI) er en kraftig og ikke-ioniserende avbildningsteknikk mye brukt i biomedisinsk forskning og klinisk diagnostikk på grunn av sin ikke-invasiv natur og utmerket kontrast iboende soft-vev. De mest brukte MR metoder anvender signalet som oppnås fra vannprotonene, noe som gir bilder med høy oppløsning og detaljert informasjon i vev basert på forskjeller i tetthet av vann signaler. Den signalintensitet og spesifisiteten av de MRI-eksperimenter kan bli ytterligere forbedret ved bruk av kontrastmidler (CAS). Disse er paramagnetiske eller superparamagnetiske art som påvirker den langsgående (T 1) og tverrgående (T 2) relaksasjonstider, henholdsvis 1,2.
Komplekser av lantanid ion gadolinium med polyaminopolykarboksylsyre ligander er de mest brukte T 1 CAer. Gadolinium (III) forkorter T 1 avslapningtidspunktet for vannprotonene, noe som øker således signalet kontrasten i MRI-eksperimenter 3. Imidlertid er ionisk gadolinium giftig; dens størrelse er tilnærmet lik den for kalsium (II), og det alvorlig påvirker kalsium-assistert signalering i celler. Derfor er acykliske og makrocykliske chelater som anvendes for å nøytralisere denne toksisitet. Forskjellige flertannede ligander har blitt utviklet hittil, noe som resulterer i gadolinium (III) komplekser med høy termodynamisk stabilitet og kinetisk inerte en. De som er basert på 12-leddede azamacrocycle cyclen, spesielt dens tetracarboxylic derivat DOTA (1,4,7,10--1,4,7,10-tetraacetate) er de mest undersøkte og anvendte komplekser av denne CA klassen.
Likevel GdDOTA-type instanser er lavmolekylære systemer, viser visse ulemper som lav kontrast effektivitet og rask renal utskillelse. Macromolecular og flerverdige instanser kan være en god løsning på disse problemene 4. Siden CA biodistribusjon er i hovedsak bestemt av sin størrelse, makromolekylære instanser vise mye lengre oppholdstider innenfor vev. Like viktig er det multivalency av disse midler resulterer i en økt lokal konsentrasjon av den monomere MR sonden (f.eks GdDOTA kompleks), i vesentlig grad forbedrer den ervervede MR-signalet og målekvaliteten.
Dendrimerer er blant de mest foretrukne stillasene for fremstilling av flerverdige CAer for MRI 4,5. Disse høyt forgrenede makromolekyler med godt definerte størrelser er utsatt for forskjellige koblingsreaksjoner på overflaten. I dette arbeidet, rapporterer vi forberedelse, rensing og karakterisering av en dendrimere CA for MR består av en generasjon 4 (G4) poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimer koblet til GdDOTA-lignende chelater (DCA). Vi beskriver syntesen av det reaktive derivat DOTA og dens kobling til PAMAM dendrimer. Ved kompleks med Gd (III), standard fysisk-kjemiske karakter procedure av DCA ble utført. Til slutt ble MRI-eksperimenter utført for å demonstrere evnen til DCA for å produsere MR-bilder med en sterkere kontrast enn de som oppnås fra lav molekylvekt CAer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av DCA
- Syntese av den monomere enhet 4 6.
- Syntese av 4- (4-nitrofenyl) -2- (4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (2).
- Oppløs (4,7-bis-tert-butoksykarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-yl) -eddiksyre-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) i N, N-dimetylformamid ( DMF, 5 ml), tilsett kaliumkarbonat (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 ekv.), og blandingen omrøres ved romtemperatur i 45 min.
MERK: Makrocyklusen 1 ble fremstilt fra cyclen og tert-butyl-bromacetat i henhold til den tidligere publiserte prosedyre 7. - Legg tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 ekv.) Porsjonsvis i løpet av 1 time. Fortsett omrøringen av blandingen under than samme reaksjonsbetingelser for de følgende 18 timer.
Merk: Tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat ble fremstilt fra 4- (4-nitrofenyl) -smørsyre, tionylklorid og brom i henhold til den tidligere publiserte prosedyre 8. - Fjern DMF ved hjelp av bulb-to-bulb vakuumdestillasjon ved 40-60 ° C 9.
- Rens residuet ved kolonnekromatografi (silikagel, 7% metanol / diklormetan) for å oppnå produkt 2 som et brunt, amorft, fast stoff (1,09 g, 72%) 10.
- Oppløs (4,7-bis-tert-butoksykarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-yl) -eddiksyre-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) i N, N-dimetylformamid ( DMF, 5 ml), tilsett kaliumkarbonat (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 ekv.), og blandingen omrøres ved romtemperatur i 45 min.
- Syntese av 4- (4-aminofenyl) -2- (4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (3).
- Oppløs nitrobenzenderivatet 2 (1,00 g, 1,28 mmol) i etanol (10 ml) og 7 N ammoniakk i metanol (150 ul). Legg palladium på aktivert karbon som en katalysator (Pd / C, 150 mg, 15 vekt%) til solutipå.
- Rist den heterogene blandingen i 16 timer under en hydrogenatmosfære (2,5 bar) i en Parr-hydrogeneringsapparat.
