Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

voorbereiding en Published: December 4, 2016 doi: 10.3791/54776
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MR Neuroimaging Agents, Max Planck Institute for Biological Cybernetics

Summary

Dit protocol beschrijft de bereiding en karakterisering van een dendrimere magnetische resonantie imaging (MRI) contrastmiddel dat cyclen gebaseerde macrocyclische chelaten coördinerende paramagnetische gadolinium-ionen draagt. In een serie MRI-experimenten in vitro, deze agent produceerde een versterkte MRI signaal in vergelijking met de commercieel beschikbare monomere analoog.

Abstract

Paramagnetische complexen van gadolinium (III) met acyclische of macrocyclische chelaten zijn de meest gebruikte contrastmiddelen (CA) voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Hun doel is om de versoepeling snelheid van water protonen in het weefsel te versterken, waardoor de MR beeldcontrast en de specificiteit van de MRI-metingen toeneemt. Huidige klinisch goedgekeurde contrastmiddelen vanaf hoogmoleculaire moleculen die snel uit het lichaam geklaard. Het gebruik van dendrimeren als dragers van paramagnetische chelaten kunnen een belangrijke rol spelen in de toekomstige ontwikkeling van efficiëntere MRI contrastmiddelen. Met name de toename van lokale concentratie van het paramagnetische soorten resulteert in een hoger signaal contrast. Bovendien is dit CA levert een langere retentietijd tissue tijd vanwege het hoge molecuulgewicht en grootte. Hier tonen we een geschikte procedure voor de bereiding van macromoleculaire MRI contrastmiddelen op basis van poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimeren monomacrocyclische DOTA-type chelatoren (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraacetaat). De chelerende eenheid werd toegevoegd door het benutten van de reactiviteit van het isothiocyanaat (NCS) groepen naar het oppervlak amine- groepen van de PAMAM dendrimeer te thioureum brugvorming. Dendrimere producten werden gezuiverd en geanalyseerd door middel van kernmagnetische resonantie spectroscopie, massaspectrometrie en elementanalyse. Tenslotte werden hoge resolutie MR beelden die zijn opgenomen en het signaal contrasten verkregen uit de voorbereide dendrimere en in de handel verkrijgbare monomeer agenten werden vergeleken.

Introduction

Magnetic resonance imaging (MRI) is een krachtige en niet-ioniserende beeldvormingstechniek schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en klinische diagnostiek vanwege de invasieve aard en uitstekende intrinsieke zacht weefsel contrast. De meest gebruikte MRI methoden gebruiken het signaal verkregen uit water protonen leveren van hoge resolutie beelden en informatie binnen de weefsels op basis van verschillen in de dichtheid van het water signalen. De signaalintensiteit en de specificiteit van de MRI-experimenten kan verder worden verbeterd middels contrastmiddelen (CA). Dit zijn paramagnetische of superparamagnetische soorten die invloed hebben op de longitudinale (T1) en transversale (T2) relaxatie maal respectievelijk 1,2.

Complexen van het lanthanide-ion gadolinium met polyaminozuren polycarbonzuur liganden de meest gebruikte T 1 CA's. Gadolinium (III) verkort de T 1 ontspanningtijd van water protonen, waardoor het signaal contrast in MRI-experimenten 3 toeneemt. Echter, ionische gadolinium giftig; de grootte benadert die van calcium (II), en ernstige gevolgen calcium bijgestaan ​​signalering in cellen. Daarom worden acyclische en macrocyclische chelaten gebruikt om deze toxiciteit te neutraliseren. Verschillende multidentaat liganden zijn tot nu toe ontwikkeld, waardoor gadolinium (III) complexen met een hoge thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid 1. Op basis van het 12-ledige azamacrocycle cyclen, met name het tetracarbonzuur afgeleide DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-acetaat) zijn de meest onderzochte en toegepaste complexen van deze CA klasse.

Toch GdDOTA-type CA's zijn lage gewicht systemen moleculair, het weergeven van bepaalde nadelen zoals een lage contrast efficiency en een snelle renale excretie. Macromoleculaire en multivalente CA kan een goede oplossing voor deze problemen 4 zijn. Sinds CA biodistributie wordt vooral bepaald door de grootte, macromoleculaire CA tonen veel langere retentietijden in de weefsels. Even belangrijk is de meerwaardigheid van deze middelen resulteert in een verhoogde lokale concentratie van de monomere MR probe (bijvoorbeeld GdDOTA complex), fundamentele verbetering van de verworven MR-signaal en het meten kwaliteit.

Dendrimeren behoren tot de meest geprefereerde draagstructuren voor de bereiding van meerwaardige CA voor MRI 4,5. Deze sterk vertakte macromoleculen met goed gedefinieerde afmetingen zijn gevoelig voor verschillende koppelingsreacties te binden. In dit werk, melden wij de voorbereiding, zuivering en karakterisering van een dendrimere CA voor MRI, bestaande uit een generatie 4 (G4) poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimeer gekoppeld aan GdDOTA-achtige chelaten (DCA). We beschrijven de synthese van de reactieve DOTA-derivaat en de koppeling met de PAMAM dendrimeer. Bij complexering met Gd (III), de standaard fysisch-chemische karakterisering procedure van DCA werd uitgevoerd. Tenslotte werden MRI experimenten uitgevoerd om het vermogen van DCA MR beelden te produceren met een sterker contrast dan die verkregen uit laagmoleculaire CA tonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van DCA

