Summary
Bu protokol paramanyetik gadolinyum iyonları koordine Cyclen tabanlı makrosiklik şelatları taşıyan bir dendrimeric manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kontrast madde hazırlanması ve karakterizasyonu açıklar. Ticari olarak temin edilebilen monomerik analog ile karşılaştırıldığında, in vitro olarak MR deneyler serisinde, bu madde bir güçlendirilmiş MR sinyal üretti.
Abstract
asiklik veya makrosiklik şelatlar ile gadolinyum (III) paramanyetik kompleksleri manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için en sık kullanılan kontrast maddeler (CA) bulunmaktadır. Bunların amacı, böylece MR kontrast ve MR, ölçümlerin özgüllüğünün arttırılması, doku su protonlarının gevşeme oranının arttırılmasıdır. Mevcut Klinik olarak onaylanmış kontrast maddeleri hızlı bir şekilde vücuttan, düşük molekül ağırlıklı moleküllerdir. para-manyetik kenetleyiciler taşıyıcıları olarak dendrimerler kullanılması daha verimli MRT-kontrast maddeleri gelecekteki gelişimi önemli bir rol oynayabilir. Spesifik olarak, daha yüksek bir sinyal aksine paramanyetik türler sonuçları yerel konsantrasyonu artar. Ayrıca, bu, CA, yüksek molekül ağırlığı ve büyüklüğü nedeniyle daha uzun bir doku tutma süresi sağlar. Burada, poli (amido) göre makromoleküler MRI kontrast ajanları (tein) monomacro dendrimerlerinde hazırlanması için uygun bir prosedür göstermekhalkalı DOTA-tipi kıskaçlar (DOTA - 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetat). kenetleme birimi tiyoüre köprüleri oluşturmak için tein dendrimer amin yüzey gruplarına yönelik izotiyosiyanat (NCS) grubun reaktivitesini istismar ederek sonuna eklenmiştir. Dendrimeric ürünleri saflaştınldı ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi, kütle spektrometrisi ve elementel analiz vasıtasıyla analiz edildi. Son olarak, yüksek çözünürlüklü MR görüntüleri kaydedildi ve hazırlanan dendrimeric ve piyasada mevcut monomerik ajanlar elde edilen sinyal kontrastlar karşılaştırıldı.
Introduction
Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) nedeniyle invazif olmayan doğası ve mükemmel iç yumuşak doku kontrast yaygın biyomedikal araştırmalar ve klinik teşhis kullanılan güçlü ve iyonize olmayan bir görüntüleme tekniğidir. En sık kullanılan MRG yöntemleri su sinyallerinin yoğunluğu farklılıklara dayalı dokular içinde yüksek çözünürlüklü görüntüler ve ayrıntılı bilgi veren, su proton elde edilen sinyalin kullanmaktadır. sinyal yoğunluğu ve MR deneyler özgüllüğü, bundan başka kontrast maddeleri (CA) kullanılarak geliştirilebilir. Bunlar paramanyetik veya Süperparamanyetik uzunlamasına (T 1) ve enine etkileyen türler (T 2) gevşeme süreleri sırasıyla 1,2 bulunmaktadır.
Poli polikarboksilik asit ligandları ile lantanide iyon gadolinyum kompleksleri en sık kullanılan T 1 CA vardır. Gadolinyum (III) T1 gevşeme kısaltırSu protonların zaman, böylece MR deneylerde 3 sinyal kontrastını artırarak. Bununla birlikte, iyonik gadolinyum zehirlidir; boyutu (ii) kalsiyum yaklaşır ve ciddi kalsiyum destekli hücrelerde sinyal etkiler. Bu nedenle, asiklik ve makrosiklik şelatları Bu toksisite nötralize etmek için kullanılır. Çeşitli multidentat ligandlar yüksek termodinamik stabilite ve kinetik inertlik 1 gadolinyum (III) kompleksleri ile sonuçlanır kadar geliştirilmiştir. Özellikle onun tetrakarboksilik türevi DOTA (1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetat) 12 üyeli azamacrocycle Cyclen dayalı olanlar, bu CA sınıfının en araştırılmış ve uygulamalı kompleksleri bulunmaktadır.
Bununla birlikte, GdDOTA-tipi CA, düşük kontrast verimliliği ve hızlı renal atılım gibi bazı dezavantajları gösteren düşük moleküler ağırlıklı sistemlerdir. Makromoleküler ve çok değerlikli CA bu sorunlara 4 için iyi bir çözüm olabilir. CA biodistribu yanation esas olarak boyutuna göre belirlenir, makromoleküler CA dokular içinde çok daha uzun saklama süreleri gösterir. Eşit derecede önemli, büyük ölçüde elde edilen MR sinyal ve ölçüm kalitesinin iyileştirilmesi monomerik MR prob (örneğin, GdDOTA kompleks), bir artış lokal konsantrasyonunu bu maddeler sonuçlarının çok değerlilik.
Dendrimers MRG 4,5 için çok değerlikli CA'ların hazırlanması için en çok tercih edilen iskeleler arasındadır. iyi tanımlanmış boyutları ile bu yüksek ölçüde dallı makromoleküller yüzeyleri çeşitli birleştirme reaksiyonları yatkındır. Bu çalışmada, bir nesil 4 (G4) poli (amidoamin) GdDOTA benzeri şelatları (DCA) birleştirilmiş (tein) dendrimer oluşan MRG için bir dendrimeric CA hazırlanmasını, saflaştırma ve karakterizasyonu rapor. Bu reaktif DOTA türevinin sentezi ve tein dendrimer olan kuplaj tarif eder. Gd (III), standart fiziksel karakterizasyonu ile kompleks halinde süreçleDCA yeniden yapıldı. Son olarak, MR deneyler düşük molekül ağırlıklı bir CA elde edilenlere nazaran daha güçlü bir kontrast MR görüntüleri üretmek için DCA yeteneğini göstermek için yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DCA hazırlanması 1.
- Monomerik birimin 4 6 sentezi.
- 4- (4-nitrofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1-il 1,4,7,10-tetraazasiklododek) bütirik asit tert-bütil ester (2).