- Fremstille en kake av diatoméjord ved å suspendere den i etanol og filtrering av suspensjonen gjennom et sintret glasstrakt. Helle suspensjonen fra 1.1.2.2 løpet av den fremstilte kake for å fjerne Pd / C-katalysator ved filtrering.
- Fjern løsningsmidlet ved forsiktig destillasjon på en rotasjonsfordamper (vann-bad temperatur ~ 40 ° C) for å oppnå forbindelse 3 som et brunt, amorft, fast stoff (0,91 g, 95%).
- Syntese av 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylmetyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (4).
- Legg tiofosgen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 ekv.) Til en blanding av 3 (0,91 g, 1,22 mmol) og trietylamin (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 ekv.) I diklormetan (15 ml).
- Kraftig røre reaksjons mixture med en magnetrører ved romtemperatur i 16 timer.
- Fjern løsningsmidlet ved forsiktig destillasjon på en rotasjonsfordamper (vann-bad temperatur ~ 40 ° C), og deretter rense råproduktet ved kolonnekromatografi (silikagel, 5% metanol / diklormetan) for å oppnå produktet 4 som et lysebrunt, amorft, fast stoff (0,51 g, 53%).
- Syntese av 4- (4-nitrofenyl) -2- (4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (2).
- Syntese av dendrimeren DCA.
- Syntese av dendrimeren 5.
- Ta G4-PAMAM dendrimer (667 mg, 10% dendrimer løsning i metanol, 4,67 umol), fordamper metanolen ved forsiktig destillasjon på en rotasjonsfordamper (vann-bad temperatur ~ 40 ° C) og oppløs residuet i DMF (4 ml) .
- Legg trietylamin (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 ekv.), Omrør i 45 minutter ved 60 ° C, og tilsett isotiocyanat 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 ekv. I forhold til de amino-overflategruppene av dendrimeren) porsjonsvis over 1 time.
- Omrør reaksjonsblandingen med en magnetrører ved 45 ° C i 48 timer.
- Fjern løsningsmidlet ved hjelp av bulb-to-bulb vakuumdestillasjon ved 40-60 ° C.
- Rens residuet ved størrelse-utelukkelses-kromatografi ved anvendelse av en lipofil gelfiltrering medium og metanol som elueringsmiddel. Å pakke kolonne, svelle filtreringsmedier i metanol i minst 3 timer ved romtemperatur (> 4 ml metanol per 1 g pulver) uten å anvende trykk. Utføre gravitasjonsseparasjon ved å samle 1 ml fraksjoner.
- Analysere de oppsamlede fraksjoner med tynnskiktskromatografi (TLC). Utvikle TLC-platen i 15% metanol / diklormetan (bare den mest polare flekk som ligger på grunnlinjen er avledet fra dendrimere produkt). Fordamp de oppsamlede fraksjoner ved forsiktig destillasjon på en rotasjonsfordamper (vann-bad temperatur ~ 40 ° C) under dannelse av produktet 5 (270 mg, 91%).
- Syntese av dendrimeren
- Oppløs det beskyttede dendrimere chelateringsmidlet 5 (270 mg, 4,23 umol) i maursyre (5 ml) og omrør blandingen ved 60 ° C i 24 timer.
- Fordamp maursyre ved destillasjon på en rotasjonsfordamper (~ 15 mbar trykk, vann-bad temperatur ~ 40 ° C) og frysetørke produktet for å gi 6 (trykk ~ 0,2 mbar) 9.
- Syntese av dendrimeren 5.
- Syntese av den dendrimere kontrastmiddel (DCA)
- Oppløs den dendrimere chelateringsmidlet 6 (4,35 umol) i vann og justere pH til 7,0 med 0,1 M natriumhydroksyd.
- Oppløs GdCl 3 · 6 H 2 O (113 mg, 304 umol) i vann (1 ml) og tilsett det dråpevis til oppløsningen av chelatoren 6 i løpet av en periode på 4 timer; opprett på 7,0 pH-verdien med vandig natriumhydroksyd-løsning (0,05 M) ved å måle pH med et pH-meter.
- Rør blandingen med en magnetisk rører ved værelses temperature i 24 timer.
- Legg etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, 158 mg, 426 umol) til oppløsningen porsjonsvis i løpet av 4 timer for å fjerne overskuddet av Gd (III), mens den ble holdt ved 7,0 på pH-verdien med vandig natriumhydroksyd-løsning (0,05 M). Omrør blandingen ved romtemperatur i 24 timer.
- Utføre størrelse-utelukkelses-kromatografi for å fjerne mesteparten av GdEDTA og overskudd av EDTA. Bruke et hydrofilt gel-filtrering medium svelles i vann for å pakke kolonnen. Redusere blandingen til et egnet volum, og legg i kolonnen. Eluer kolonnen med deionisert vann uten å anvende trykk.
- Sentrifuger prøven ved bruk av en 3 kDa sentrifugal filterenhet i 30 minutter ved sentrifugalkraft 1800 x g for å fjerne rester av GdEDTA og EDTA. Gjenta dette trinnet (ca. fem ganger) inntil filtratet viser fravær av EDTA og GdEDTA. Overfør prøven inn i en kolbe, fordampe det, og så fryse-tørke løsningsmidlet for å oppnå et hvitaktig produkt som det endelige DCA (186 mg, 71%).