  1. Synthese van de monomeereenheid 4 6.
    1. Synthese van 4- (4-nitrofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) boterzuur-tert-butylester (2).
      1. Te (4,7-bis-tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetra-cyclododec-1-yl) azijnzuur-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) in N, N-dimethylformamide ( DMF, 5 ml), voeg kaliumcarbonaat (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) toe en roer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 45 min.
        OPMERKING: macrocyclus 1 bereid uit cyclen en tert-butyl broomacetaat volgens de eerder gepubliceerde werkwijze 7.
      2. Tert add-butyl-2-broom-4- (4-nitrofenyl) butanoaat (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) Portiegewijs gedurende 1 uur. Zet roeren van het mengsel onder thij dezelfde reactieomstandigheden voor de volgende 18 uur.
        Opmerking: Tert-butyl-2-broom-4- (4-nitrofenyl) butanoaat werd bereid uit 4- (4-nitrofenyl) boterzuur, thionylchloride en broom volgens de eerder gepubliceerde werkwijze 8.
      3. DMF verwijderd via bulb-to-bulb vacuümdestillatie bij 40-60 ° C 9.
      4. Zuiver het residu door kolomchromatografie (silicagel, 7% methanol / dichloormethaan) product 2 werd verkregen als een bruine amorfe vaste stof (1,09 g, 72%) 10.
    2. Synthese van 4- (4-aminofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) boterzuur-tert-butylester (3).
      1. Los het nitrobenzeenderivaat 2 (1,00 g, 1,28 mmol) in ethanol (10 ml) en 7 N ammonia in methanol (150 pl). palladium toevoegen geactiveerde koolstof als katalysator (Pd / C, 150 mg, 15 gew%) aan de Solutiop.
      2. Schud het heterogene mengsel gedurende 16 uur onder een waterstofatmosfeer (2,5 bar) in de Parr hydrogenator apparaat.
      3. Bereid een koek van diatomeeënaarde door suspenderen in ethanol en het filteren van de suspensie door een gesinterde glazen trechter. Giet de schorsing van 1.1.2.2 in de voorbereide taart aan de Pd / C katalysator te verwijderen door middel van filtratie.
      4. Verwijder het oplosmiddel door zacht destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C), wat verbinding 3 werd verkregen als een bruine amorfe vaste stof (0,91 g, 95%).
    3. Synthese van 4- (4-isothiocyanatofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) boterzuur-tert-butylester (4).
      1. Voeg thiofosgeen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) Aan een mengsel van 3 (0,91 g, 1,22 mmol) en triethylamine (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 equiv.) In dichloormethaan (15 ml).
      2. Krachtig roer de reactie mixture met een magnetische roerder bij kamertemperatuur gedurende 16 uur.
      3. Verwijder het oplosmiddel door zacht destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C) en zuiver het ruwe product door kolomchromatografie (silicagel, 5% methanol / dichloormethaan) om het product 4 werd verkregen als een lichtbruine amorfe vaste stof (0,51 g, 53%).
  2. Synthese van het dendrimeer DCA.
    1. Synthese van het dendrimeer 5.
      1. Neem G4 PAMAM dendrimeer (667 mg, 10% dendrimeer-oplossing in methanol, 4,67 umol), verdampt de methanol door voorzichtig destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C) en los het residu in DMF (4 ml) .
      2. Voeg triethylamine (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Roeren gedurende 45 minuten bij 60 ° C en voeg isothiocyanaat 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. Ten opzichte van het oppervlak amino- groepen van het dendrimeer) portiegewijs over 1 uur.
      3. Roer het reactiemengsel met een magnetische roerder bij 45 ° C gedurende 48 uur.
      4. Verwijder het oplosmiddel door middel van bulb-to-bulb vacuümdestillatie bij 40-60 ° C.
      5. Zuiver het residu door grootte-uitsluitingschromatografie onder toepassing van een lipofiele gelfiltratiemedium en methanol als eluens. Om de kolom te pakken, zwel het filtermedium in methanol gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (> 4 ml methanol per 1 g poeder) zonder druk. Uitvoeren decantering door het verzamelen van 1 ml fracties.
      6. Analyseer de verzamelde fracties met dunnelaagchromatografie (TLC). Ontwikkel het TLC-plaat in 15% methanol / dichloormethaan (alleen de meest polaire vlek op de basislijn is afkomstig van dendrimere product). Damp de verzamelde fracties door zachte destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C) tot 5 product (270 mg, 91%) te verkrijgen.
    2. Synthese van het dendrimeer
    3. Los het beschermde chelator dendrimere 5 (270 mg, 4,23 umol) in mierenzuur (5 ml) en gedurende 24 uur roeren van het mengsel bij 60 ° C.
    4. Damp het mierenzuur door destillatie op een rotatieverdamper (~ 15 mbar, waterbadtemperatuur ~ 40 ° C) en vriesdrogen het product 6 te geven (druk ~ 0,2 mbar) 9.
  3. Synthese van de dendrimere contrastmiddel (DCA)
    1. Los het dendrimere chelator 6 (4,35 umol) in water en op pH 7,0 met 0,1 M natriumhydroxide.
    2. Ontbinden GdCl 3 · 6H 2 O (113 mg, 304 umol) in water (1 ml) en druppelsgewijs aan de oplossing van 6 chelator gedurende 4 uur toe te voegen; handhaven van de pH op 7,0 met natriumhydroxide oplossing (0,05 M) door het meten van de pH met een pH-meter.
    3. Roer het mengsel met een magnetische roerder bij kamertemperatuur temperature gedurende 24 uur.
    4. Voeg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 158 mg, 426 umol) aan de oplossing portiegewijs gedurende 4 uur om de overmaat te verwijderen Gd (III), terwijl de pH op 7,0 met natriumhydroxide oplossing (0,05 M). Roer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
    5. Uitvoeren size-exclusion chromatografie om de meerderheid van GdEDTA en de overmaat EDTA te verwijderen. Gebruik een hydrofiele gelfiltratiemedium gezwollen in water om de kolom te pakken. Verminder het mengsel tot een geschikt volume en de kolom geladen. Elueer de kolom met gedeïoniseerd water zonder druk.
    6. Centrifugeer het monster met behulp van een 3 kDa centrifugale filtereenheid gedurende 30 minuten bij 1800 xg centrifugaalkracht aan de residuen van GdEDTA EDTA en verwijderen. Herhaal deze stap (ongeveer vijf maal) totdat het filtraat toont de afwezigheid van EDTA en GdEDTA. Breng het monster in een kolf, verdampen, en vervolgens vriesdrogen het oplosmiddel om een ​​gebroken wit product als de uiteindelijke DCA verkrijgen (186 mg, 71%).
      OPMERKING: Controleer afwezigheid van EDTA en GdEDTA door middel van ESI-MS.
    7. Bevestigen de afwezigheid van Gd (III) als een gratis ion met de xylenol oranje-test. Los het filtraat (0,5 ml) in een acetaatbuffer (pH 5,8). Voeg een paar druppels van een xylenol oranje oplossing en volgen de kleurverandering (geel of violette kleur geeft de aanwezigheid of afwezigheid van vrij Gd (III) ionen in oplossing respectievelijk) 11.