- ((4,7-bis-tert--butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) N -asetik asit tert-butil ester 1 (1.00 g, 1.94 mmol), N-dimetilformamid içinde çözülür DMF, 5 mi). 0.67 g, 4.86 mmol, 2.5 eşdeğer potasyum karbonat (ADD) ve 45 dakika için oda sıcaklığında karıştırın.
Not: makrosikl 1 Cyclen hazırlandı ve tert daha önce yayınlanmış prosedür 7'ye göre bromoasetat-butit. - Tert ekleme-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoat (0.87 g, 2.53 mmol, 1.3 eşdeğer.) Ilave 1 saat boyunca. t altında karıştırıldıktan devamAşağıdaki 18 saat aynı reaksiyon koşulları.
Not: Tert-bütil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoat daha önce yayınlanmış prosedür 8'e göre 4- (4-nitrofenil) -bütirik asit, tionil klorür ve bromin hazırlandı. - 40-60 ° C de 9 ampulden ampule vakumla damıtma yoluyla DMF çıkarın.
- Kahverengi şekilsiz bir katı (1.09 g,% 72), 10 olarak ürünü 2 elde etmek için kolon kromatografisiyle (silis jel,% 7 metanol / diklorometan) artığı arıtın.
- ((4,7-bis-tert--butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) N -asetik asit tert-butil ester 1 (1.00 g, 1.94 mmol), N-dimetilformamid içinde çözülür DMF, 5 mi). 0.67 g, 4.86 mmol, 2.5 eşdeğer potasyum karbonat (ADD) ve 45 dakika için oda sıcaklığında karıştırın.
- 4- (4-aminofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1-il 1,4,7,10-tetraazasiklododek) bütirik asit tert-bütil ester (3).
- Nitrobenzen türevinin 2 etanol (1.00 g, 1.28 mmol) (10 mi) ve metanol (150 ul) içinde 7 N amonyak solüsyonu içinde çözülür. soluti bir katalizör (Pd / C, 150 mg, ağırlıkça% 15) halinde aktive edilmiş karbon üzerinde palladyumüzerinde.
- Parr hidrojenatörü tertibatında bir hidrojen atmosferi (2.5 bar) altında 16 saat heterojen bir karışım çalkalanır.
- etanol içinde süspansiyon haline getirildikten sonra sinterlenmiş cam huni üzerinden süspansiyon filtre edilerek bir silisli toprak bir pasta hazırlayın. süzme ile Pd / C katalizörü çıkarmak için hazırlanmış pasta üzerinde 1.1.2.2 gelen süspansiyon dökün.
- Kahverengi şekilsiz bir katı (0.91 g,% 95) halinde bileşik 3 elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı (su banyo sıcaklığı ~ 40 ° C) hafif damıtma ile ayrılması için kullanılabilir.
- 4- (4-izotiosiyanatofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazasiklododek-1-il) bütirik asit tert-bütil ester (4).
- Bir 3 karışımına (0.91 g, 1.22 mmol) ve trietilamin diklorometan (0.685 ml, 4.87 mmol, 4 eşi.) (15 mi) (0.124 ml, 1.58 mmol, 1.3 eşdeğer.) tiofosgen ekleyin.
- Şiddetle reaksiyon mil karıştırın16 saat oda sıcaklığında, bir manyetik karıştırıcı ile karışımlarına.
- Bir döner buharlaştırıcı (su banyo sıcaklığı ~ 40 ° C) hafif damıtma ile çözücünün çıkarın ve daha sonra katı, amorf açık kahverengi olarak ürünü elde etmek üzere 4 kolon kromatografisiyle (silis jel,% 5 metanol / diklorometan) Ham ürünün arıtılması (0.51 g,% 53).
- 4- (4-nitrofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1-il 1,4,7,10-tetraazasiklododek) bütirik asit tert-bütil ester (2).
- Dendrimer DCA sentezi.
- Dendrimer 5 sentezi.
- (40 ° C su banyosu sıcaklığında ~), bir döner buharlaştırıcı üzerinde damıtma ile yumuşak bir metanol buharlaştırılması, G4-tein dendrimer (667 mg, metanol içinde% 10 dendrimer çözeltisi, 4.67 umol), alın ve DMF içinde bir tortu çözülür (4 mi) .
- (. 0.105 ml, 0.75 mmol, 160 eşdeğer) Trietilamin 60 ° C'de 45 dakika süre ile karıştırıldı, ve ek izotiyosiyanat 4 (354 mg, 0.45 mmol, 1.5 eşdeğ. Dendrimer amino yüzey gruplarına göre), kısımlar halinde over, 1 saat.
- 48 saat boyunca 45 ° C'de bir manyetik karıştırıcı, reaksiyon karışımı karıştırılır.
- 40-60 ° C de, bulb-to-bulb vakumla damıtma yoluyla ayrılması için kullanılabilir.
- elüent olarak bir lipofilik jel filtrasyon ortamı ve metanol kullanılarak boyut dışlama kromatografisiyle artığı arıtın. Sütunu paketi basınç uygulanarak oda sıcaklığında (> tozu 1 gramı başına 4 ml metanol) en az 3 saat boyunca metanol içerisinde süzme ortamı şişirmek için. 1 ml'lik fraksiyonlar toplayarak yerçekimi ayrımı gerçekleştirin.
- ince tabaka kromatografisi (TLC) ile toplanan fraksiyonları analiz edin. (Sadece temel hattı üzerinde yer alan en polar Noktası dendrimeric ürün elde edilir),% 15 metanol / diklorometan içinde TLC plakası geliştirmek. Ürün 5 (270 mg,% 91) elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı (su banyosu sıcaklığı ~ 40 ° C) hafif damıtma yoluyla toplanan fraksiyonları buharlaştınn.
- Dendrimer sentezi
- Formik asit (5 mi) içinde korunan dendrimeric şelatör 5 (270 mg, 4.23 mmol) çözülür ve 24 saat boyunca 60 ° C'de karıştırın.
- Bir döner buharlaştırıcı (~ 15 mbar basıncı, su banyosu sıcaklığı ~ 40 ° C) damıtılarak formik asit buharlaştırılmakta ve 6 elde etmek üzere ürün dondurularak kurutmak (basınç ~ 0.2 mbar) 9.
