Summary
Detta protokoll beskriver framställningen och karakteriseringen av en dendrimer magnetisk resonanstomografi (MRT) kontrastmedel som bär cyklen-baserade makrocykliska kelater samordnande paramagnetiska gadolinium-joner. I en serie av MRI-experiment in vitro, producerade detta medel en förstärkt MRI signal jämfört med den kommersiellt tillgängliga monomera analogen.
Abstract
Paramagnetiska komplex av gadolinium (III) med acykliska eller makrocykliska kelater är de vanligaste kontrastmedel (CAS) för magnetisk resonanstomografi (MRT). Deras syfte är att öka relaxationshastigheten av vattenprotoner i vävnad, vilket således ökar MR bildkontrasten och specificiteten av mätningarna MRI. Nuvarande kliniskt godkända kontrastmedel är lågmolekylära molekyler som elimineras snabbt från kroppen. Användningen av dendrimerer som bärare av paramagnetiska kelatorer kan spela en viktig roll i den framtida utvecklingen av effektivare MR-kontrastmedel. Speciellt ökningen i lokal koncentration av de paramagnetiska resultat arter i en högre signal kontrast. Vidare tillhandahåller denna CA en längre vävnads retentionstid grund av dess höga molekylvikt och storlek. Här visar vi ett bekvämt förfarande för framställning av makromolekylära MRI-kontrastmedel baserade på poly (amidoamin) (PAMAM) -dendrimerer med monomacrocykliska DOTA-typ kelatorer (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraacetat). Den kelatbildande enheten bifogades genom att utnyttja reaktiviteten hos isotiocyanat (NCS) grupp mot amin ytgrupper av PAMAM-dendrimer att bilda tiourea broar. Dendrimera produkterna renades och analyserades med hjälp av kärnmagnetisk resonansspektroskopi, masspektrometri och elementaranalys. Slutligen var högupplösta MR-bilder registreras och signal kontraster som erhållits från den förberedda dendrimera och kommersiellt tillgängliga mono medel jämfördes.
Introduction
Magnetisk resonanstomografi (MRT) är en kraftfull och icke-joniserande bildteknik används i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning och klinisk diagnostik på grund av dess icke-invasiv karaktär och utmärkt inneboende mjukvävnad kontrast. De vanligaste MRI metoder utnyttjar den signal som erhålls från vattenprotoner, vilket ger högupplösta bilder och detaljerad information i vävnaderna baserade på skillnader i densitet av vatten signaler. Signalintensiteten och specificiteten för de MRI experiment kan förbättras ytterligare med användning av kontrastmedel (CA). Dessa är paramagnetiska eller superpara arter som påverkar längd (T 1) och tvärgående (T2) relaxationstider, respektive 1,2.
Komplex av lantanider jon gadolinium med polyaminopolykarboxylsyra ligander är de vanligaste T 1 CA. Gadolinium (III) förkortar T en avkopplingtidpunkten för vattenprotoner, vilket ökar signal kontrast i MRI experiment 3. Men är jonisk gadolinium giftigt; dess storlek ungefär som kalcium (II), och det allvarligt påverkar kalcium assisterade signalering i celler. Därför är acykliska och makrocykliska kelater som används för att neutralisera denna toxicitet. Olika flertandade ligander har utvecklats hittills, vilket resulterar i gadolinium (III) komplex med hög termodynamisk stabilitet och kinetisk tröghet 1. De som är baserade på 12-ledade azamacrocycle cyklen, i synnerhet dess tetrakarboxylsyra derivat DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraacetat) är de mest undersökta och tillämpade komplex av denna CA klass.
Ändå GdDOTA-typ CA är lågmolekylära system, som uppvisar vissa nackdelar såsom låg kontrasteffektivitet och snabb renal utsöndring. Macro och multivalenta CA kan vara en bra lösning på dessa 4 problem. Eftersom CA biodistribution bestäms huvudsakligen av deras storlek, makromolekylära CA visa mycket längre retentionstider inom vävnader. Lika viktigt är det multivalens av dessa medel resulterar i en ökad lokal koncentration av den monomera MR sonden (t.ex. GdDOTA komplex), att väsentligt förbättra den förvärvade MR-signalen och mätningen kvalitet.
Dendrimerer är bland de mest föredragna ställningar för framställning av multivalenta CA för MRI 4,5. Dessa i hög grad grenade makromolekyler med väldefinierade storlekar är benägna att olika kopplingsreaktioner på sin yta. I detta arbete, vi rapporterar beredning, rening och karakterisering av en dendrimer CA för MRI består av en generation 4 (G4) poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimer kopplad till GdDOTA-liknande kelat (DCA). Vi beskriver syntesen av det reaktiva DOTA-derivat och dess koppling till PAMAM-dendrimer. Vid komplexbildning med Gd (III), standarden fysikal-kemiska egenskaper procedure av DCA utfördes. Slutligen, var MRI experiment för att demonstrera förmågan hos DCA att producera MR-bilder med en starkare kontrast än de som erhålls från lågmolekylärt CA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av DCA
- Syntes av monomerenheten 4 6.
- Syntes av 4- (4-nitrofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxikarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smörsyra-tert-butylester (2).
- Lös (4,7-bis- tert-butoxikarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-yl) -ättiksyra-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) i N, N-dimetylformamid ( DMF, 5 ml), tillsätt kaliumkarbonat (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 ekv.) och omrör blandningen vid rumstemperatur under 45 min.