2. In vitro karakterisering van dendrimere Producten

  1. Schatting van het aantal macrocyclische DOTA-eenheden gekoppeld met de PAMAM dendrimeer (belading van het dendrimeer met DOTA-achtige macrocyclische)
    1. Schatting met 1H NMR (NMR - kernmagnetische resonantiespectroscopie).
      OPMERKING: Deze procedure is mogelijk bij dendrimeren 5 en 6, maar niet op DCA.
      1. Noteer het 1H NMR spectrum 12.
      2. Integreer het aromatische gebied en de twee afzonderlijke alifatische regio (1. signalen van het dendrimeer en alifatische protonen macrocyclische 2. signalen van de t-Bu groepen) of onder alifatisch regio dendrimeren 5 en 6, respectievelijk.
        Opmerking: Er is geen apart signaal in het alifatische gebied afkomstig van de t-Bu groepen dendrimeer 6 aangezien ze zijn gehydrolyseerd.
      3. Gebruik Eq. 1 of Vgl. 2 het aantal macrocyclische eenheden (n), waarin R = de verhouding van integralen schatten (alifatisch / aromatisch van vgl. 1 of alifatisch-dendrimeer / alifatische t- Bu in vgl. 2), H dend = aantal protonen in dendrimeer, H Ar = het aantal aromatische protonen, H tBu = het aantal protonen in t-Bu groep en H mAC = het aantal protonen in een macrocyclus.
        Opmerking: Ofwel Eq. 1 of Vgl. 2 kunnen worden gebruikt for dendrimeer 5, terwijl slechts Eq. 1 kan worden gebruikt voor dendrimeer 6. Sinds uitwisselbare protonen (op amines, amides, thioureumverbindingen of carboxylaten) zijn meestal worden vervangen door deuterium, waren ze niet verondersteld in de berekeningen. Hier, H dend = 1128 (5) of 1000 (6), H Ar = 4 en H MAC = 27 gebruikt.
        vergelijking 1 (1)
        vergelijking 2 (2)
    2. Schatting van elementairanalyse met de verhouding van stikstof tot zwavel.
      1. Voer de elementaire analyse van de vaste dendrimere monster (DCA in dit werk).
      2. Gebruik Eq. 3 het aantal macrocyclische eenheden (n), waarin R = de verhouding bepaald en% N% S, N of S dend dend = het aantal schattenstikstof- of zwavelatomen in het dendrimeer en N of S MAC MAC = aantal stikstof- of zwavelatomen in een macrocyclische eenheid.
        Opmerking: De factor 2,29 wordt verkregen uit de verhouding van de atoommassa van zwavel en stikstof. In dit werk, N dend = 250, S dend = 2, N = 5 mac en mac S = 1 gebruikt.
        vergelijking 3 (3)
    3. Estimation met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF).
      1. Voer de MALDI-TOF MS analyse 13.
      2. Bereken het aantal macrocyclische eenheden (n) volgens Vgl. 4, waarbij M z = de waargenomen massa (m / z), z = de lading van de soort, M dend = de massa van de dendrimere enerzijds, en M mac = de massa van een macrocyclische eenheid.
        NEETE: M dend = 14.306 en M mac = 719 werden gebruikt in dit werk.
        vergelijking 4 (4)
  2. Bepaling van DCA concentratie ([DCA]): Bulk magnetische gevoeligheid meting (BMS)
    1. Ontbinden DCA (5-10 mg) in water (360 ui) in een plastic flacon buis ([DCA] ~ 5-10 mM).
      OPMERKING: [DCA] dient in het traject van 5-10 mM om mogelijke overlapping van t- BuOH resonanties voorkomen bij monsterconcentraties> 15 mM, met de resonantie van water bij δ = 4,7 ppm.
    2. Voeg 60 ul van D 2 O: t- BuOH mengsel (2: 1 v / v) aan de waterige oplossing van DCA en meng de resulterende oplossing (420 pl) met een Vortex mixer.
    3. Overdracht 400 ul van het monster in een NMR-buis en buitenste plaats een coaxiale NMR inzetbuis met een t-BuOH: H2O mengsel (10:90 v / v) in de monsterbuis.