- Dendrimer 5 sentezi.
- Dendrimeric kontrast maddesinin sentezi (DCA)
- Suda dendrimeric şelatör 6 (4.35 umol) çözülür ve 0.1 M sodyum hidroksit ile 7.0'a pH ayarlamak.
- Su (1 mi) içinde GdCl 3 · 6H 2 O (113 mg, 304 umol) içinde çözülür ve 4 saat arasında bir süre boyunca kenetleme 6 çözeltisine damla damla ekleyin; pH metre ile pH ölçümü ile sulu sodyum hidroksit çözeltisi (0.05 M) ile pH 7.0 muhafaza.
- Oda t manyetik bir karıştırıcı ile kanştınn24 saat emperature.
- Gd fazlasının ayrılması için 4 saat boyunca çözeltiye kısım kısım olacak etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 158 mg, 426 umol) ilave edin (III), sulu sodyum hidroksit çözeltisi (0.05 M) ile pH 7.0 tutulur. 24 saat oda sıcaklığında karıştırın.
- GdEDTA çoğunluğu ve EDTA fazlasının ayrılması için boyut dışlama kromatografisi gerçekleştirin. kolon paketi için suda şişmiş bir hidrofilik jel filtrasyon ortamı kullanın. Uygun bir hacme karışımı azaltmak ve sütun yükleyin. basınç uygulamadan deiyonize su ile sütun yıkayın.
- GdEDTA ve EDTA kalıntılarını uzaklaştırmak için merkezkaç kuvveti 1800 x g'de 30 dakika süre ile 3 kDa'lık santrifüj filtre ünitesi kullanılarak örnek santrifüjleyin. Süzüntü EDTA ve GdEDTA yokluğunu gösterir kadar bu adımı (yaklaşık beş kez) tekrarlayın. Nihai DCA olarak grimsi beyaz bir ürün elde etmek için, bir şişe içine örnek aktarın buharlaştırılmak ve daha sonra çözücü, dondurularak kurumaya (186 mg,% 71).
NOT: ESI-MS aracılığı ile EDTA ve GdEDTA olmadığını kontrol edin. - xylenol turuncu testi kullanılarak serbest iyon olarak Gd (III) yokluğunu onaylayın. bir asetat tampon çözeltisi (pH 5.8) 'de süzüntü (0.5 mi) içinde çözülür. Bir ksilenol turuncu çözelti bir kaç damla ilave edin ve renk değişikliği parça 11 (sarı veya mor renkli yokluğunun ya da serbest Gd (III) 'ün, sırasıyla iyonlar, varlığını gösterir).
Dendrimeric Ürünlerin 2. in vitro karakterizasyonu
- (DOTA benzeri makrosikllerin ile dendrimer yükleme) tein dendrimer bağlanmış makrosiklik DOTA-birim sayısı tahmini
- 1H NMR (- nükleer manyetik rezonans spektroskopisi NMR) ile Tahmini.
NOT: Bu prosedür dendrimerler 5. ve 6. mümkündür, ancak DCA üzerinde.- 1H NMR Spektrum 12 kaydeder.
- Sırasıyla dendrimerler 5 ve 6 ya da sadece bir alifatik bölge aromatik bölge ve iki ayrı alifatik bölgeleri (t-Bu grupların 2. sinyalleri alifatik dendrimere ve makrosiklik protonlar 1. sinyaller) entegre edin.
Not: hidroliz beri alifatik bölge dendrimer 6 t-Bu gruplardan kaynaklanan hiçbir ayrı bir sinyal yok. - Denk kullanın. 1 ya da Denk. 2R integrallerinin oranı = makrosiklik birimlerinin sayısı (n) tahmin etmek için (Denklem. 1 ya da alifatik-dendrimer aromatik alifatik / / alifatik- Denklem t-Bu. 2), H dend = proton sayısı dendrimer olarak, H Ar aromatik proton sayısı, H t Bu t-Bu gruplarda protonların sayısı = = ve H mac tek Makrosiklde proton sayısını =.
Not: Ya Denk. 1 ya da Denk. 2 fo kullanılabilirr dendrimer 5, sadece denklem iken. 1 dendrimer 6 için de kullanılabilir. Değiştirilebilir protonlar (aminler, amidler, tiyo-üre veya karboksilatlar üzerinde), genellikle döteryum değiştirilmektedir olduğundan, hesaplamalarda kabul edilmemiştir. Burada, lH dend (5 için) = 1.128 ya da 1.000 (6), H Ar = 4 ve H Mac = 27 kullanılmıştır.
(1) 
(2)
- sülfür, nitrojen oranı kullanılarak elementel analiz tahmini.
- Katı dendrimeric örnek (bu çalışmada DCA) üzerine element analizi yapın.
- Denk kullanın. 3 R belirlenen% N ve% S, N veya S dend dend oranını = makrosiklik birimlerinin sayısını (n) = sayısını tahmin etmekAzot ya da dendrimer kükürt atomu ve N yağmurluk ya da MAC bir makrosiklik biriminde nitrojen veya sülfür atomu sayısı =.
Not: faktörü 2.29 sülfür ve nitrojen atom kitlelerinde oranı elde edilir. Bu çalışmada, K dend = 250, S dend = 2, K Mac = 5, ve MAC = 1 kullanılmıştır.
(3)
- uçuş matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi (MALDI-TOF) ile tahmin edilmesi.
- -TOF MS analizi 13 gerçekleştirin.
- Eşitliğine göre makrosiklik birimlerinin sayısı (n) hesaplanması. M z = gözlenen KÜTLE (m / z), Z = türlerin yük, E dend = dendrimeric bölümünün kütlesi ve M, Mac bir makrosiklik birim kütle = 4.
YOK HAYIRTE: M dend = 14.306 ve M mac = 719 Bu çalışmada kullanılmıştır.
(4)
- 1H NMR (- nükleer manyetik rezonans spektroskopisi NMR) ile Tahmini.