OBS: makrocykel 1 framställdes av cyclen och tert-butylbromacetat i enlighet med den tidigare publicerade förfarandet 7. - Tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 ekv.) Portionsvis under 1 h. Fortsätta att röra om blandningen under than samma reaktionsbetingelser för följande 18 timmar.
Notera: tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat framställdes från 4- (4-nitrofenyl) -smörsyra, tionylklorid, och brom enligt den tidigare publicerat förfarande 8. - Ta DMF genom kolv-till-bulb vakuumdestillation vid 40-60 ° C 9.
- Rena återstoden med kolonnkromatografi (kiselgel, 7% metanol / diklormetan) för erhållande av produkten 2 som ett brunt amorft fast ämne (1,09 g, 72%) 10.
- Lös (4,7-bis- tert-butoxikarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-yl) -ättiksyra-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) i N, N-dimetylformamid ( DMF, 5 ml), tillsätt kaliumkarbonat (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 ekv.) och omrör blandningen vid rumstemperatur under 45 min.
- Syntes av 4- (4-aminofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxikarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smörsyra-tert-butylester (3).
- Upplösa nitrobensenderivat 2 (1,00 g, 1,28 mmol) i etanol (10 ml) och 7 N ammoniaklösning i metanol (150 | il). Lägga palladium på aktivt kol som katalysator (Pd / C, 150 mg, 15 vikt-%) till solutipå.
- Skaka den heterogena blandningen under 16 h under en väteatmosfär (2,5 bar) i Parr-hydrogenator apparaten.
- Förbereda en kaka av kiselgur genom att suspendera det i etanol och filtrering av suspensionen genom en sintrad glastratt. Häll suspensionen från 1.1.2.2 över den förberedda kakan för att avlägsna Pd / C-katalysator genom filtrering.
- Avlägsna lösningsmedlet genom försiktig destillation på rotationsindunstare (vattenbadtemperatur ~ 40 ° C) för erhållande av förening 3 som ett brunt amorft fast ämne (0,91 g, 95%).
- Syntes av 4- (4-isotiocyanatofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxikarbonylmetyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) smörsyra-tert-butylester (4).
- Lägg tiofosgen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 ekv.) Till en blandning av 3 (0,91 g, 1,22 mmol) och trietylamin (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 ekv.) I diklormetan (15 ml).
- Kraftigt röra om reaktions mixture med en magnetisk omrörare vid rumstemperatur i 16 h.
- Avlägsna lösningsmedlet genom försiktig destillation på rotationsindunstare (vattenbadtemperatur ~ 40 ° C), och sedan rena den råa produkten genom kolonnkromatografi (silikagel, 5% metanol / diklormetan) för att erhålla produkten 4 som ett Ijusbrunt amorft fast ämne (0,51 g, 53%).
- Syntes av 4- (4-nitrofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxikarbonylmetyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smörsyra-tert-butylester (2).
- Syntes av dendrimeren DCA.
- Syntes av dendrimeren 5.
- Ta G4-PAMAM-dendrimer (667 mg, 10% dendrimer lösning i metanol, 4,67 | j, mol), indunsta metanol genom försiktig destillation på rotationsindunstare (vattenbadtemperatur ~ 40 ° C), och återstoden löses i DMF (4 ml) .
- Tillsätt trietylamin (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 ekv.), Rör om under 45 min vid 60 ° C, och tillsätt isotiocyanat 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 ekv. I förhållande till amino ytgrupper av dendrimeren) portionsvis over 1 h.
- Rör om reaktionsblandningen med en magnetisk omrörare vid 45 ° C under 48 h.
- Avlägsna lösningsmedlet med hjälp av kolv-till-kolv-vakuumdestillation vid 40-60 ° C.
- Rena återstoden med storleksuteslutningskromatografi med användning av ett lipofilt gelfiltreringsmedium och metanol som elueringsmedel. Att packa kolonnen, sväller de filtreringsmedium i metanol under åtminstone 3 h vid rumstemperatur (> 4 ml metanol per 1 g pulver) utan tryck. Utför gravitationsseparation genom att samla 1 ml fraktioner.
- Analysera de uppsamlade fraktionerna med tunnskiktskromatografi (TLC). Utveckla TLC-plattan i 15% metanol / diklormetan (endast den mest polära fläcken ligger på baslinjen är härledd från dendrimer produkt). Indunsta de uppsamlade fraktionerna genom skonsam destillation på rotationsindunstare (vattenbadtemperatur ~ 40 ° C) för erhållande av produkten 5 (270 mg, 91%).
- Syntes av dendrimeren
- Upplösa den skyddade dendrimeriska kelator 5 (270 mg, 4,23 | imol) i myrsyra (5 ml) och omrör blandningen vid 60 ° C under 24 h.
- Indunsta myrsyran genom destillation på rotationsindunstare (~ 15 mbar tryck, vattenbadtemperatur ~ 40 ° C) och frystorka produkten för att ge 6 (tryck ~ 0,2 mbar) 9.
- Syntes av dendrimeren 5.
- Syntes av den dendrimera kontrastmedel (DCA)
- Lös den dendrimeriska kelator 6 (4,35 ^ mol) i vatten och justera pH till 7,0 med 0,1 M natriumhydroxid.