    4. Recordhet 1H NMR spectrum en meet de frequentieverschuiving tussen de resonantiesignalen die uit t- BuOH in de binnenste en buitenste buizen NMR (referentie) 12.
    5. Gebruik Eq. 5 aan de [DCA], waarbij T = de absolute temperatuur te bepalen, Δχ = het opgenomen shift, p eff = de effectieve magnetische moment voor een lanthanide-ionen (μ eff = 7,94 voor Gd (III) 14, en s = een constante afhankelijke van de vorm van het monster en de positie in het magnetische veld (0, 1/3 en 1/6 in het geval van een bol, cilinder evenwijdig aan, en de cilinder loodrecht op het magnetische veld, respectievelijk).
      Opmerking: De berekende waarde verkregen voor de [DCA] worden veranderd in de oorspronkelijke concentratie als gevolg van de toevoeging van de D 2 O: t- BuOH-oplossing (60 ui).
      vergelijking 5 (5)
  3. dynamisch lichtverstrooiing (DLS) metingen.
    1. Bereid een gefilterde DCA-oplossing (0,2 urn polytetrafluorethyleen / PTFE filter, 0,75 mM per Gd (III)) in 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) buffer (25 mM, pH 7,4) en breng deze in een cuvet voor de DLS meting.
    2. Plaats de cuvet in de DLS inrichting en stel de volgende parameters: 5 herhalingen van 15 scans (1 scan = 12 sec, brekingsindex = 1,345, absorptie = 1%) zonder vertraging tussen de scans en temperatuurevenwicht 30 seconden voor de opname .
    3. Exporteert de verkregen gegevens en het verkrijgen van de grootteverdeling histogram door het uitzetten populatie (%) als een functie van grootte (hydrodynamische diameter).
  4. Meting van de longitudinale en transversale relaxiviteiten.
    OPMERKING: Een soortgelijke procedure werd reeds beschreven aan de hand van de relaxatietijd analyzer 15; Deze procedure werd uitgevoerd met een 300 MHz NMR-spectrometer met Topspinsoftware.
    1. Bereid een reeks van DCA-oplossingen in H 2 O: D 2 O (500 pl, 10% D 2 O in H 2 O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 en 5,0 mm, [HEPES ] = 25 mM) van de DCA voorraad monster (zie paragraaf 2.2).
    2. Transfer 450 ul van de oplossing in een NMR-buis en plaats deze in het instrument.
    3. Optimaliseer de acquisitie parameters (90 ° excitatie pulsduur (p1) en bestraling frequentieverschuiving (O 1)) en voer vervolgens de T 1 en T 2 experimenten met behulp van de inversie recovery (IR) en Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) pulssequenties, respectievelijk.
    4. Bepaling van T1 en T2 relaxatietijden.
      1. Selecteer de opgenomen meting, proces van de 2D-spectrum in de F2 dimensie, en het uitvoeren van de interactieve fase correctie.
      2. Selecteer de juiste slice (piek met maximale intensiteit) bij de analyse / T 2 ontspanning venster, integreren, en de uitvoer van de regio om de ontspanning module.
      3. Selecteer de juiste fitting functie (invrec of uxnmrt2 voor IR en CPMG experimenten, respectievelijk) aan de T 1 of T 2 relaxatietijden te verkrijgen.
    5. Herhaal stap 2.4.4.2-2.4.4.4 voor alle overige [DCA] oplossingen.
    6. Bereken de relaxatiesnelheden (R 1 en R 2) uit de verkregen waarden T 1 (R = 1,2 1 / 1,2 T).
    7. Plot R 1 en R 2 (sec -1) als functie van Gd (III) -concentratie in mM.
    8. Bepaal de longitudinale en transversale relaxiviteiten, r 1 en r 2 (mM -1 sec -1), uit de helling van de aangebrachte lijn, zoals gedefinieerd door Vgl. 6, waarin Ri, obs = de longitudinale (i = 1) of dwars (i = 2) diamagnetische relaxatiesnelheid vanwater in afwezigheid van paramagnetische soorten en [GD] = de concentratie van Gd (III) gebruikt in het experiment.
      vergelijking 6 (6)