- DCA konsantrasyonu ([DCA]) belirlenmesi: Dökme manyetik duyarlılık ölçümü (BMS)
- plastik bir şişe borusu ([DCA] ~ 5-10 mM) 'de, su (360 ul) DCA (5-10 mg) çözündürülür.
Not: [DCA] δ = 4.7 ppm su rezonans ile> 15 mm numune konsantrasyonlarda t BuOH rezonansları olası çakışmasını önlemek için 5-10 mm aralığı içinde olması gerekmektedir. - DCA sulu çözeltisine (1 h / h 2) ve bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak elde edilen solüsyon (420 ul) karışımı t-BuOH karışımı: D 2 O 60 ul ekle.
- Deney tüpüne H2O karışımı (10:90 h / h) bir dış NMR tüpü içine transferi örnek 400 ul ve koaksiyal NMR ek tüp yerleştirmek, t-BuOH birlikte.
- Kayıt1H NMR spektrumu, ve iç ve dış NMR borular (referans) 12 BuOH t kaynaklanan rezonans sinyalleri arasındaki frekans kayması ölçümü.
- Denk kullanın. 5 T mutlak sıcaklık = [DCA] belirlemek için, Δχ, kaydedilen vardiya = Gd (III) 14 ve s = sabit bağımlı bir lantanid iyon için eff = etkin manyetik moment (μ eff = 7.94 mikron numunenin şekli ve manyetik alan (sırası ile, 0, 1/3 ve manyetik alana dik bir küre, silindir paralel ve silindir halinde 1/6) içindeki konumuna bağlı.
Not: BuOH solüsyonu (60 ul) t [DCA] elde hesaplanan değer nedeniyle D 2 O ilave orijinal konsantrasyona düzeltilmelidir.
(5)
- plastik bir şişe borusu ([DCA] ~ 5-10 mM) 'de, su (360 ul) DCA (5-10 mg) çözündürülür.
- dinamik ışıksaçılımı (DLS) ölçümleri.
- Bir filtre DCA çözeltisi hazırlayın (0.2 um politetrafloretilen / PTFE filtresi, Gd başına 0.75 mm (III)), 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu (25 mM, pH 7.4) ve içine aktarmak DLS ölçümleri için küvette.
- DLS aparatı içine küvet yerleştirin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: kayıt 30 saniye önce taramalar arasında ve sıcaklık dengeleme ile gecikme olmadan 15 taramaları (1 tarama = 12 sn, kırılma indeksi = 1.345, soğurma =% 1) 5 tekrarlar .
- elde edilen verileri verme ve boyut (hidrodinamik çap) 'in bir fonksiyonu olarak nüfus (%) konulması sureti ile boyut dağılımı histogram elde edin.
- Uzunlamasına ve enine relaksivitelerine ölçümü.
NOT: benzer bir prosedür zaten gevşeme zamanı analizörü 15 kullanılarak tarif edilmiştir; Bu prosedür, Topspinli bir 300 MHz NMR spektrometre kullanılarak gerçekleştirildiyazılım.- H DCA çözeltiler 2 O kümesi hazırlanması: D 2 O (500 ul,% 10 D 2 O, H2O içinde, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, ve 5.0 mM [HEPES ] DCA stok örneğinden = 25 mM) () bölüm 2.2'ye bakınız.
- bir NMR tüpe çözeltinin 450 ul aktarın ve enstrüman içine yerleştirin.
- Satın alma parametrelerini optimize ve daha sonra T gerçekleştirmek inversiyon kurtarma (IR) ve Araç-Purcell-Meiboom-Gill kullanarak 1 ve T 2 deneyler (CPMG (90 ° uyarım darbe süresi (p1), ve ışınlama frekansı (O 1) ofset) ) darbe dizileri, sırasıyla.
- T1 ve T2 gevşeme sürelerine belirlenmesi.
- Kaydedilen ölçüm, işlemini F2 boyutta 2D spektrumu seçin ve interaktif faz düzeltme gerçekleştirin.
- Analiz / T uygun dilim (maksimum yoğunlukta zirve) seçin
- T 1 ve T 2 gevşeme süreleri elde etmek için uygun montaj işlevini (IR ve CPMG deneyler için invrec veya uxnmrt2, sırasıyla) seçin.
- tüm [DCA] Kalan çözümler için adımları yineleyin 2.4.4.2-2.4.4.4.
- Elde edilen T 1 değerlerinden gevşeme oranları (R1 ve R2) hesaplayın (R 1,2 = 1 / T 1,2).
- Konu R1 ve R2 (sn-1) mm olarak Gd (III) konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak.
- Denk tanımlandığı gibidir, uydurulmuş çizginin eğiminden, boyuna ve enine relaksivitelerine, R1 ve R2 eşittir (mm-1 sn-1) belirler. 6, burada R i, gözlenen = boyuna (i = 1) veya enine (i = 2) diyamanyetik gevşeme oranıDeneyde kullanılan para-manyetik türlerin ve yokluğunda [Gd] = Gd (III) konsantrasyonu su.
(6)
(1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) In Vitro MR 3.; DCA ve GdDOTA Karşılaştırılması
- Tüp hayaletler hazırlanması
- kontrast ajanlarının konsantrasyonu hesaplanır iki deney seti için DCA (4 x 350 ul) ve GdDOTA (4 x 350 ul) ve su örneklerinin (4 x 350 ul) sulu çözeltileri hazırlanması: (3.1.1.1) ortalama Gd (III) ya da molekül başına (3.1.1.2).
- İki DCA örnekleri ve iki GdDOTA hazırlanması sırasıyla, Gd 0.5 ve 1.0 mM (III) 'in konsantrasyonu ile örnekler. Ayrıca, (kontrol tüpleri gibi) iki su numuneleri hazırlamak.
- İki DCA örnekleri (2.5 ve Gd (III) ya da 0.05 başına 5.0 mM ve dendrimeric molekül başına 0.1 mM), iki GdDOTA örnekleri (0.25, 0.5 mM) ve iki adet su numunesi hazırlanması (control borular).