- Lös upp GdCl 3 · 6H 2 O (113 mg, 304 ^ mol) i vatten (1 ml) och tillsätt den droppvis till lösningen av kelatorn 6 under en period av 4 h; hålla pH vid 7,0 med vattenlösning av natriumhydroxid (0,05 M) genom att mäta pH med en pH-meter.
- Rör blandningen med en magnetisk omrörare vid rums temperatur under 24 h.
- Lägga etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 158 mg, 426 ^ mol) till lösningen portionsvis under 4 h för att avlägsna överskottet av Gd (III) under upprätthållande av pH vid 7,0 med vattenlösning av natriumhydroxid (0,05 M). Rör om blandningen vid rumstemperatur under 24 h.
- Utföra storleksuteslutningskromatografi för att avlägsna huvuddelen av GdEDTA och överskottet av EDTA. Använda ett hydrofilt gelfiltreringsmedium svälla i vatten för att packa kolonnen. Reducera blandningen till en lämplig volym och ladda kolonnen. Eluera kolonnen med avjoniserat vatten utan att applicera tryck.
- Centrifugera provet med användning av en 3 kDa centrifugal filterenhet för 30 minuter vid centrifugalkraft 1800 xg för att avlägsna rester av GdEDTA och EDTA. Upprepa detta steg (cirka fem gånger) tills filtratet visar frånvaron av EDTA och GdEDTA. Överföra provet till en kolv och indunsta den och sedan frystorka lösningsmedlet för erhållande av ett benvitt produkten som den slutliga DCA (186 mg, 71%).
OBS: Kontrollera frånvaro av EDTA och GdEDTA genom ESI-MS. - Bekräfta frånvaron av Gd (III) i form av en fri jon med användning av xylenolorange testet. Upplösa filtratet (0,5 ml) i en acetatbuffert-lösning (pH 5,8). Tillsätt några droppar av en xylenol orange lösning och spåra färgförändringen (gul eller violett färg indikerar frånvaron eller närvaron av fritt Gd (III) joner i lösning, respektive) 11.
2. In vitro-karakterisering av Dendrimera produkter
- Uppskattning av antalet makrocykliska DOTA-enheter kopplade till PAMAM-dendrimer (laddning av dendrimeren med DOTA-liknande makrocykler)
- Uppskattningen med en H NMR (NMR - kärnmagnetisk resonansspektroskopi).
OBS: Detta förfarande är möjlig på dendrimerer 5 och 6, men inte på DCA.- Anteckna 1H NMR-spektrum 12.
- Integrera den aromatiska regionen och de två separata alifatiska regioner (1. signaler av alifatiska dendrimer och makrocykliska protoner, 2. signaler från t-Bu grupper) eller bara en alifatisk region för dendrimerer 5 och 6, respektive.
Obs: Det finns ingen särskild signal i den alifatiska regionen härstammar från t-Bu grupper dendrimer 6 eftersom de har hydrolyserats. - Använd Eq. 1 eller ekvation. 2 för att uppskatta antalet makrocykliska enheter (n), där R = förhållandet mellan integral (alifatiska / aromatiska i ekvation. 1 eller alifatiska-dendrimer / alifatiska t- Bu i ekvation. 2), H utdelning = antalet protoner i dendrimer, = H Ar antalet aromatiska protoner, H ^ Bu = antalet protoner i-Bu grupper och H mac = antalet protoner i en makrocykel.
Obs: Antingen Eq. 1 eller ekvation. 2 kan användas for dendrimer 5, medan endast Eq. 1 kan användas för dendrimer 6. Eftersom utbytbara protoner (på aminer, amider, tiokarbamider, eller karboxylater) är vanligtvis ersätts med deuterium, var de inte antas i beräkningarna. Här, H utdelning = 1128 (för 5) eller 1000 (för 6), H Ar = 4, och H mac = 27 användes.
(1) 
(2)
- Uppskattning från elementaranalys genom att använda förhållandet av kväve till svavel.
- Utför elementaranalys på den fasta dendrimeriska provet (DCA i detta arbete).
- Använd Eq. 3 för att uppskatta antalet makrocykliska enheter (n), där R = förhållandet mellan bestämd% N och% S, N utdelning eller S utdelning = antaletkväve eller svavelatomer i dendrimeren och N mac eller S mac = antalet kväve- eller svavelatomer i en makrocyklisk enhet.
Notera: Faktorn 2,29 erhålls från förhållandet i atommassan av svavel och kväve. I detta arbete, N utdelningen = 250, S utdelningen = 2, N mac = 5, och S mac = 1 används.
(3)
- Uppskattningen med matrisassisterad laserdesorption / jonisering flygtiden (MALDI-TOF).
- Utför MALDI-TOF MS-analys 13.
- Beräkna antalet makrocykliska enheter (n) enligt ekvation. 4, där M z = den observerade massan (m / z), z = laddningen av arten, M utdelning = massa dendrimera sidan och M mac = massan av en makrocykliska enhet.
NEJTE: M utdelningen = 14.306 och M mac = 719 användes i detta arbete.
(4)
- Uppskattningen med en H NMR (NMR - kärnmagnetisk resonansspektroskopi).
- Fastställande av DCA koncentration ([DCA]): Bulk magnetisk känslighet mätning (BMS)
- Upplösa DCA (5-10 mg) i vatten (360 | il) i en plastflaska rör ([DCA] ~ 5-10 mM).