MERK: Kontroller fravær av EDTA og GdEDTA ved hjelp av ESI-MS. - Bekrefte fraværet av Gd (III) som en fri ion med xylenolorange-testen. Oppløs filtratet (0,5 ml) i en acetat-bufferløsning (pH 5,8). Tilsett noen dråper av en xylenol orange løsning og spore fargeendring (gul eller fiolett farge indikerer fravær eller nærvær av fritt Gd (III) ioner i løsningen, henholdsvis) 11.
2. In vitro karakterisering av dendrimere Products
- Estimering av antall makrocykliske DOTA-enheter koplet til PAMAM dendrimer (lasting av dendrimeren med DOTA-lignende makrocykler)
- Estimering med 1H NMR (NMR - kjernemagnetisk resonansspektroskopi).
MERK: Denne prosedyren er tilgjengelig på dendrimerne 5 og 6, men ikke på DCA.- Noter 1H NMR spektrum 12.
- Integrere den aromatiske region, og de to separate alifatiske regioner (1. signaler i den alifatiske dendrimeren og makrocykliske protoner, 2. signaler av den t-Bu-grupper), eller bare en alifatisk region for dendrimerer 5 og 6, respektivt.
Merk: Det er ingen separat signal i det alifatiske region stammer fra t-Bu-grupper i dendrimeren 6, siden de er blitt hydrolysert. - Bruk Eq. En eller Eq. 2 for å beregne antall makrocykliske enheter (n), hvor R = forholdet mellom integralene (alifatisk / aromatisk i ligning. En eller alifatisk-dendrimer / alifatisk- t- Bu i ligning. 2), H utbetaling = antall protoner i dendrimer, H Ar = antall aromatiske protoner, H t Bu = antall protoner i t-Bu-grupper, og H mac = antall protoner i en makrosyklisk forbindelse.
Merk: Enten Eq. En eller Eq. 2 kan benyttes fo-r dendrimer 5, mens bare Eq. 1 kan anvendes for dendrimer 6. Siden utskiftbare protoner (på aminer, amider, tioureaer eller karboksylater) er vanligvis blir erstattet med deuterium, ble de ikke lagt til grunn i beregningene. Her, H utbetaling = 1128 (i 5) eller 1000 (for 6), H Ar = 4, og H mac = 27 ble anvendt.
(1) 
(2)
- Estimering av elementanalyse ved hjelp av forholdet mellom nitrogen og svovel.
- Utfører elementæranalyse på den faste dendrimere prøven (DCA i dette arbeid).
- Bruk Eq. 3 for å beregne antall makrocykliske enheter (n), hvor R = forholdet mellom fast% N og% S, N eller S utbetaling utbetaling = antallnitrogen eller svovelatomer i dendrimeren, og N mac eller S mac = antall nitrogen- eller svovelatomer i en makrocyklisk enhet.
Merk: Faktoren 2,29 er oppnådd fra forholdet i atommasser av svovel og nitrogen. I dette arbeidet ble N utbetaling = 250, S utbetaling = 2, N mac = 5, og S mac = 1 brukes.
(3)
- Estimering med matrise-assistert laser desorpsjon / ionisering tiden av fly (MALDI-TOF).
- Utfør MALDI-TOF MS analyse 13.
- Beregn antall makrocykliske enheter (n) i henhold til ligning. 4, hvor M z = den observerte massen (m / z), z = ladningen av arten, M utbetaling = massen av den dendrimere del, og M mac = massen av en makrocyklisk enhet.
NEITE: M utbetaling = 14306 og M mac = 719 ble brukt i dette arbeidet.
(4)
- Estimering med 1H NMR (NMR - kjernemagnetisk resonansspektroskopi).
- Fastsettelse av DCA konsentrasjon ([DCA]): Bulk magnetisk susceptibilitet måling (BMS)
- Oppløs DCA (5-10 mg) i vann (360 ul) i en plastampulle rør ([DCA] ~ 5-10 mM).
MERK: [DCA] bør være i området fra 5 til 10 mM for å unngå overlapping av t- BuOH resonanser ved prøvekonsentrasjoner> 15 mM, med resonans av vann ved δ = 4,7 ppm. - Legg 60 mL av D 2 O: t-BuOH blanding (2: 1 v / v) til den vandige oppløsning av DCA og blande den resulterende oppløsning (420 ul) under anvendelse av en Vortex-blander.
- Overføre 400 ul av prøven inn i et ytre NMR-rør og sette inn en koaksial NMR innsats rør med en t-BuOH: H2O-blanding (10:90 v / v) i prøverøret.
- Ta opp1 H-NMR-spektrum og måle frekvensforskyvning mellom resonanssignaler som stammer fra t- BuOH i de indre og ytre NMR-rør (referanse) 12.
- Bruk Eq. 5 for å bestemme [DCA], der T = den absolutte temperatur, Δχ = den innspilte skift, u eff = den effektive magnetiske moment for et lantanid ion (μ eff = 7,94 for Gd (III) 14, og s = en konstant avhengig ved formen på prøven og dens stilling i det magnetiske felt (0, 1/3, 1/6 og i tilfelle av en kule, sylinder parallelt med, og sylinderen vinkelrett på det magnetiske felt, henholdsvis).
NB: Den beregnede verdien oppnådd for [DCA] skal korrigeres til den opprinnelige konsentrasjonen på grunn av tilsetningen av D 2 O: t-BuOH-løsning (60 ul).