3. In vitro MRI; Vergelijking tussen DCA en GdDOTA

  1. Voorbereiding van de buis fantomen
    1. Bereid waterige oplossingen van DCA (4 x 350 pi) en GdDOTA (4 x 350 pi) en water monsters (4 x 350 pi) twee sets van experimenten waarbij de concentratie van de contrastmiddelen wordt berekend: (3.1.1.1) per Gd (III) of (3.1.1.2) per molecuul.
      1. Bereid twee DCA samples en twee GdDOTA monsters met concentraties van 0,5 en 1,0 mM per Gd (III) resp. Bovendien, voor te bereiden twee watermonsters (als controle-buizen).
      2. Bereid twee DCA monsters (2,5 en 5,0 mM per Gd (III) of 0,05 en 0,1 mM per dendrimere molecuul), twee GdDOTA monsters (0,25, 0,5 mM) en twee watermonsters (control tubes).
        LET OP: De juiste DCA en GdDOTA concentraties moeten worden voorbereid door het verdunnen van de respectieve voorraad monsters met concentraties bepaald via de BMS methode (zie punt 2.2) met HEPES buffer (pH 7,4). Om de berekening te vereenvoudigen, n = 50 werd uitgegaan van het gemiddelde aantal macrocyclische eenheden per dendrimeer molecuul. Daarom is de verhouding van DCA: GdDOTA was 1: 5, berekend op een basis per molecuul.
    2. Plaats de monsters in 300 ul plastic flesje buizen, het vermijden van de aanwezigheid van luchtbellen in de oplossing.
      OPMERKING: De grootte van de plastic flesje buizen afhankelijk van het type en de grootte van de radiofrequente spoel gebruikt (hier een voorbeeld waarbij het volume spoel wordt gegeven).
    3. Plaats de monsters in een injectiespuit (60 ml volume), vul het met 1 mM GdDOTA oplossing, en plaats het in de scanner.
      Opmerking: De monsters werden in de waterige oplossing van GdDOTA geplaatst gevoeligheid effecten (variaties in het magnetische veld en voorkomentrength die in de buurt van interfaces tussen stoffen van verschillende magnetische gevoeligheid) optreden.
  2. Parameter optimalisatie en beeldvorming.
    1. Gebruik de anatomische scan (Localizer / TriPilot) aan de spuit met de monsters positie in het isocentrum van de magneet.
    2. Druk op het verkeerslicht (aanpassing scan) om aanpassingen uit te voeren voor shimming (aanpassing van het magnetisch veld homogeniteit) van het hele volume, de centrale frequentie (O 1), de ontvanger versterking (RG), en de zend gain (TX0 en TX1).
    3. Voor T 1-gewogen (T 1w) beeldvorming, selecteert u de snelle methode lage hoek shot (FLASH).
    4. Kies coronale slice voor de verticaal geplaatste (spuit horizontaal) monsters in de scanner met behulp van de Localizer scan.
    5. Gebruik Eq. 7 voor de optimalisatie van de contrast-ruisverhouding (CNR) opnameparameters 16, waarbij α = de kantelhoek, TE = de echotijd, TR =de herhalingstijd en T 1, A, T 1, B = T 1 keer monster A (T 1, A) en monster B (T 1, B) die de CNR worden gemaximaliseerd (hetzelfde geldt voor T 2 keer: 2 T, A en T 2, B).
      OPMERKING: T 1 en T2 relaxatietijden worden ingesteld op waarden verkregen uit de metingen van longitudinale en transversale relaxiviteiten (sectie 2.4), terwijl TE, TR en α moeten worden verkregen van de CNR optimalisatie berekening.
      vergelijking 7 (7)
    6. Het verwerven van de afbeelding met de parameters verkregen in de voorgaande stap (3.2.5).
    7. Bereken de signaal-ruisverhouding (SNR).
      1. Laad de verworven afbeelding T 1w (scan) in de Image display & processingvenster, en klik op Define regio van belang (ROI).
      2. Kies een cirkelvormige ROI en trek het op het monster positie en achtergrond. Vervolgens op display de gemiddelde signaalamplitude (S signaal) en de standaarddeviatie van de achtergrond (ruis S) te verkrijgen.
      3. Herhaal stap 3.2.7.2 voor de DCA, GdDOTA en watermonsters.
      4. Bereken de SNR met de formule: SNR = S signaal / ruis S.
    8. Na een enigszins gewijzigde procedure uit te voeren T2-gewogen (T 2w) beeldvorming met behulp van de snelle overname met ontspanning enhancement (RARE) methode. Voor optimalisatie van de CNR acquisitieparameters Gebruik Vgl. 8.
      vergelijking 8 (8)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De bereiding van DCA bestond uit twee fasen: 1) synthese van de monomere DOTA-type chelator (figuur 1) en 2) het koppelen van de chelator met de G4 PAMAM dendrimeer en eropvolgende bereiding van het dendrimere Gd (III) complex (figuur 2) . In de eerste fase wordt een basis-cyclen DOTA-type chelator met vier carbonzuren en een orthogonale groep geschikt is voor verdere synthetische modificaties bereid. De bereiding begonnen van 1 (DO3A- tert-butylester) 7, dat gealkyleerd werd met tert-butyl 2-broom-4- (4-nitrofenyl) butanoaat 8 tot DOTA-derivaat 2 verschaffen. De door palladium gekatalyseerde hydrogenering verkleinde aromatische nitrogroep in 2 tot de aniline 3 verkregen. De omzetting van 3 met thiofosgeen resulteerde in het isothiocyanaat 4, which is eerder gebruikt als een amine-reactief middel voor de bereiding van dendrimere CA 17.

In de volgende fase, de macrocyclische 4 werd gebruikt als de basis monomere eenheid in een koppelingsreactie de handel verkrijgbare G4 PAMAM dendrimeer. Het amine oppervlakte groepen van de dendrimeer reageren met de isothiocyanaatgroepen van het monomeer 4 in aanwezigheid van een base. De overmaat 4 werd verwijderd door grootte-uitsluitingschromatografie onder toepassing van een lipofiele gelfiltratie medium met methanol als eluens. De tert-butyl esters op de verkregen dendrimeer-conjugaat macrocyclische 5 gehydrolyseerd met mierenzuur onder verkrijging 6, die vervolgens werd gevriesdroogd en gebruikt in de volgende stap zonder zuivering. De vorming van Gd (III) complexen van macrocyclische DOTA-type werd uitgevoerd door het toevoegen GdCl 3 · 6H 2 O aan een waterige oplossing of 6 terwijl de pH op ongeveer 7. De overmaat Gd (III) werd gecomplexeerd met een gemeenschappelijke chelator ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). De GdEDTA complex en overmaat EDTA uit het systeem door grootte-uitsluitingschromatografie verwijderd met een hydrofiele gelfiltratiemedium met water als eluens. De overige kleine formaat verontreinigingen werden verwijderd uit de oplossing door centrifugeren via 3 kDa centrifugale filtereenheden.