NOT: Uygun DCA ve GdDOTA konsantrasyonları BMS yöntemi ile belirlenen konsantrasyonlarda ilgili stok örnekleri seyreltilmesi ile hazırlanmalıdır HEPES tamponu (pH 7.4) ile (bölüm 2.2). Hesaplamaları kolaylaştırmak için n = 50 dendrimer molekül başına makrosiklik birimlerinin ortalama sayısı için varsayılmıştır. Bu nedenle, DCA oranı: bir molekül bazında hesaplandığında 5: GdDOTA 1 idi.
- çözelti içinde hava kabarcıklarının varlığı kaçınarak 300 ul plastik şişe tüplerde numuneler.
NOT: Plastik şişe tüplerin boyutu kullanılan radyofrekans bobin tipine ve büyüklüğüne bağlıdır (burada, hacim bobini ile bir örnek verilmiştir). - , Bir şırınga (60 ml hacim) içindeki örnekleri yerleştirin 1 mM GdDOTA ile doldurun çözüm ve tarayıcıya yerleştirin.
Not: Örnekler manyetik alan s duyarlılık etkisi (varyasyonları önlemek için GdDOTA sulu bir çözeltiye yerleştirilmişFarklı manyetik duyarlılık maddeler arasındaki yakın arayüzler) meydana trength.
- kontrast ajanlarının konsantrasyonu hesaplanır iki deney seti için DCA (4 x 350 ul) ve GdDOTA (4 x 350 ul) ve su örneklerinin (4 x 350 ul) sulu çözeltileri hazırlanması: (3.1.1.1) ortalama Gd (III) ya da molekül başına (3.1.1.2).
- Parametre optimizasyonu ve görüntüleme.
- mıknatısın İzomerkez örnekler ile şırınga konumlandırmak için anatomik tarama (Localizer / Tripilot) kullanın.
- Bütün hacim, merkezi frekans (O 1), alıcı kazancı (RG), ve iletim kazancı (TX0 ve TX1) ve (manyetik alan homojenliği ayarı) shimming için ayarlamalar yapmak için trafik ışığı (ayar taraması) tuşuna basın.
- T 1 -ağırlıklı (T 1w) görüntüleme için, hızlı, düşük açılı çekim (FLASH) yöntemini seçin.
- Localizer tarama kullanarak tarayıcı (yatay şırınga) dikey olarak yerleştirilmiş numuneler için koronal dilim seçin.
- Denk kullanın. Kontrast-gürültü (CNR) Satın alma optimizasyonu için 7 α = çevirme açısı, TE eko zamanı = 16, parametreler, TR =tekrar süresi, ve T, 1, A, T, 1 B T 1 örnek A kez (t, 1 A) ve Numune B = (t, 1 b) için CNR maksimize edilmelidir (aynı için geçerlidir T 2 kez: T 2, A ve T 2, B).
NOT: TE, TC, ve α CNR optimizasyon hesaplama elde edilmelidir ise T 1 ve T 2 gevşeme süreleri, boyuna ve enine relaksivitelerine (bölüm 2.4) ölçümlerinden elde edilen değerlere ayarlanması gerekir.
(7) - Önceki adımda (3.2.5) 'de elde edilen parametreler kullanılarak görüntü elde edin.
- Sinyal-gürültü oranı (SNR) hesaplayın.
- Görüntü ekranı ve işleme içine kazanılmış T 1w görüntü (tarama) yükleyinPencere ve faiz (ROI) bölgesini tanımlar tıklayın.
- dairesel ROI seçin ve örnek konumu ve arka planda çizin. Daha sonra, ortalama sinyal genliği (S sinyali) ve arka plan (S gürültüsü) standart sapmasını elde etmek için ekranda tıklayın.
- DCA, GdDOTA ve su numuneleri için yineleyin 3.2.7.2.
- Formülü kullanarak SNR hesaplayın: SNR = S sinyal / S gürültü.
- Biraz değiştirilmiş bir prosedür izlenerek, gevşeme geliştirme (NADİR) yöntemi ile hızlı edinimi ile T 2 -ağırlıklı (T 2w) görüntüleme gerçekleştirmek. CNR edinme parametrelerinin optimizasyonu için, Denk kullanın. 8.
(8)
(7) 
(8) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DCA hazırlanması iki aşamadan oluşmaktadır: 1) monomerik DOTA tipi tuzunun sentezi (Şekil 1) ve G4 tein dendrimer ve karmaşık dendrimeric Gd (III) daha sonra hazırlanması kenetleyici 2) bağlantı elemanı (Şekil 2) . İlk aşamada, dört karboksilik asitler ihtiva eden bir Cyclen tabanlı DOTA tipi şelatlayıcı olabilir ve başka bir sentetik modifikasyon için uygun olan bir dik grup elde edilmiştir. Tert-butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoat 8 ile alkile edildi 1 (DO3A- tert-butil ester) 7'den başlayan hazırlanması, 2 DOTA-türevi elde edildi. Paladyum katalizli hidrojenasyon anilin 3 vermek üzere, 2 aromatik nitro grubunun azaltmıştır. Tiyofosgen ile 3 dönüşüm izotiosiyanat 4 sonuçlandı, yüklenebileceğiniH geçerli dendrimeric bir CA 17 hazırlanması için bir amin-reaktif madde olarak kullanıldı.
Takip eden aşamada, makrosikl 4 ticari olarak temin edilebilir G4 tein dendrimer bir birleştirme reaksiyonunda temel monomer birimi olarak kullanılmıştır. Dendrimer amin yüzey grubundan, bir baz mevcudiyetinde monomer 4 izotiyosiyanat grubu ile reaksiyona girer. 4 aşırı yıkama sıvısı olarak metanol ile, bir lipofilik jel filtrasyon ortamı kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile uzaklaştırılmıştır. Elde edilen dendrimer makrosiklik konjügat, 5-tert-butil esterler daha sonra liyofilize edildi ve saflaştırılmadan bir sonraki aşamada kullanıldı 6 verecek şekilde formik asit ile hidrolize edilmiştir. DOTA-tipi makrosikllerin kompleksleri Gd (III) oluşumu, bir sulu çözelti o'e GdCl 3 · 6H 2 O eklenerek gerçekleştirilmiştirGd yaklaşık 7 fazla (III) pH'ın muhafaza ortak kenetleyici etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile kompleks hale ise F 6. GdEDTA karmaşık ve aşırı EDTA, yıkama sıvısı olarak su ile bir hidrofilik jel filtrasyon ortamı kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile sistemden çıkarılmıştır. Geri kalan küçük boyutlu katışkılar 3 kDa santrifüj filtrasyon birimi kullanılarak santrifüjleme ile çözeltiden uzaklaştırılmıştır.
Dendrimer-makrosaykıl konjugatlarının sentezi sonra kombine Analitik yaklaşım ürünleri karakterize etmek için kullanılmıştır. 5 ve 6 yüzey-amin doluluk belirlemek için, 1H NMR spektrumları, analiz edilmiştir. Sonuçlar karşılaştırıldığında ve makrosikllerin ile dendrimer yükleme element analizi ve MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tahmin edilmiştir nihai ürünün (DCA), (Şekil teyit edilmiştir3). Bu üç yöntem bir kombinasyonu ~% 75 amin yüzey grubu doluluk gelen G4 dendrimer, konjüge olan 49 makrosiklik birimleri ortalama ile sonuçlanmıştır.
Dendrimeric kompleksin daha fazla karakterizasyonu -1 6.2 ± 0.1 mM sonuçlanan sn -1 Gd (III) başına (ya da kabaca yaklaşık 300 mM -1 sn -1 dendrimer başına) uzunlamasına relaksivite ve 30.5 ± için, Relaksivite değerlerinin belirlenmesi dahil 0.6 mm -1 sn -1 enine relaksivite için Gd (III) (neredeyse 1.500 mm -1 sn -1 dendrimer başına) başına. DLS ölçümleri DCA (Şekil 4) 7.2 ± 0.2 nm hidrodinamik çapı gösterdi.
Son olarak, dendrimeric MRG kontrast madde etkisini göstermek için, MR DCA ve kliniği ile hayaletler iki set üzerinde yapıldıKarşılaştırma için ticari olarak temin edilebilen GdDOTA (Şekil 5). İkinci grup, sırasıyla, dendrimeric ve monomerik kontrast ajanlarının kıyaslanabilir bir moleküle konsantrasyonlarda bir etki göstermek için tasarlanmış ise hayaletler ilk kümesi, aynı Gd (III) 'konsantrasyonlarda iki kontrast maddeleri karşılaştırmak amacıyla hazırlanmıştır.
Şekil 1: makrosiklik DOTA tipi kenetleyici 4. Reaktifler, koşullar ve izole edilmiş verimi sentezi: (i) tert-butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoat, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C 16 saat,% 72; (ii) H2, Pd / C, EtOH, oda sıcaklığı, 16 saat,% 95; (iii) CsCl 2, Et3N, RT, 2 saat,% 53. Bu fi büyük halini görmek için tıklayınız şekil.
Şekil 2: dendrimeric MRT-kontrast maddesi DCA Tepkime maddeleri ve koşullar sentezi: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 saat,% 91;. (Ii) formik asit, 60 ° C, 24 saat, kant; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7.0, RT, 24 saat,% 71. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. MALDI-TOF kütle spektrometri ile dendrimeric ürünün karakterizasyonu tipik bir MALDI-TOF kütle spektrumu DCA için elde edilmiştir.rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:.. Karakterizasyonu dinamik ışık saçılımı (DLS) DCA (HEPES, pH 7.4) DLS ölçümü yoluyla dendrimeric ürünün bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: 7 t manyetik alan tüp fantom in vitro MR deneyleri DCA ve GdDOTA (a, b) T 1 -ağırlıklı ve (c, d) r 2 -ağırlıklı MR.. Her bir MRI deney gerçekleştirildi Kontrast madde iki farklı konsantrasyonları (a, c) benzer Gd (III) konsantrasyonu (HEPES, pH 7.4); 1 GdDOTA konsantrasyon oranının: a DCA (b, d); 5 (HEPES, pH 7.4). konsantrasyon, molekül başına ifade edilir ve SNR değerleri parantez içinde gösterilir. Görüş alanı (FOV) = 40 x 40 mm2, kesit kalınlığı = 0,5 mm, uyarımları (NEX) = 30 sayısı,: Bu deneylerde kullanılan parametrelerdir (A) matris boyutu (MTX) = 256 x 256, tekrarlama zamanı (TR) = 100 msn, eko zamanı (TE) = 2.95 msn, kapak açısı (FA) 90 °, satın alma zamanı (TA) = 12 dk 48 sn = ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2.95 msn, FA = 90 °, TA = 2 dak 34 sn; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10,000 / 130 msn, Nadir faktör (RF) = 16, TA = 26 dak 40 sn; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10,000 / 100 msn, RF = 16, TA = 26 dak 40 sn.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendrimeric MRT-kontrast maddesinin hazırlanması monomerik birimin uygun seçimi gerektirir (örneğin, GD şelatör (III)). Bu paramanyetik iyonun toksisitesini azaltmak ve bugüne kadar, asiklik çeşitli ve makrosiklik kenetleme maddeleri bu amaca 1-3 karşılık vermektedir. Bunlar arasında, makrosiklik DOTA tip kıskaçlar yüksek termodinamik kararlılık ve kinetik hareketsizlik sahip ve bu nedenle, eylemsiz bir MRT-kontrast maddesinin 1,18 hazırlanması için en çok tercih edilen bir seçimdir. Hala (III) 'ün 19 kompleksleri stabil Gd oluştururken Ayrıca, sahip çeşitli fonksiyonel moleküllerine bağlama iki fonksiyonlu chelators neden çeşitli sentetik dönüşümler, (örneğin, hedef vektörleri veya nano-taşıyıcı) yatkındır. Bu amaçla, bu prosedürde açıklanan DOTA-tipi, monomerik birim DO3A- tert-butil ester, yaygın ve kolayca temin edilebilir haberci ve bromür türevi hazırlandı4- (4-nitrofenil) bütanoik asit. Bu molekül DOTA türetilen ve GD koordinat benzer bir yapıya sahip olan (III). Sentetik değişiklik, çeşitli fonksiyonel moleküllerin ve taşıyıcılara tepkileri bağlanması için bu şelatör eğilimli hale getirmeyi hedefliyor. Yani, bir kıskaç içerisinde DOTA-değiştirilmiş molekül sonuçlarının hazırlanması de Gd koordinasyon için kullanılabilen dört karboksilik grup olan (III) bileşiminin nötr bir karmaşık ve dönüştürme üzerine dendrimer yüzeyine Bu şelatör bağlayan bir dikey nitrofenil grubu oluşturulması. Bu prosedür, aynı zamanda dik reaktif grup seçiminde esnekliğe izin verir (örneğin, NH2 ya da COOH) tercih edilen bir şekilde, arzu edilen bir taşıyıcıya birleştirmek Gd (III) şelatör hizmet edebilir.