OBS: [DCA] bör vara i intervallet 5 till 10 mM för att undvika eventuell överlappning av t- BuOH resonanser vid provkoncentrationer> 15 mM, med resonansen av vatten vid δ = 4,7 ppm. - Tillsätt 60 | il av D2O: t- BuOH blandning (2: 1 v / v) till den vattenhaltiga lösningen av DCA och blanda den resulterande lösningen (420 | il) med användning av en Vortex-blandare.
- Överför 400 | j, l av provet i en yttre NMR-rör och placera en koaxial NMR inläggsslang med en t- BuOH: H2O-blandning (10:90 v / v) i provröret.
- Spela inden 1 H-NMR-spektrum och mäta frekvensskiftet mellan resonanssignaler som härrör från t- BuOH i de inre och yttre NMR-rör (referens) 12.
- Använd Eq. 5 för att bestämma [DCA], där T = den absoluta temperaturen, Δχ = den inspelade skift, | j eff = effektiv magnetiska momentet för en lantanidjon (μ eff = 7,94 för Gd (III) 14, och s = en konstant beroende på formen av provet och dess läge i magnetfältet (0, 1/3, och 1/6 i fallet av en sfär, cylinder parallell med och cylindern vinkelrätt mot magnetfältet, respektive).
OBS: Det beräknade värdet som erhölls för [DCA] bör korrigeras till den ursprungliga koncentrationen på grund av tillsatsen av D2O: t- BuOH-lösning (60 pl).
(5)
- Upplösa DCA (5-10 mg) i vatten (360 | il) i en plastflaska rör ([DCA] ~ 5-10 mM).
- dynamisk ljusspridning (DLS) mätningar.
- Förbereda en filtrerad DCA-lösning (0,2 | j, m polytetrafluoreten / PTFE-filter, 0,75 mM per Gd (III)) i 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffert (25 mM, pH 7,4) och överföra den till en kyvett för DLS-mätning.
- Placera kyvetten i DLS apparater och ställa in följande parametrar: 5 upprepningar av 15 skanningar (en scan = 12 sek, brytningsindex = 1,345, absorption = 1%) utan förseningar i mellan skanningar och med temperaturjämvikt 30 sek före inspelning .
- Exportera de förvärvade uppgifter och erhålla storleksfördelningen histogrammet genom att plotta population (%) som en funktion av storlek (hydrodynamisk diameter).
- Mätning av de längsgående och tvärgående relaxiviteter.
OBS: Ett liknande förfarande som redan har beskrivits med hjälp av relaxationstiden analysatorn 15; detta förfarande utfördes med användning av en 300 MHz NMR-spektrometer med Topspinprogramvara.- Förbereda en uppsättning DCA lösningar i H2O: D2O (500 | il, 10% D2O i H2O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, och 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mM) från DCA lager provet (se avsnitt 2.2).
- Överför 450 | il lösning i ett NMR-rör och placera den i instrumentet.
- Optimera förvärvsparametrar (90 ° exciteringspulslängd (P1), och bestrålning frekvensförskjutning (O 1)) och utför sedan T 1 och T 2 experiment med hjälp av inversion återhämtning (IR) och Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) pulssekvenser, respektive.
- Bestämning av T 1 och T 2 relaxationstider.
- Välj den inspelade mätning process 2D spektrumet i F2 dimension, och utför den interaktiva korrektionsfasen.
- Välj lämplig skiva (topp med maximal intensitet) i Analys / T
- Välj lämplig anpassningsfunktionen (invrec eller uxnmrt2 för IR och CPMG experiment, respektive) för att erhålla T 1 eller T 2 relaxationstider.
- Upprepa steg 2.4.4.2-2.4.4.4 för alla återstående [DCA] lösningar.
- Beräkna relaxationshastigheterna (R 1 och R 2) från de erhållna T 1-värden (R 1,2 = 1 / T 1,2).
- Plot R 1 och R 2 (sek -1) som en funktion av Gd (III) koncentrationen i mM.
- Bestämma de längsgående och tvärgående relaxiviteterna, r 1 och r 2 (mM -1 sek -1), från lutningen av den anpassade linjen, såsom den definieras av Ekv. 6, där Ri, obs = längsgående (i = 1) eller tvärgående (i = 2) diamagnetiska relaxationshastighet avvatten i frånvaro av paramagnetiska species och [Gd] = koncentration av Gd (III) användes i experimentet.
(6)
(1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) 3. In vitro MRI; Jämförelse mellan DCA och GdDOTA
- Framställning av tube fantomer
- Bereda vattenhaltiga lösningar av DCA (4 x 350 | j, l) och GdDOTA (4 x 350 | j, l) liksom vattenprover (4 x 350 | j, l) för två uppsättningar av experiment där koncentrationen av kontrastmedlen beräknas: (3.1.1.1) per Gd (III) eller (3.1.1.2) per molekyl.
- Förbered två DCA prover och två GdDOTA prover med koncentrationer av 0,5 och 1,0 mM per Gd (III), respektive. Dessutom förbereder två vattenprover (som kontrollrören).
- Förbered två DCA prover (2,5 och 5,0 mM per Gd (III) eller 0,05 och 0,1 mM per dendrimer molekyl), två GdDOTA prover (0,25, 0,5 mM) och två vattenprov (control rör).
OBS: De lämpliga DCA och GdDOTA koncentrationer bör framställas genom utspädning av motsvarande lager prover med koncentrationer bestämda via BMS-metoden (se avsnitt 2.2) med HEPES-buffert (pH 7,4). För att förenkla beräkningarna, n = 50 antogs för den genomsnittliga antal makrocykliska enheter per dendrimer molekyl. Därför är förhållandet mellan DCA: var GdDOTA 1: 5, beräknat på en per molekyl basis.
- Placera proverna i 300 | il plastampullrören, undvika närvaron av luftbubblor i lösningen.
OBS: Storleken på plastampullrören beror på typ och storlek av radiofrekvenspolen används (här, är ett exempel med volymen polen ges). - Sätt proverna inuti en spruta (60 ml volym), fylla den med en mM GdDOTA lösning, och placera den i skannern.
OBS: Prover placerades i den vattenhaltiga lösningen av GdDOTA att undvika resistenseffekter (variationer i det magnetiska fältet strength som förekommer i närheten av gränssnitt mellan ämnen med olika magnetisk känslighet).
- Bereda vattenhaltiga lösningar av DCA (4 x 350 | j, l) och GdDOTA (4 x 350 | j, l) liksom vattenprover (4 x 350 | j, l) för två uppsättningar av experiment där koncentrationen av kontrastmedlen beräknas: (3.1.1.1) per Gd (III) eller (3.1.1.2) per molekyl.
- Parameter optimering och bildbehandling.
- Använd den anatomiska scan (Localizer / Tripilot) att placera sprutan med proverna i isocentret av magneten.
- Tryck på trafikljuset (scan justering) för att utföra justeringar för mellanlägg (justering av magnetfält homogenitet) av hela volymen, den centrala frekvensen (O 1), mottagarens förstärkning (RG), och sändningsförstärkningen (Tx0 och TX1).
- För T 1-viktade (T 1W) avbildning väljer den snabba låg vinkel skott (FLASH) metoden.
- Välj koronalt skiva för proven placeras vertikalt (spruta horisontellt) i skannern med hjälp av Localizer skanningen.
- Använd Eq. 7 för optimering av kontrast-till-brus (CNR) insamlingsparametrar 16, där α = den flip-vinkel, TE = den ekotiden, TR =repetitionstiden, och T 1, A, T 1, B = T 1 gånger av prov A (T 1 A) och prov B (T 1, B) för vilken CNR ska maximeras (detsamma gäller för T 2 gånger: T 2, A och T 2, B).
OBS: T 1 och T 2 relaxationstider bör sättas till värden som erhålls vid mätningarna av längsgående och tvärgående relaxiviteter (avsnitt 2.4), medan TE, TR, och α bör erhållas från optimering beräkning CNR.
(7) - Hämta bilden med hjälp av parametrarna, som erhölls i föregående steg (3.2.5).
- Beräkna signal-till-brusförhållande (SNR).
- Ladda förvärvade T 1w bild (Scan) i bildskärmen och bearbetningfönstret och klicka på Definiera regionen av intresse (ROI).
- Välj en cirkulär ROI och dra den på provposition och bakgrund. Därefter klicka på displayen för att få den genomsnittliga signalamplituden (S signal) och standardavvikelsen för bakgrunden (S buller).
- Upprepa steg 3.2.7.2 för DCA, GdDOTA och vattenprover.
- Beräkna SNR med följande formel: SNR = S signal / S buller.
- Efter en något modifierad procedur utföra T2 viktade (T 2w) avbildning med den snabba förvärv med avkoppling förbättring metod (sällsynt). För optimering av insamlingsparametrar CNR använder Eq. 8.
(8)
(7) 
(8) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framställningen av DCA bestod av två faser: 1) syntes av den monomera DOTA-typ kelator (figur 1) och 2) koppling av kelator med G4 PAMAM dendrimeren och efterföljande framställning av dendrimera Gd (III) komplex (Figur 2) . I det första steget framställdes en cyclen baserad DOTA-typ kelator innehållande fyra karboxylsyror och en ortogonal grupp lämplig för ytterligare syntetiska modifieringar ställdes. Framställningen påbörjats från en (DO3A- tert-butylester) 7, som alkylerades med tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat 8 för att tillhandahålla DOTA-derivat 2. Den palladiumkatalyse hydrering reduceras den aromatiska nitrogruppen i två för att ge anilinen 3. Omvandlingen av 3 med tiofosgen resulterade i isotiocyanat 4, which användes tidigare som en amin-reaktivt medel för framställning av dendrimera CA 17.
I följande skede var makrocykeln 4 användes som den grundläggande monomerenhet i en kopplingsreaktion med den kommersiellt tillgängliga G4 PAMAM-dendrimer. De amin ytgrupper av dendrimeren reagera med isotiocyanatgrupperna av monomeren 4 i närvaro av en bas. Överskottet av 4 avlägsnades genom storleksuteslutningskromatografi under användning av en lipofil gelfiltreringsmedium med metanol som elueringsmedel. De tert-butyl-estrar på den erhållna dendrimer-makrocyklisk konjugat 5 hydrolyserades med myrsyra för att ge 6, som sedan lyofiliserades och användes i nästa steg utan rening. Bildandet av Gd (III) komplex av DOTA-typ makrocykler genomfördes genom tillsats GdCl 3 · 6H 2 O till en vattenhaltig lösning of 6 under upprätthållande av pH vid ca 7. Överskottet av Gd (III) komplexbands med ett gemensamt kelator etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Den GdEDTA komplex och överskott av EDTA avlägsnades från systemet genom storleksuteslutningskromatografi med användning av ett hydrofilt gelfiltreringsmedium med vatten som elueringsmedel. De återstående mindre omfattning föroreningar avlägsnades från lösningen genom centrifugering med användning 3 kDa centrifugal filtreringsenheter.
Efter syntesen av dendrimeren-makrocykeln konjugat har en kombinerad analytisk metod använts för att karakterisera produkterna. För att bestämma ytan-amin beläggning av 5 och 6, har 1 H NMR-spektra analyserats. Resultaten jämfördes och bekräftas med slutprodukten (DCA), där lastningen av dendrimeren med makrocykler har beräknats med hjälp av elementaranalys och MALDI-TOF masspektrometri (Figur3). En kombination av dessa tre metoder resulterade i ett genomsnitt på 49 makrocykliska enheter att konjugeras till G4 dendrimer, vilket motsvarar ~ 75% amin ytan grupp beläggning.
Ytterligare karakterisering av det dendrimera komplexet inkluderade bestämning av relaxiviteten värden, vilket resulterar i 6,2 ± 0,1 mM -1 sek -1 per Gd (III) (eller ungefär runt 300 mM -1 sek -1 per dendrimer) för längsgående relaxiviteten och 30,5 ± 0,6 mM -1 s -1 per Gd (III) (nästan 1500 mM -1 s -1 per dendrimer) för den tvärgående relaxiviteten. DLS mätningar indikerade en hydrodynamisk diameter av 7,2 ± 0,2 nm för DCA (Figur 4).
Slutligen, för att demonstrera effekten av den dendrimera MRI kontrastmedel, var MR utföras på två uppsättningar av fantomer med DCA och klinikenallierad tillgänglig GdDOTA för jämförelse (Figur 5). Den första uppsättningen av fantomer framställdes i syfte att jämföra dessa två kontrastmedel vid identiska Gd (III) koncentrationer, medan den andra uppsättningen utformades för att påvisa effekten vid jämförbara molekyl koncentrationer av dendrimera och mono kontrastmedel, respektive.
Figur 1: Syntes av den makrocykliska DOTA-typ kelator 4. Reagenser, villkor och isolerade utbyten: (i) tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrofenyl) butanoat, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 timmar, 72%; (ii) H 2, Pd / C, EtOH, RT, 16 h, 95%; (iii) CSCL 2, Et3N, RT, 2 h, 53%. Klicka här för att se en större version av denna fi gur.
Figur 2: Syntes av dendrimera MRI kontrastmedlet DCA Reagens och betingelser: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 timmar, 91%;. (Ii) myrsyra, 60 ° C, 24 h, kvant; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 h, 71%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Karakterisering av den dendrimera produkten med hjälp av MALDI-TOF masspektrometri En typisk MALDI-TOF-masspektrum erhölls för DCA.rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:.. Karakterisering av den dendrimera produkten med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS) DLS mätning av DCA (HEPES, pH 7,4) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: In vitro MRI experiment på röret fantomer på 7 T magnetiskt fält (a, b) T 1-viktade och (c, d) T2 viktade MRT av DCA och GdDOTA.. Varje MRI experiment utfördes med två olika koncentrationer av kontrastmedlet: (a, c) med jämförbar Gd (III) koncentrationer (HEPES, pH 7,4); (B, d) med en DCA: koncentrationsförhållande GdDOTA av 1: 5 (HEPES, pH 7,4). Koncentrationerna uttrycks per molekyl och SNR värden visas inom parentes. De parametrar som används i dessa experiment var: field-of-view (FOV) = 40 x 40 mm 2, skivtjocklek = 0,5 mm, antal excitationer (NEX) = 30; (A) matrisstorlek (MTX) = 256 x 256, repetitionstid (TR) = 100 ms, eko tid (TE) = 2,95 ms, flip-vinkel (FA) = 90 °, förvärv tid (TA) = 12 min 48 sek ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2,95 msek, FA = 90 °, TA = 2 min 34 sek; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 130 msek, Rare faktor (RF) = 16, TA = 26 min 40 sek; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 100 ms, RF = 16, TA = 26 min 40 sek.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framställningen av den dendrimera MRI kontrastmedlet kräver lämpligt val av den monomera enheten (dvs. kelatorn för Gd (III)). De minskar toxicitet paramagnetisk jon och hittills en mängd olika acykliska och makrocykliska kelatorer tjäna detta ändamål 1-3. Bland dessa makrocykliska DOTA-typ kelatorer har den högsta termodynamisk stabilitet och kinetisk tröghet och därmed är den mest självklara valet för framställning av inert MR-kontrastmedel 1,18. Dessutom är de benägna att olika syntetiska transformationer, vilket resulterar i bifunktionella kelatorer, förmåga att länka till olika funktionella molekyler (t.ex. riktar vektorer eller nanobärare) samtidigt bildar stabila Gd (III) komplex 19. För detta syfte undersöktes DOTA-typ monomerenhet som beskrivs i detta förfarande framställd från DO3A- tert-butylester, den gemensamma och lättillgängliga prekursorn, och bromiden derivatet av4- (4-nitrofenyl) butansyra. Denna molekyl är härledd från DOTA och besitter en liknande struktur för att samordna Gd (III). Den syntetiska modifiering syftar till att göra detta kelator benägen koppling reaktioner på olika funktionella molekyler och transportörer. Nämligen framställning av DOTA-modifierad molekyl resulterar i en kelator fortfarande med fyra karboxylgrupper som samordning Gd (III) för att bilda en inert komplex och en ortogonal nitrofenyl grupp, som vid konvertering fäster detta kelator till dendrimeren ytan. Detta förfarande möjliggör också för flexibilitet i valet av den ortogonala reaktiva gruppen (t.ex., NH2 eller COOH), som kan tjäna till att koppla den Gd (III) kelator till en önskad bärare på ett föredraget sätt.