Na de synthese van de dendrimeer-macrocyclische conjugaten heeft een gecombineerde analytische benadering toegepast om de producten te karakteriseren. De oppervlakte-amine bezetting van 5 en 6 bepalen, zijn 1H NMR spectra geanalyseerd. De resultaten werden vergeleken en bevestigd door het eindproduct (DCA), waarbij de belading van het dendrimeer met macrocyclische geschat met gebruikmaking van elementair analyse en MALDI-TOF massaspectrometrie (Fig3). Een combinatie van deze drie methoden resulteerde in gemiddeld 49 macrocyclische eenheden geconjugeerd aan het dendrimeer G4, die tot ~ 75% amine- oppervlak groep bezetting correspondeert.

Verdere karakterisering van het dendrimere complex opgenomen bepaling van de relaxatie waarden, wat resulteert in 6,2 ± 0,1 mmol -1 sec -1 per Gd (III) (of ruwweg ongeveer 300 mmol -1 sec -1 per dendrimeer) voor de longitudinale relaxatie en 30,5 ± 0,6 mm -1 sec -1 per Gd (III) (bijna 1.500 mmol -1 sec -1 per dendrimeer) voor de dwarse relaxatie. DLS metingen aangegeven een hydrodynamische diameter van 7,2 ± 0,2 nm voor DCA (figuur 4).

Tenslotte, om het effect van de dendrimere MRI contrastmiddel te demonstreren, werd MRI uitgevoerd op twee fantomen met DCA en de kliniekbondgenoot beschikbaar GdDOTA voor vergelijkingsdoeleinden (Figuur 5). De eerste reeks fantomen werden voorbereid met het oog op het vergelijken van deze twee contrast agents aan ongewijzigde Gd (III) concentraties, terwijl de tweede set werd ontworpen om het effect bij vergelijkbare molecule concentraties van de dendrimere en monomere contrastmiddelen te tonen, respectievelijk.

Figuur 1
Figuur 1: Synthese van de macrocyclische DOTA-type chelator 4. Reagentia, bepalingen en geïsoleerde opbrengsten: (i) tert-butyl 2-broom-4- (4-nitrofenyl) butanoaat, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 uur, 72%; (ii) H2, Pd / C, EtOH, kamertemperatuur, 16 uur, 95%; (iii) CSCL 2, Et3N, RT, 2 uur, 53%. Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijken guur.

Figuur 2
Figuur 2: Synthese van de dendrimere MRI contrastmiddel DCA Reagentia en omstandigheden: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 uur, 91%;. (Ii) mierenzuur, 60 ° C, 24 uur, kwantitatief; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 uur, 71%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Karakterisering van het dendrimere product door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie Een typische MALDI-TOF massaspectrum verkregen DCA.rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4:.. Karakterisering van de dendrimere product door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS) DLS meting van DCA (HEPES, pH 7,4) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: In vitro experimenten met MRI buis fantomen 7 T magnetisch veld (a, b) T1-gewogen en (c, d) T2-gewogen MRI DCA en GdDOTA.. Elk MRI experiment werd uitgevoerd met twee verschillende concentraties van het contrastmiddel: (a, c) met vergelijkbare Gd (III) concentraties (HEPES, pH 7,4); (B, d) met DCA: GdDOTA concentratieverhouding van 1: 5 (HEPES, pH 7,4). De concentraties worden uitgedrukt per molecuul en de SNR waarden worden weergegeven tussen haakjes. De parameters die in deze experimenten waren: field-of-view (FOV) = 40 x 40 mm 2, slice dikte = 0,5 mm, het aantal excitaties (NEX) = 30; (A) matrix grootte (MTX) = 256 x 256, herhalingstijd (TR) = 100 ms, echo tijd (TE) = 2,95 msec, flip hoek (FA) = 90 °, acquisitie tijd (TA) = 12 min 48 sec ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2,95 msec, FA = 90 °, TA = 2 min 34 sec; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 130 msec, Rare factor (RF) = 16, TA = 26 min 40 sec; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 100 msec, RF = 16, TA = 26 min 40 sec.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voorbereiding van de dendrimere MRI-contrastmiddel vereist juiste keuze van de monomere eenheid (dat wil zeggen, de chelator voor Gd (III)). Ze verminderen de toxiciteit van dit paramagnetische ion en tot nu toe een groot aantal acyclische en macrocyclische chelatoren dienen daartoe 1-3. Hiervan macrocyclische DOTA-type chelatoren bezitten de hoogste thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid en daarmee zijn de meest geprefereerde keuze voor de bereiding van inerte MRI contrastmiddelen 1,18. Bovendien zijn ze gevoelig voor verschillende synthetische transformaties die leiden tot bifunctionele cheleermiddelen, kunnen koppelen aan verschillende functionele moleculen (bijvoorbeeld richtende vectoren of nano-dragers), terwijl nog steeds stabiel Gd vormen (III) complexen 19. Daartoe de DOTA-type monomere eenheid in deze procedure worden beschreven bereid uit DO3A- tert-butylester, de gemeenschappelijke en gemakkelijk beschikbaar precursor, en het bromide derivaat vande 4- (4-nitrofenyl) butaanzuur. Dit molecuul is afgeleid van DOTA en bezit een soortgelijke structuur voor de coördinatie Gd (III). De synthetische modificatie wil dit chelator gevoelig voor koppelingsreacties verschillende functionele moleculen en dragers maken. Namelijk de voorbereiding van de DOTA-gemodificeerde molecuul leidt tot een chelator nog vier carboxylgroepen vindt coördinatie Gd (III) een inerte complex en een orthogonale nitrofenylgroep, die bij conversie hecht deze chelator aan het dendrimeer oppervlak te vormen. Deze werkwijze maakt ook flexibiliteit in de keuze van de orthogonale reactieve groep (bijvoorbeeld, NH2 of COOH), die kunnen dienen voor het koppelen van het Gd (III) chelator aan een gewenste drager in een voorkeurswijze.