Elde edilen iki fonksiyonlu kenetleyici iki farklı şekilde (yani, sentetik prosedürler) diğer moleküllere bağlanabilir. nitro grubu bir amino grubuna indirgenir, sonuçta ortaya çıkan anilin altında olabilirbaşka moleküle, 8 karboksilik asit grubuna sahip bir yoğunlaştırma reaksiyonu gidin. Ayrıca, tiofosjen mevcudiyetinde Aromatik bir primer amin fonksiyonel grubunun kolayca izotiyosiyanat, hali hazırda dendrimerler 17 monomerik birimlerin bağlanması için daha fazla reaksiyon olanakları sunan polar organik çözücüler hem su içinde aminler ile reaksiyona giren bir grubu dönüştürülebilir , 20,21.
dendrimeric taşıyıcıya çift işlevli çelatör bağlanması için, uygun bir dendrimeric skafold seçilmelidir. Nihai dendrimer eşlenik yapısı ve istenen uygulama ile ilgili çeşitli faktörler bu adımda göz önüne alınmalıdır. Nedeniyle dendrimeric taşıyıcıların yaygın olan bir ticari durumu için, farklı çekirdek yapıları, yüzey-reaktif grupları veya kuşak ürün seçilebilir. ise Sonuç olarak, konjügasyon reaksiyonu, dendrimer ile kenetleyici arasında dik grup yüzey grubuna bağlıdırSon eşlenik ücret, nötr, ya da 22 (dendrimer nesil bağlı olarak 15-20 nm kadar) farklı boyutlarda olabilir. Onlar çözünürlük, Relaksivite (MRG sinyal geliştirme), difüzyon ve potansiyel MRG uygulanmasını tehlikeye sokabilir kontrast madde, diğer farmakokinetik özelliklerini etkileyebilir çünkü tüm bu yönleriyle, önceki dendrimeric CA hazırlarken dikkate alınmalıdır. Örneğin, katyonik dendrimerler biyolojik sistemlerde toksisite sergiler. Bununla birlikte bu etki, böylece genel pozitif yük 23 indirgeme, dendrimer yüzeyinde negatif yüklü grupların konjugasyon ile azaltılabilir.
Bu protokol, tek moleküllü makrosiklin 4 izotiyosiyanat grubu 64 primer amin yüzey grupları ile donatılmış bir ticari sistamin çekirdekli G4 tein bağlanmış edildiği prosedür kullanılarak DCA dendrimeric kontrast ajanı hazırladık. hydroph başlangıç saflaştırmasinyal dizisi dendrimeric ürün, 5 reaksiyona girmemiş monomer birimlerinin en çıkarılması için, yıkama sıvısı olarak bir lipofilik jel filtrasyon ortamı ve metanol ile bir kolon kullanılarak jel kromatografisi ile gerçekleştirilmiştir. Formik asit ile t-butil esterlerin hidrolizi bir hidrofilik jel filtrasyon ortamı kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılabilir suda çözünür dendrimeric ürün elde basittir. Gd (III) multimerik ve dendrimeric kenetleme kompleks kompleks oluşumunu kolaylaştırmak için bir nötr pH'de çözeltisi muhafaza etmek sureti ile yapılmıştır. Aksi takdirde, (klorür tuzu olarak eklenmiştir) Gd kompleks (III) reaksiyonu yavaşlatarak, pH'ı düşürür. Son olarak, ama sadece DOTA birimleri ile şelatlı edilemedi fazlası ile dendrimer çekirdeğindeki amin grupları da Gd (III) ile koordine etmek eğiliminde olduğunu fazlalaştı. DOTA kenetleme dışında Gd (III) varlığını kaçınmak le için, gereklidirCA Gd (III) 'akage istenmeyen etkilere sahip olabilir; yani, bu, in vivo 18 toksisite indükleyebilir. aşırı Gd (III) etkin bir şekilde GdEDTA ultrafiltrasyonu 3 kDa molekül ağırlıklı bir kesim (MWCO) filtreleri kullanılarak serbest EDTA, ardından EDTA ile kompleks ile çıkarılabilir. dendrimeric birleşikleri düşük moleküler ağırlığa sahip olduğunda daha düşük bir MWCO filtresi kullanılabilir.
DCA hazırlanması ile ilgili iki önemli sorun giderme sorunları vardır. Nedeniyle NMR sinyallerinin Gd (III) 'ün büyük genişleme etkisine NMR spektroskopi ile DCA analizi bilgi sağlamamaktadır. Bunun yerine, bu analiz, önceki adımda (bileşikler 5 ve 6) yapılmalıdır. Daha sonra, dendrimer yüzeyine monomacrocyclic birimlerinin konjugasyonu% 100 dönüşüm ile gerçekleştirilir hiçbir zaman, ancak (aşağıya bakınız)% 50-90 arasında olması muhtemeldir. Tipik haliyle, reaksiyon verimlerinin monomeri bir ikinci kısmı ilave edilerek artırılabilirDendrimer ve monomerik birimin ilk konjugasyondan sonra C-reaktif birimi 24 tamamlanır. Bununla birlikte, aynı dendrimer ve DOTA birimleri birleştirmek için malzeme olarak kullanıldığı zaman bile dendrimer yüzeyi üzerinde eşlenik kenetleme arasında biraz farklı ortalama sayılar her preparat toplu sonuçları. DCA mevcut Gd (III) nihai miktarı BMS yöntemi ile bağımsız belirlenebilir rağmen dendrimeric konjugatların daha iyi karakterizasyonu için, (bölüm 2.2), her zaman yeni bir parti bağlı monomer birimlerinin tahmin gerçekleştirmek için gerekli olan DCA (aşağıda 2.1 ve tartışmaya bakınız) hazırlanır.
İzole dendrimeric ürünlerin Analitik Karakterizasyonu, element analizi ve MALDI-TOF MS (sadece ürün 5 ve 6: 1) 'H NMR spektroskopisi ile gerçekleştirilebilir. amino yüzey gruplarına dönüştürülmesi için tipik verimler dendrimer Generati bağlı olarak% 50-90 arasında olmalıdırkenetleyici tipine ve kullanılan reaksiyon şartları (solvent ve sıcaklık) 6,20,24,25 ilgilidir. Bu özel durumda, birleştirilen analizlerden elde edilen hesaplanan kütleler dendrimer bağlanmış olan 49 monomerik şelatların ortalama karşılık gelmektedir (yani, ~ dendrimer yüzeyi aminlerin% 75 doluluk). Reaksiyona amino gruplarının nihai sayısında hafif bir uyumsuzluk, bu yöntemler 25 ila beklense de, bunların doğrudan karşılaştırması bağlı kenetleme birimleri, belirli bir ortalama sayısına istenen DCA oluşumu için uygun bir kanıt sağlar.
MR deneylerinde kontrastı geliştirmek için DCA potansiyelini değerlendirmek amacıyla in vitro karakterizasyonu DLS, relaxometric ve MR deneyler oluşuyordu. DCA hidrodinamik çapı, bu tür önceden rapor eşlenikleri ile uyum içinde olan DLS ölçümleri ile 7.2 ± 0.2 nM, olduğu belirlendiG4 nesil 4 tein 26 dendrimerlerin. DCA boyuna relaksivite belirlenmesi, daha önce açıklanan prosedürü 15 takip ve 6.2 ± 0.1 mM -1 saniye -1 Gd (III) başına değeri ortaya koymuştur. Benzer tipte (örneğin, GdDOTA) küçük boyutlu moleküllerin DCA göreceli olarak para-manyetik Gd (III) 'r 1' de geliştirme yaklaşık% 50 dendrimeric kontrast maddesinin ara ürün boyutu ile açıklanabilir. Yani, dendrimer yüzeye bağlı Gd-çelatlann indirgenmiş hareket, dönme korelasyon zaman artar ve bu nedenle, r 1 'dir; Bu etki yine de küçük nano-boyutlu maddeler için yüksek manyetik alanlar da gözlenebilir. Aksi takdirde, dönme korelasyon zamanındaki artış baskın düşük manyetik alanlar 27 at r 1 artmasına katkıda bulunmaktadır. Diğer taraftan, dendrimeric kontrast ajanının boyut enine iliflkilerimiz üzerinde belirgin bir etkisi vardı30.5 ± 0.6 mm-1 sn-1 değerinde elde xivity 28 Gd başına (III). Özetle, DCA in vitro değerlendirilmesi için yöntemler basittir ve sadece dikkatli bir örnek hazırlık gerektirir, bu nedenle veri edinme ve sonuçları analiz ederken hiçbir zorluk bekleniyor.
dendrimeric kontrast madde ve görüntü kontrastını etkilemez için elinden performansını göstermek için, yeni hazırlanan kontrast madde DCA tüp hayaletler üzerine MR deneyleri yaptık. Ayrıca, bir kontrol olarak, su ile bir karşılaştırma ve tüpler gibi, ticari olarak temin edilebilir ve klinik olarak onaylanmıştır MRT-kontrast maddesi, GdDOTA bir çözelti kullanılır. Eşit Gd (III) 'ün konsantrasyonu kullanılmıştır MRI deney -ağırlıklı ilk T 1' de (0.5 veya 1 Gd mM (III) DCA ya GdDOTA olarak), DCA tüpler SNR daha önce% 12 daha yüksek bir bağlı kadar oldu GdDOTA göre DCA uzunlamasına relaksivite yaklaşık% 50 oranında bir artış (FŞEKIL 5A). İkinci T 1 -ağırlıklı MRG deney konsantrasyonları molekül başına hesaplandı DCA etkisini göstermek için tasarlanmıştır. 5 kat daha az DCA GdDOTA göre uygulandı, ancak (50 genel 250 uM ve 100 genel 500 uM DCA sırasıyla GdDOTA, genel), kontrast önemli bir artış ile sonuçlanmıştır (III) 'Gd olan DCA yüksek yükleme, bu da DCA ile doldurulmuş fantom tüplere en az üç kat daha yüksek gözlenen SNR değerleri elde edilmiştir. Beklendiği gibi, T de 2 -ağırlıklı MRI deney DCA ve GdDOTA dolu fantom borular arasındaki SNR büyük (3-20 kez) farklılıklar göstermiştir.
Sonuç olarak, bu protokol, küçük boyutlu bir CA ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş özelliklere sahip DCA sağlamak için bilinen sentetik prosedürler kullanılarak bir MRI dendrimeric CA uygun bir hazırlanmasını tarif etmektedir. karşılaştırıldığında DCA sergiler termodinamik istikrar ve kinetik hareketsizlik tercihmonomerik CA analogları. Bununla birlikte, DCA ve bir çok değerlilik nedenle, hedef bölgede para-manyetik türlerin yüksek lokal konsantrasyonu MR görüntüleri yüksek kontrast neden olur. Genellikle tercih farmakokinetik özellikleri monomerik CA analogları ile karşılaştırıldığında (örneğin, uzun doku tutma süresi), ya da daha fazla işlevleri yürütmek yeteneği (örneğin, hedeflenen vektörler) göz önüne alındığında, bu dendrimeric-makrosaykıl konjugatlar kontrast maddelerin bir gelecek vaat eden ve değerli sınıf için temsil çeşitli gelecek MR ve moleküler görüntüleme uygulamaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7 N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15% wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 10% wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | Version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