Den erhållna bifunktionella kelator kan kopplas till andra molekyler på två olika sätt (dvs. syntetiska förfaranden). När nitrogruppen reduceras till en aminogrupp, den resulterande anilinen kan undergå en kondensationsreaktion med karboxylsyragruppen av den andra molekylen 8. Dessutom kan en aromatisk primär amin-funktionell grupp, i närvaro av tiofosgen lätt kan omvandlas till ett isotiocyanat, en grupp, som lätt reagerar med aminer i polära organiska lösningsmedel såväl som vatten, som erbjuder flera reaktionsmöjligheter för koppling av monomera enheter till dendrimerer 17 , 20,21.
För koppling av bifunktionella kelator till dendrimera bärare, bör en lämplig dendrimer byggnadsställning väljas. Flera faktorer i samband med slut dendrimer konjugat struktur och önskat program skall redovisas i det här steget. På grund av omfattande kommersiell tillgänglighet av dendrimera bärare, kan produkter med olika kärnstrukturer, yt-reaktiva grupper eller generationer väljas. Följaktligen kommer konjugeringsreaktionen att bero på ytan grupp av dendrimeren och den ortogonala gruppen av kelatorn, medan denslutliga konjugatet kan vara neutral, laddade, eller ha olika storlekar (upp till 15-20 nm, beroende på dendrimer generationen) 22. Alla dessa aspekter bör beaktas innan förbereda dendrimera CA, eftersom de kan påverka lösligheten, relaxiviteten (MRI signalförstärkning), diffusion och andra farmakokinetiska egenskaper hos kontrastmedlet, vilket potentiellt kan äventyra dess tillämpning i MRI. Exempelvis kan katjoniska dendrimerer uppvisar toxicitet i biologiska system. Emellertid kan denna effekt minskas genom konjugering av negativt laddade grupper på dendrimer ytan och därigenom minska deras total positiv laddning 23.
I detta protokoll, har vi förberett dendrimera kontrastmedlet DCA användning av proceduren i vilken isotiocyanatgruppen av den monomera makrocykeln 4 kopplades till en kommersiell cystamin-core G4-PAMAM utrustad med 64 primära amin ytgrupper. Den initiala reningen av den hydrophAerob dendrimer produkten 5 utfördes genom gelkromatografi med användning av en kolonn med ett lipofilt gelfiltreringsmedium och metanol som elueringsmedel för att avlägsna det mesta av de oreagerade monomera enheter. Hydrolys av t-butyl-estrar med myrsyra är okomplicerad, vilket resulterar i en vattenlöslig dendrimeriska produkten som kan renas med storleksuteslutningskromatografi med användning av ett hydrofilt gelfiltreringsmedium. Komplexbildning av de multimera och dendrimera kelatorer med Gd (III) utfördes med bibehållande av lösningen vid ett neutralt pH för att underlätta komplexbildningen. Annars, komplexbildning av Gd (III) (tillsatt som kloridsaltet) minskar pH, saktar ner reaktionen. Slutligen är det värt att notera att amingrupper i dendrimer kärnan tenderar också att samordna med Gd (III), men endast med det överskott som inte kunde vara bundet med DOTA enheter. Undvika närvaron av Gd (III) utanför DOTA kelator är väsentlig, eftersom leakage av Gd (III) från CA kan ha oönskade effekter; nämligen kan det framkalla toxicitet in vivo 18. Överskottet Gd (III) kan effektivt avlägsnas genom komplex med EDTA följt av ultrafiltrering av GdEDTA och fri EDTA med användning av 3 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) filter. Lägre MWCO filter kan användas när dendrimera konjugat har lägre molekylvikter.
Det finns två viktiga felsökning i samband med förberedelse av DCA. På grund av den stora utvidgningseffekten av Gd (III) på NMR-signaler, är inte informativ analys av DCA med hjälp av NMR-spektroskopi. I stället bör denna analys utföras i tidigare steg (föreningar 5 och 6). Därefter konjugering av monomacrocyclic enheter till dendrimeren ytan aldrig åstadkommas med 100% omvandling, men det är sannolikt att vara mellan 50 till 90% (se nedan). Typiskt kan de reaktionsutbyten ökas genom tillsats av en andra del av den monomeric reaktiv enhet efter den första konjugering av dendrimer och monomerenhet är klar 24. Men varje beredning satsresulterar i något olika genomsnittligt antal kelatorer konjugerade på dendrimer ytan, även när identiska dendrimer och DOTA heter används som material för koppling. Även om det slutliga beloppet för Gd (III) förekommer i DCA kan bestämmas oberoende via BMS-metoden (se avsnitt 2.2), för bättre karakterisering av dendrimera konjugat, är det nödvändigt att utföra uppskattningen av bundna monomerenheter varje gång en ny sats DCA är beredd (se 2.1 och diskussion nedan).
Den analytiska karakteriseringen av de isolerade dendrimera produkter kan utföras med hjälp av ett H-NMR-spektroskopi (endast på produkter 5 och 6), elementaranalys och MALDI-TOF MS. Typiska utbyten för omvandling av amino ytgrupper ligga mellan 50-90%, beroende på dendrimeren generatipå, typen av kelator, och de använda reaktionsbetingelserna (lösningsmedel och temperatur) 6,20,24,25. I detta fall, de beräknade massorna som erhållits från de kombinerade analyserna motsvarar ett genomsnitt på 49 mono kelater är kopplad till dendrimer (dvs ~ 75% beläggning av dendrimer ytan aminer). Även om en viss obalans i det slutliga antalet reagerade aminogrupper kan förväntas mellan dessa metoder 25, ger deras direkta jämförelser rimliga bevis för bildningen av den önskade DCA med ett visst genomsnittligt antal anslutna kelatbildande enheter.
In vitro karakterisering i syfte att bedöma potentialen för DCA att öka kontrasten i MRI experiment bestod av DLS, relaxometric och MRI experiment. Den hydrodynamiska diameter DCA bestämdes att vara 7,2 ± 0,2 nm med DLS mätningar, vilket är i överensstämmelse med tidigare rapporterade konjugat av detta slagmed G4 generation 4 PAMAM-dendrimerer 26. Bestämning av den längsgående relaxiviteten hos DCA följde den tidigare beskrivna förfarandet 15 och avslöjade värdet på 6,2 ± 0,1 mM -1 sec -1 per Gd (III). Ca 50% av förbättringen i r en av paramagnetiska Gd (III) i DCA relativt liten storlek molekyler av liknande typ (t.ex. GdDOTA) kan förklaras med den mellanliggande storleken på dendrimera kontrastmedlet. Nämligen, ökar den reducerade rörelsen hos Gd-kelater fäst dendrimeren ytan rotationskorrelationstiden och därmed r 1; denna effekt kan fortfarande observeras vid höga magnetfält för mindre nanostorlek medel. Annars ökade rotationskorrelationstiden bidrar dominant till r en förbättring vid låga magnetfält 27. Å andra sidan, storleken av den dendrimera kontrastmedlet hade en uttalad effekt på den tvärgående relaxivity 28, vilket resulterar i värdet på 30,5 ± 0,6 mM -1 sec -1 per Gd (III). Sammanfattningsvis, metoder för in vitro utvärdering av DCA är enkla och kräver bara noggrann provberedning, så inga svårigheter väntas när insamling av data och analysera resultaten.
För att demonstrera prestanda dendrimera kontrastmedlet och dess makt att påverka bildens kontrast, utförde vi MRI experiment på röret fantomer med den nyligen beredd kontrastmedlet DCA. Vi använde också en lösning av ett kommersiellt tillgängliga och kliniskt godkända MRI-kontrastmedel, GdDOTA, som en jämförelse och tuber med vatten som kontroll. I det första T 1-viktade MRI experiment, när lika Gd (III) koncentrationer användes (0,5 eller 1 mM av Gd (III) i DCA eller GdDOTA), SNR i rören med DCA redan var upp till 12% högre på grund en ökning med ca 50% i längd relaxivitet av DCA jämfört med GdDOTA (Figure 5a). Den andra T 1-viktade MRI experiment utformades för att påvisa effekten av DCA när koncentrationerna beräknades per molekyl. Även 5 gånger mindre DCA tillämpades jämfört med GdDOTA (50 jämfört med 250 | iM eller 100 jämfört med 500 iM DCA vs. GdDOTA, respektive), en hög belastning av DCA med Gd (III) resulterade i en signifikant ökning i bildkontrasten, vilket i sin tur resulterade i de observerade SNR värden är åtminstone tre gånger högre i fantom rör fyllda med DCA. Expectedly både T 2 viktade MRI experiment uppvisade stora (3-20 gånger) skillnader i SNR mellan fantom rör fyllda med DCA och GdDOTA.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en bekväm beredning av en dendrimer CA för MRI med användning av vanliga syntesförfaranden för att ge DCA med förbättrade egenskaper jämfört med liten storlek CA. DCA uppvisar föredragna termodynamisk stabilitet och kinetisk tröghet jämförttill sina monomera CA analoger. Icke desto mindre, den multivalens av DCA och därmed den höga lokala koncentrationen av det paramagnetiska ämnet i målregionen inducerar hög kontrast i MR-bilderna. Med tanke på de ofta föredragna farmakokinetiska egenskaper (t.ex. längre vävnads retentionstid) jämfört med deras mono CA analoger, eller förmågan att bära ytterligare funktioner (t.ex. riktade vektorer), dessa dendrimera-makrocykliska konjugat utgör en lovande och värdefull klass av kontrastmedel för olika framtida MRI och molekylära bildprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7 N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15% wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 10% wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | Version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E.
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