De verkregen bifunctionele chelator kan worden gekoppeld aan andere moleculen op twee verschillende manieren (bijv synthesewerkwijzen). Wanneer de nitrogroep wordt gereduceerd tot een aminogroep, kan het verkregen aniline onderga een condensatiereactie met de carbonzuurgroep van het andere molecuul 8. Bovendien kan een aromatische primaire amine functionele groep in aanwezigheid van thiofosgeen gemakkelijk worden omgezet in een isothiocyanaat, een groep die gemakkelijk reageert met aminen in polaire organische oplosmiddelen en water, met meer reactiemogelijkheden voor de koppeling van monomere eenheden dendrimeren 17 , 20,21.

Voor het koppelen van de bifunctionele chelator de dendrimere vervoerder, moet een passende dendrimere steiger worden geselecteerd. Verschillende factoren die verband houden met de uiteindelijke dendrimeer conjugaat structuur en de gewenste toepassing dient te worden verwerkt in deze stap. Door brede commerciële beschikbaarheid van dendrimere dragers kunnen producten met verschillende kernstructuren, oppervlakte-reactieve groepen of generaties worden gekozen. Bijgevolg zal de conjugatiereactie afhankelijk van het oppervlak van de dendrimeer groep en orthogonale groep van de chelator, terwijl definal conjugaat kan neutraal, geladen zijn, of hebben verschillende afmetingen (tot 15-20 nm, afhankelijk van dendrimeer generatie) 22. Al deze aspecten moeten in aanmerking worden genomen voorafgaand aan de voorbereiding van de dendrimere CA, aangezien zij de oplosbaarheid, relaxatie (MRI signaalversterking), verspreiding, en andere farmacokinetische eigenschappen van het contrastmiddel, die mogelijk de toepassing ervan in MRI in gevaar kan brengen kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld kan kationische dendrimeren toxiciteit vertonen in biologische systemen. Echter, dit effect kan worden verminderd door conjugatie van negatief geladen groepen op het dendrimeer oppervlak, waardoor het globale positieve lading 23 verminderen.

In dit protocol, hebben wij bereid de dendrimere contrastmiddel DCA volgens de procedure waarin de isothiocyanaatgroep van de monomere macrocyclische 4 werd gekoppeld aan een commercieel cystamine-core-G4 PAMAM voorzien 64 primair amine oppervlaktegroepen. De initiële zuivering van de hydrophobic dendrimere product 5 werd uitgevoerd door gelchromatografie onder toepassing van een kolom met een lipofiele gelfiltratiemedium en methanol als het eluent om de meeste van de gereageerde monomere eenheden te verwijderen. De hydrolyse van tert-esters met mierenzuur is eenvoudig, waardoor een wateroplosbare dendrimere product kan worden gezuiverd met grootte-uitsluiting chromatografie onder toepassing van een hydrofiele gelfiltratiemedium. De complexering van het multimere en dendrimere chelatoren met Gd (III) werd uitgevoerd met behoud van de oplossing bij een neutrale pH teneinde de complexvorming te vergemakkelijken. Anders, de complexering van Gd (III) (toegevoegd als het chloridezout) verlaagt de pH, vertraagt ​​de reactie. Tenslotte zij opgemerkt dat aminegroepen in het dendrimeer kern ook de neiging te coördineren met Gd (III), maar alleen met het risico dat niet kon worden gecheleerd met DOTA eenheden. Het vermijden van de aanwezigheid van Gd (III) buiten de chelator DOTA noodzakelijk omdat leakage van Gd (III) van de CA kan ongewenste effecten hebben; namelijk kan toxiciteit induceren in vivo 18. De overmaat Gd (III) kunnen effectief worden verwijderd door complexatie met EDTA gevolgd door ultrafiltratie van GdEDTA en vrij EDTA middels 3 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) filters. Lagere MWCO filters kunnen worden gebruikt wanneer de dendrimere conjugaten lagere molecuulgewichten.

Er zijn twee belangrijke oplossen van problemen in verband met de voorbereiding van DCA. Vanwege de grote breedte-effect van Gd (III) met NMR-signalen, de analyse van DCA door middel van NMR-spectroscopie is niet informatief. In plaats daarvan moet deze analyse worden uitgevoerd in vroege stappen (verbindingen 5 en 6). Vervolgens wordt de conjugatie van monomacrocyclic eenheden aan het dendrimeer oppervlak nooit bereikt met 100% omzetting, maar het is waarschijnlijk tussen 50-90% (zie hieronder). Meestal kan de reactieopbrengsten worden verhoogd door toevoeging van een tweede gedeelte van de monomeric reactieve eenheid na de eerste vervoeging van dendrimeer en monomere eenheid is voltooid 24. Echter, elke batch preparaat leidt tot enigszins verschillende gemiddelde aantallen chelatoren geconjugeerd aan het dendrimeer oppervlak, zelfs wanneer dezelfde dendrimeer en DOTA eenheden worden gebruikt als materialen voor het koppelen. Hoewel de uiteindelijke hoeveelheid Gd (III) aanwezig in DCA zelfstandig kan worden bepaald door het BMS-methode (zie paragraaf 2.2), voor een betere karakterisering van dendrimere conjugaten, is het noodzakelijk om de bepaling van gebonden monomeereenheden voeren telkens wanneer een nieuwe partij DCA is opgesteld (zie 2.1 en discussie hieronder).