(5)
- Oppløs DCA (5-10 mg) i vann (360 ul) i en plastampulle rør ([DCA] ~ 5-10 mM).
- dynamisk lysspredning (DLS) målinger.
- Fremstille en filtrert DCA oppløsning (0,2 pm polytetrafluoretylen / PTFE-filter, 0,75 mM pr Gd (III)) i 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer (25 mM, pH 7,4) og overføre den til en kyvette for DLS måling.
- Sett kyvetten inn i DLS apparater og angi følgende parametere: 5 repetisjoner av 15 skanninger (en scan = 12 sek, brytningsindeks = 1,345, absorpsjon = 1%) uten forsinkelser i mellom skanner og med temperaturstabilisering 30 sek før opptak .
- Eksportere de innsamlede data, og tak i den størrelsesfordelingen histogrammet ved plotting av populasjonen (%) som en funksjon av størrelse (hydrodynamisk diameter).
- Måling av de langsgående og tverrgående relaksiviteter.
MERK: En lignende prosedyre ble allerede beskrevet med den avslappingen analysator 15; denne prosedyren ble utført ved anvendelse av et 300 MHz NMR-spektrometer med Topspinprogramvare.- Forbered et sett av DCA løsninger i H 2 O: D 2 O (500 mL, 10% D 2 O i H 2 O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 og 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mm) fra DCA lager prøven (se avsnitt 2.2).
- Overfør 450 mL av løsningen i et NMR rør og legg den inn i instrumentet.
- Optimal oppkjøpet parametere (90 ° eksitasjon pulsvarighet (p1), og bestråling frekvensforskyvning (O 1)) og deretter utføre T 1 og T-2 eksperimenter med inversjon utvinning (IR) og Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) pulssekvenser, respektivt.
- Fastsettelse av T 1 og T 2 avslapping ganger.
- Velg den innspilte måling, prosess 2D spektrum i F2 dimensjon, og utfører interaktive fase korreksjon.
- Velg riktig skive (peak med maksimal intensitet) i Analyse / T
- Velge den passende tilpasningsfunksjonen (invrec eller uxnmrt2 for IR og CPMG-eksperimenter, henholdsvis) for å oppnå de T 1 T 2 eller relaksasjonstider.
- Gjenta trinn 2.4.4.2-2.4.4.4 for alle de gjenværende [DCA] løsninger.
- Beregn avslapping priser (R1 og R2) fra de oppnådde T 1-verdier (R 1,2 = 1 / T 1,2).
- Plot R 1 og R 2 (sek-1) som en funksjon av konsentrasjon Gd (III) i mM.
- Bestemme de langsgående og tverrgående relaksiviteter, R1 og R2 (mM-sec -1 -1), fra helningen av den tilpassede linjen, slik det er definert ved ligning. 6, hvor Ri, obs = den langsgående (i = 1) eller tverrgående (i = 2) diamagnetisk relaksasjonshastigheten avvann i fravær av paramagnetiske type og [Gd] = konsentrasjonen av Gd (III) anvendt i eksperimentet.
(6)
(1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) 3. In Vitro MRI; Sammenligning mellom DCA og GdDOTA
- Utarbeidelse av rør fantomer
- Fremstille vandige oppløsninger av DCA (4 x 350 mL) og GdDOTA (4 x 350 mL), så vel som vannprøver (4 x 350 mL) for to sett av eksperimenter, hvor konsentrasjonen av kontrastmidlene er beregnet: (3.1.1.1) pr Gd (III) eller (3.1.1.2) per molekyl.
- Forbered to DCA prøver og to GdDOTA prøver med konsentrasjoner på 0,5 og 1,0 mm pr Gd (III), henholdsvis. I tillegg forberede to vannprøver (som kontrollrørene).
- Fremstille to DCA prøver (2,5 og 5,0 mM pr Gd (III) eller 0,05 og 0,1 mm pr dendrimere molekyl), to GdDOTA prøver (0,25, 0,5 mM) og to vannprøver (systemadml rør).
MERK: De aktuelle DCA og GdDOTA konsentrasjoner bør være forberedt ved å fortynne de respektive aksje prøver med konsentrasjoner bestemmes via BMS-metoden (se avsnitt 2.2) med HEPES buffer (pH 7,4). For å forenkle beregningene, n = 50 ble lagt til grunn for den gjennomsnittlige antall makrocykliske enheter pr dendrimer-molekyl. Derfor er forholdet mellom DCA: GdDOTA var 1: 5, beregnet på en per molekyl basis.
- Plassere prøvene i 300 ul plast ampulle rør, unngår tilstedeværelse av luftbobler i oppløsningen.
MERK: Størrelsen av plastampullerørene avhenger av type og størrelse på radiofrekvens spolen som brukes (her, et eksempel med volumet spolen er gitt). - Sett prøvene inne i en sprøyte (60 ml volum), fyll den med 1 mM GdDOTA løsning, og legg den i skanneren.
MERK: Prøvene ble plassert i den vandige oppløsning av GdDOTA for å unngå resistens effekter (variasjoner i det magnetiske felt strength som oppstår i nærheten grensesnittene mellom stoffer av ulik magnetisk susceptibilitet).
- Fremstille vandige oppløsninger av DCA (4 x 350 mL) og GdDOTA (4 x 350 mL), så vel som vannprøver (4 x 350 mL) for to sett av eksperimenter, hvor konsentrasjonen av kontrastmidlene er beregnet: (3.1.1.1) pr Gd (III) eller (3.1.1.2) per molekyl.
- Parameter optimalisering og bildebehandling.
- Bruk anatomiske scan (Localizer / TriPilot) for å plassere sprøyten med prøvene i isomidtpunktet av magneten.
- Trykk på trafikklys (justering scan) for å utføre justeringer for mellomlegg (justering av magnetfelt homogenitet) av hele volumet, den sentrale frekvens (O 1), vil mottakeren gevinst (RG), og at senderforsterkningen (TX0 og TX1).
- For T en vektet (T 1w) bildebehandling, velg rask lav vinkel skudd (FLASH) -metoden.
- Velg koronale slice for prøvene plassert vertikalt (sprøyte vannrett) i skanneren ved hjelp av Localizer skanningen.
- Bruk Eq. 7 for optimalisering av kontrast-til-støy (CNR) anskaffelse Parametere 16, hvor α = flip vinkel, TE = den ekkotid, TR =repetisjon tid og T en, A, T 1, B = T 1 ganger med prøve A (T 1, A) og prøve B (T 1, B) hvor CNR skal optimaliseres (den samme er gyldig for T 2 ganger: T 2, A og T2, B).
MERK: T 1 og T 2 avspennings ganger bør settes til verdier hentet fra målinger av langsgående og tverrgående relaksiviteter (§ 2.4), mens TE, bør TR, og α fås fra optimalisering beregningen CNR.
(7) - Hente bildet ved hjelp av parametrene oppnådd i forrige trinn (3.2.5).
- Beregne signal-til-støy-forhold (SNR).
- Last den oppkjøpte T 1w bilde (skanning) i bildevisningen og behandlingvindu, og klikk på Definer region av interesse (ROI).
- Velg en sirkulær avkastning og tegne det på prøven posisjon og bakgrunn. Deretter klikker du på skjermen for å få den gjennomsnittlige signal amplitude (S signal) og standardavvik av bakgrunnen (S støy).
- Gjenta trinn 3.2.7.2 for DCA, GdDOTA, og vannprøver.
- Beregn SNR ved hjelp av formelen: SNR = S signal / S støy.
- Etter en litt modifisert prosedyre, utføre T 2 vektet (T 2w) avbildning ved hjelp av raske oppkjøpet med avslapning enhancement (sjelden) metoden. For optimalisering av CNR oppkjøpet parametrene, bruker Eq. 8.
(8)
(7) 
(8) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstillingen av DCA besto av to trinn: 1) syntese av den monomere DOTA-type chelateringsmiddel (figur 1) og 2) kopling av chelator med G4 PAMAM dendrimer og etterfølgende fremstilling av den dendrimere Gd (III) -kompleks (Figur 2) . I det første trinn ble en cyclen basert DOTA-type chelateringsmiddel som inneholder fire karboksylsyrer og en ortogonal gruppe egnet for ytterligere syntetiske modifikasjoner fremstilt. Fremstillingen startet fra en (DO3A- tert-butyl ester) 7, som ble alkylert med tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat 8 for å tilveiebringe DOTA-derivat 2. Palladium-katalysert hydrogenering reduseres den aromatiske nitrogruppen på 2 for å tilveiebringe anilin 3. Omdannelsen av 3 med tiofosgen resulterte i isotiocyanat 4, hh ble tidligere benyttet som et amin-reaktivt middel, for fremstilling av dendrimere CAer 17.
I det etterfølgende trinn, ble makrocyklusen 4 benyttes som grunnleggende monomerenhet i en koblingsreaksjon til de kommersielt tilgjengelige G4 PAMAM dendrimer. De aminoverflategrupper på dendrimerens reagere med isotiocyanatet grupper av monomeren 4, i nærvær av en base. Overskuddet av 4 ble fjernet ved størrelseseksklusjonskromatografi ved bruk av en lipofil gelfiltrering medium med metanol som elueringsmiddel. De tert-butyl-estere på det oppnådde dendrimer-makrosyklisk konjugat 5 ble hydrolysert med maursyre for å gi 6, som deretter ble lyofilisert, og anvendt i neste trinn uten rensing. Dannelsen av Gd (III) komplekser av DOTA-type makrocykler ble utført ved tilsetning av GdCl 3 · 6H 2O til en vandig oppløsning of 6 under opprettholdelse av pH ved ca. 7. Overskudd av Gd (III) ble kompleksbundet med en felles chelator etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Den GdEDTA komplekset og overskudd av EDTA ble fjernet fra systemet ved størrelse-utelukkelses-kromatografi ved anvendelse av en hydrofil gel-filtreringsmedium med vann som elueringsmiddel. De resterende liten størrelse forurensninger ble fjernet fra oppløsningen ved sentrifugering ved bruk av 3 kDa sentrifugal filtreringsenheter.
Etter syntesen av dendrimer-makrocyklus-konjugater, har en kombinert analytisk metode blitt benyttet for å karakterisere produktene. For å bestemme overflate-amin belegg av 5 og 6, har 1 H-NMR-spektra er analysert. Resultatene ble sammenlignet og bekreftet med sluttproduktet (DCA), hvor lastingen av dendrimeren med makrocykler har blitt beregnet ved hjelp av elementæranalyse og MALDI-TOF massespektrometri (figur3). En kombinasjon av disse tre fremgangsmåter resulterte i et gjennomsnitt på 49 makrosykliske enheter som blir konjugert til G4 dendrimer, tilsvarende ~ 75% amin overflate gruppe belegg.
Ytterligere karakterisering av dendrimere komplekset inkluderte bestemmelse av relaksiviteten verdier, noe som resulterer i 6,2 ± 0,1 mM -1 sek -1 per Gd (III) (eller omtrent rundt 300 mM -1 sek -1 per dendrimer) for den langsgående relaksivitet og 30,5 ± 0,6 mM -1 sek -1 per Gd (III) (nesten 1 500 mM -1 sek -1 per dendrimer) for den tverrgående relaksivitet. DLS-målinger indikerte en hydrodynamisk diameter på 7,2 ± 0,2 nm for DCA (figur 4).
Til slutt, for å demonstrere virkningen av de dendrimere MRI-kontrastmiddel, er MR-undersøkelse utført på to sett av fantomer med DCA og klinikkenalliert tilgjengelig GdDOTA for sammenligning (figur 5). Det første sett av fantomer ble fremstilt for det formål å sammenligne disse to kontrastmidler ved identiske Gd (III) konsentrasjoner, mens det andre sett ble utformet for å demonstrere effekten på sammenlign molekyl konsentrasjoner av de dendrimere og monomere kontrastmidler, respektivt.
Figur 1: Syntese av den makrocykliske DOTA-type chelateringsmiddel 4. Reagenser, betingelsene og isolerte utbytter: (i) tert-butyl 2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 timer, 72%; (ii) H2, Pd / C, EtOH, RT, 16 timer, 95%; (iii) CSCL to, Et3N, RT, 2 timer, 53%. Klikk her for å se en større versjon av dette fi gur.
Figur 2: Syntese av den dendrimere MRI-kontrastmiddel DCA Reagenser og betingelser: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 timer, 91%;. (Ii) maursyre, 60 ° C, 24 timer, kvantitativt; (iii) GdCl 3 ∙ 6 H 2 O, pH 7,0, RT, 24 timer, 71%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Karakterisering av de dendrimere produkt ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri En typisk MALDI-TOF-massespektrum oppnådd for DCA.rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:.. Karakterisering av dendrimere produktet ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) DLS måling av DCA (HEPES, pH 7,4) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: In vitro MR eksperimenter på tube fantomer på 7 T magnetfelt (a, b) T en vektet og (c, d) T2-vektet MR av DCA og GdDOTA.. Hver MRI forsøket ble utført med to forskjellige konsentrasjoner av kontrastmidlet: (a, c) med tilsvarende Gd (III) konsentrasjoner (HEPES, pH 7,4); (B, d) med en DCA: GdDOTA konsentrasjonsforhold på 1: 5 (HEPES, pH 7,4). Konsentrasjonene er uttrykt per molekyl og SNR verdiene er vist i parentes. De som brukes i disse eksperimentene parametre var: felt-of-view (FOV) = 40 x 40 mm 2, snittykkelse = 0,5 mm, antall eksitasjoner (NEX) = 30; (A) matrisestørrelse (MTX) = 256 x 256, repetisjon tid (TR) = 100 msek, ekko tid (TE) = 2,95 msek, flip vinkel (FA) = 90 °, oppkjøp tid (TA) = 12 min 48 sek ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2,95 msek, FA = 90 °, TA = 2 min 34 sek; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10000/130 msek, Rare faktor (RF) = 16, TA = 26 min 40 sek; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10 000/100 msek, RF = 16, TA = 26 min 40 sek.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstilling av den dendrimere MRI-kontrastmiddel krever passende valg av den monomere enhet (dvs. den chelator for Gd (III)). De reduserer giftigheten av denne paramagnetisk ion, og til dato, et bredt utvalg av acykliske og makrosykliske chelatdannere tjene dette formålet 1-3. Blant disse makrocykliske DOTA-type chelatorer har den høyeste termodynamisk stabilitet og kinetisk inerte og, følgelig, er de mest foretrukne valg for fremstilling av inert MRI-kontrastmidler 1,18. Videre er de utsatt for forskjellige syntetiske transformasjoner, som resulterer i bifunksjonelle chelatorer, i stand til å koble til ulike funksjonelle molekyler (f.eks rettet mot vektorer eller nano-bærere) samtidig danner stabile Gd (III) komplekser 19. For dette formål ble den DOTA-type-monomerenhet som er beskrevet i denne fremgangsmåten fremstilles fra DO3A- tert-butyl ester, den vanlige og lett tilgjengelige forløper, og det bromid-derivat av4- (4-nitrofenyl) butansyre. Dette molekylet er avledet fra DOTA og som har en lignende struktur for å koordinere Gd (III). Den syntetiske modifikasjon som mål å gjøre denne chelator utsatt for kobling reaksjoner på ulike funksjonelle molekyler og bærere. Nemlig fremstilling av DOTA-modifiserte molekylet resulterer i en chelator fortsatt med fire karboksylgrupper som er tilgjengelige for koordinering til Gd (III) for å danne en inert kompleks og en ortogonal nitrofenyl gruppe, som ved konvertering festes denne chelator til dendrimer overflaten. Denne fremgangsmåten gir også mulighet for fleksibilitet i valg av den ortogonale reaktiv gruppe (for eksempel, NH2 eller COOH), som kan tjene til å kople Gd (III) chelator til en ønsket bærer på en foretrukket måte.
Det oppnådde bifunksjonelt chelateringsmiddel kan kobles til andre molekyler på to forskjellige måter (dvs. syntetiske prosedyrer). Når nitrogruppen reduseres til en aminogruppe, kan den resulterende anilin i henholdgå en kondensasjonsreaksjon med karboksylsyregruppen av den andre molekylet 8. Videre kan et aromatisk primært amin-funksjonell gruppe, i nærvær av tiofosgen enkelt konverteres til et isotiocyanat, en gruppe som lett reagerer med aminer i polare organiske oppløsningsmidler, samt vann, med flere reaksjons muligheter for kopling av monomere enheter til dendrimerer 17 , 20,21.
For kopling av bifunksjonelle chelator til den dendrimere bæreren, bør en passende dendrimere stillas velges. Flere faktorer knyttet til den endelige dendrimer konjugert struktur og ønsket program skal gjøres rede for i dette trinnet. På grunn av store kommersielle tilgjengeligheten av dendrimere bærere, kan produkter med forskjellige kjernestrukturer, overflate reaktive grupper, eller generasjoner velges. Følgelig vil konjugeringsreaksjonen er avhengig av overflaten gruppen av dendrimeren og den ortogonale gruppe med chelator, menssluttkonjugatet kan være nøytrale, ladet, eller ha forskjellige størrelser (opp til 15-20 nm, avhengig dendrimer generasjon) 22. Alle disse aspektene bør tas i betraktning før fremstilling av den dendrimere CA, ettersom de kan påvirke løseligheten, relaksivitet (MRI signalforbedring), diffusjon, og andre farmakokinetiske egenskaper av kontrastmiddel, som potensielt kan skade dens anvendelse i MRI. For eksempel kan kationiske dendrimerene oppvise toksisitet i biologiske systemer. Imidlertid kan denne effekten bli redusert ved konjugering av negativt ladede grupper på dendrimeren overflaten, for derved å redusere sitt samlede positiv ladning 23.
I denne protokoll har vi fremstilt den dendrimere kontrastmidlet DCA anvendelse av fremgangsmåten hvori isotiocyanatgruppe av den monomere makrocyklusen 4 ble koblet til en kommersiell cystamin-kjerne-G4 PAMAM utstyrt med 64 primære aminoverflategrupper. Den innledende rensing av hydrofilobic dendrimere produktet 5 ble utført ved gel-kromatografi ved anvendelse av en kolonne med et lipofilt gelfiltrering medium og metanol som elueringsmiddel for å fjerne det meste av de uomsatte monomere enheter. Hydrolyse av t-butyl-estere med maursyre er enkel, noe som resulterer i et vannløselig dendrimere produkt som kan renses med størrelseseksklusjonskromatografi ved anvendelse av en hydrofil gel-filtreringsmedium. Den kompleksdannelse av de multimere og dendrimere chelatorer med Gd (III) ble utført mens man holdt oppløsningen ved en nøytral pH-verdi for å lette kompleksdannelsen. Ellers, kompleksering av Gd (III) (tilsatt som kloridsalter) reduserer pH-verdien, sakker reaksjonen. Til slutt er det verdt å merke seg at amingrupper på dendrimerens kjerne også har en tendens til å koordinere med Gd (III), men bare med det overskytende som ikke kunne chelateres med de DOTA-enheter. Å unngå nærvær av Gd (III) utenfor den DOTA chelator er viktig, ettersom leakage av Gd (III) fra CA kan ha uønskede effekter; nemlig, kan det indusere toksisitet in vivo 18. Overskuddet av Gd (III) kan effektivt fjernes ved kompleksering med EDTA etterfulgt av ultrafiltrering av GdEDTA og fri EDTA anvendelse av 3 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) filtre. Lavere MWCO filter kan bli brukt når de dendrimere konjugatene har lavere molekylvekter.
Det er to viktige feilsøkings problemstillinger knyttet til utarbeidelse av DCA. På grunn av den store utvidelseseffekten av Gd (III) på NMR-signaler, er analysen av DCA ved hjelp av NMR-spektroskopi ikke informativt. I stedet bør utføres denne analysen i tidligere trinn (forbindelsene 5 og 6). Deretter blir konjugering av monomacrocyclic enheter for å dendrimerens overflate aldri oppnådd med 100% omdannelse, men det er sannsynlig å være mellom 50-90% (se nedenfor). Typisk kan reaksjons utbyttene økes ved tilsetning av en andre porsjon av monomeric reaktiv enhet etter den første bøying av dendrimeren, og monomerenhet er fullført 24. Imidlertid hvert preparat batch resulterer i noe forskjellig gjennomsnittlig antall chelatdannere konjugerte på dendrimerens overflate, selv når identiske dendrimer og DOTA heter blir brukt som materiale for kopling. Selv om den endelige mengden av Gd (III) som er tilstede i DCA kan bestemmes uavhengig av hverandre via BMS-metoden (se avsnitt 2.2), for bedre karakterisering av dendrimere konjugater, er det nødvendig å utføre beregningen av bundne monomere enheter som hver gang en ny sats av DCA fremstilles (se 2.1 og diskusjon nedenfor).
Den analytiske karakterisering av de isolerte dendrimere produktene kan bli utført ved hjelp av 1H NMR-spektroskopi (bare på produkter 5 og 6), elementanalyse, og MALDI-TOF MS. Typiske utbytter for omdannelse av aminogrupper overflategrupper ligge mellom 50-90%, avhengig av dendrimer generasjon avpå, type chelator, og de benyttede reaksjonsbetingelsene (løsningsmiddel og temperatur) 6,20,24,25. I dette spesielle tilfelle, de beregnede massene oppnådd fra de kombinerte analyser samsvarer med et gjennomsnitt av 49 monomere chelater er koplet til dendrimer (dvs. ~ 75% belegg av dendrimeren overflate aminer). Selv om en liten mistilpasning i det endelige antall reagerte aminogrupper som kan forventes mellom disse metodene 25, gir deres direkte sammenligning rimelig bevis for dannelse av den ønskede DCA med en bestemt gjennomsnittlig antall tilkoblede chelaterende enheter.
In vitro karakterisering sikte på å vurdere potensialet for DCA å forbedre kontrasten i MR eksperimenter besto av DLS, relaxometric, og MR eksperimenter. Den hydrodynamiske diameter av DCA ble bestemt til å være 7,2 ± 0,2 nm ved DLS målinger, som er i overensstemmelse med tidligere rapporterte konjugater av denne artmed G4 generasjon 4 PAMAM dendrimerer 26. Bestemmelse av den langsgående relaksiviteten av DCA følges den ovenfor beskrevne prosedyre 15 og åpenbarte verdien på 6,2 ± 0,1 mM -1 -1 sek pr Gd (III). Omtrent 50% av den forbedring i r en av paramagnetiske Gd (III) i forhold til DCA liten størrelse molekyler av lignende type (f.eks, GdDOTA) kan forklares med den mellomliggende størrelse av den dendrimere kontrastmiddel. Nemlig den reduserte bevegelse av Gd-chelater er festet til dendrimer overflaten øker rotasjonskorrelasjonstiden og dermed r 1; denne effekten kan fremdeles observeres ved høye magnetiske felt for mindre nanostørrelse midler. Ellers er økningen i rotasjonskorrelasjonstiden bidrar dominant til r en forbedring ved lave magnetiske felt 27. På den annen side er størrelsen av dendrimere kontrastmidlet hadde en markert virkning på den tverrgående relaxivity 28, noe som resulterer i verdien på 30,5 ± 0,6 mM -1 sek -1 per Gd (III). I sammendraget, de metoder for in vitro vurdering av DCA er enkel og krever bare forsiktig prøveopparbeidelse, så ingen problemer forventes ved kjøp av data og analysere resultatene.
For å demonstrere ytelsen til dendrimere kontrastmiddel og sin makt til å påvirke kontrasten i bildet, utførte vi MR eksperimenter på tube fantomer med nypreparerte kontrastmiddel DCA. Vi har også brukt en løsning av et kommersielt tilgjengelig og godkjent klinisk MRI-kontrastmiddel, GdDOTA, som en sammenligning, og rør med vann som en kontroll. I det første T en vektet MRI-eksperiment, når like store Gd (III) konsentrasjoner ble benyttet (0,5 eller 1 mM Gd (III) i DCA eller GdDOTA), SNR i rørene med DCA var allerede opptil 12% høyere på grunn en økning på ca 50% i lengde relaksivitet av DCA forhold til GdDOTA (Figur 5a). Den andre T en vektet MRI-eksperiment ble utformet for å demonstrere effekten av DCA når konsentrasjonene ble beregnet per molekyl. Selv om 5 ganger mindre DCA ble påført sammenlignet med GdDOTA (50 vs. 250 um eller 100 sammenlignet med 500 pM DCA vs. GdDOTA, henholdsvis), et høyt innhold av DCA med Gd (III) resulterte i en signifikant økning i bildekontrasten som i sin tur resulterte i de observerte SNR verdier er minst tre ganger høyere i de stiplede rør fylt med DCA. Expectedly, både T 2-vektet MRI eksperimenter viste store (3-20 ganger) forskjeller i SNR mellom fantom rør fylt med DCA og GdDOTA.
Som konklusjon, beskriver denne protokollen en praktisk utarbeidelse av en dendrimere CA for MRI ved hjelp av vanlige syntetiske prosedyrer for å gi DCA med forbedrede egenskaper i forhold til små-størrelse instanser. DCA utstillinger foretrukne termodynamisk stabilitet og kinetisk treghet når sammentil sine monomere CA analoger. Ikke desto mindre, den multivalency av DCA og dermed induserer høy lokal konsentrasjon av den paramagnetiske type i målområdet høy kontrast i MR-bilder. Tatt i betraktning de ofte foret farmakokinetiske egenskaper (f.eks lenger vev oppholdstid) i forhold til sine monomere CA analoger, eller evnen til å bære ytterligere funksjonalitet (f.eks målrettede vektorer), disse dendrimere-makrocyklus konjugater representerer en lovende og verdifull klasse av kontrastmidler for ulike fremtidige MR og molekylærbildebehandlingsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7 N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15% wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 10% wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | Version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