De analytische karakterisering van de geïsoleerde dendrimere producten kan worden uitgevoerd door middel van 1H NMR spectroscopie (voor producten 5 en 6), elementanalyse en MALDI-TOF MS. Typische opbrengsten van de omzetting van amino oppervlaktegroepen liggen tussen 50-90%, afhankelijk van het dendrimeer Generatiop het type cheleermiddel en de toegepaste reactieomstandigheden (temperatuur en oplosmiddel) 6,20,24,25. In dit specifieke geval, de berekende massa's verkregen uit de gecombineerde analyse overeen met gemiddeld 49 monomere chelaten is gekoppeld met de dendrimeer (bijv ~ 75% bezetting van het dendrimeer oppervlak aminen). Hoewel een klein verschil in het uiteindelijke aantal gereageerde aminogroepen kunnen worden verwacht tussen deze methodologieën 25, de directe vergelijking levert redelijk bewijs voor de vorming van de gewenste DCA met een bepaald gemiddeld aantal aangesloten chelerende eenheden.

De in vitro karakterisering gericht op het potentieel van DCA beoordelen in het contrast bij MRI experimenten vergroten bestond uit DLS, relaxometric en MRI experimenten. De hydrodynamische diameter van DCA werd bepaald als 7,2 ± 0,2 nm met DLS metingen, wat in overeenstemming met eerder gerapporteerde conjugaten van dit soort zijnmet G4 generatie 4 PAMAM dendrimeren 26. Bepaling van de longitudinale relaxatie van DCA volgde de hierboven beschreven procedure 15 en bleek de waarde van 6,2 ± 0,1 mM -1 sec -1 per Gd (III). Ongeveer 50% van de verhoging in de r 1 paramagnetische Gd (III) DCA opzichte van klein formaat moleculen van hetzelfde type (bijvoorbeeld GdDOTA) kan worden toegelicht aan de tussenmaat van de dendrimere contrastmiddel. Namelijk de verminderde beweging van de Gd-chelaten bevestigd aan het dendrimeer oppervlak vergroot de rotatiecorrelatietijd en derhalve r 1; Dit effect kan nog worden waargenomen bij hoge magneetvelden kleinere nanoschaal middelen. Anders is de toename rotatiecorrelatietijd dominant bijdraagt tot r 1 versterking bij lage magnetische velden 27. Aan de andere kant, de omvang van de dendrimere contrastmiddel had een uitgesproken effect op de dwarse relaxivity 28, waardoor de waarde van 30,5 ± 0,6 mM -1 sec -1 per Gd (III). Samengevat zijn de werkwijzen voor in vitro beoordeling van DCA zijn eenvoudig en vereisen slechts zorgvuldige monstervoorbereiding, dus geen problemen verwacht bij het verzamelen van gegevens en het analyseren van de resultaten.

Om de prestaties van de dendrimere contrastmiddel en haar bevoegdheid om het beeldcontrast van invloed aan te tonen, hebben we uitgevoerd MRI-experimenten op de buis fantomen met de nieuw bereide contrastmiddel DCA. Wij gebruikten ook een oplossing van een commercieel verkrijgbare en klinisch goedgekeurde MRI contrastmiddel GdDOTA als vergelijking en buizen met water als controle. In de eerste T1-gewogen MRI-experiment bij gelijke Gd (III) concentraties werden gebruikt (0,5 of 1 mM Gd (III) of GdDOTA DCA), de SNR van de buizen met DCA al tot 12% hoger door een stijging van ongeveer 50% in de lengterichting relaxiviteit DCA opzichte GdDOTA (FIGUUR 5a). De tweede T 1-gewogen MRI-experiment werd ontworpen om het effect van DCA wanneer de concentraties werden berekend per molecule aantonen. Hoewel 5 keer minder DCA toegepast vergeleken met GdDOTA (50 versus 250 pM en 100 pM versus 500 DCA vs. GdDOTA, respectievelijk), een hoge belading van DCA met Gd (III) resulteerde in een significante toename in het beeldcontrast, die op zijn beurt geleid tot de waargenomen SNR waarden ten minste drie maal hoger in de fantoom buizen gevuld met DCA. Zoals verwacht, zowel T2-gewogen MRI-experimenten vertoonden grote (3-20 keer) verschillen in de SNR tussen de fantoom buizen gevuld met DCA en GdDOTA.

Tot slot, dit protocol beschrijft een handige bereiding van een dendrimere CA voor MRI het gebruik van gemeenschappelijke synthetische procedures om DCA te voorzien van verbeterde eigenschappen ten opzichte van klein formaat CAS. DCA vertoont voorkeur thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid ten opzichtezijn monomere CA analogen. Toch is de meerwaardigheid van DCA en dus de hoge lokale concentratie van het paramagnetische soorten in het doelgebied induceert hoog contrast in de MR-beelden. Gezien het vaak beter farmacokinetische eigenschappen (bijvoorbeeld langere weefsel retentietijd) dan hun monomere CA analogen, of de mogelijkheid om verdere functionaliteiten dragen (bijv gerichte vectoren), deze dendrimere-macrocyclische conjugaten een veelbelovende en belangrijke klasse van contrastmiddelen voor diverse toekomstige MRI en imaging-toepassingen moleculaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
  2. Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
  3. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
  4. Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
  5. Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
  6. Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
  7. Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
  8. Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
  9. Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
  10. Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
  11. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
  12. Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
  13. Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
  14. Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
  15. Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
  16. Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
  17. Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
  18. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
  19. Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
  20. Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
  21. Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
  22. Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
  23. Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
  24. Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
  25. Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
  26. Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
  27. Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
  28. Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).

Tags

Chemie Chelates contrastmiddelen dendrimeer gadolinium organische synthese magnetic resonance imaging nanoschaal materialen
voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van-dendrimeer gebaseerde Contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gündüz, S., Savić,… More

Gündüz, S., Savić, T., Toljić, Đ., Angelovski, G. Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54776, doi:10.3791/54776 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter