Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

Dit manuscript beschrijft hoe om te screenen op thermostabilizing mutaties, zuiveren de menselijke serotonine transporter, het genereren van antilichamen met hoge affiniteit, en kristalliseren de serotonine transporter antilichaam-complex gebonden aan het antidepressivum citalopram S. Dit protocol kan worden aangepast aan de studie van andere uitdagende membraantransporteiwitten, receptoren en kanalen.

Abstract

De serotonine transporter is een natrium en chloride gekoppeld transporter dat "pompen" extracellulair serotonine in cellen. S-citalopram is een geneesmiddel dat gebruikt wordt voor de behandeling van depressie en angst door binding aan de serotonine transporter met een hoge affiniteit, het blokkeren van serotonine heropname. Hier melden wij een efficiënte procedure en een set van tools te stabiliseren, express, zuiveren en kristalliseren serotonine transporter antilichaam-complexen gebonden aan S-citalopram en andere antidepressiva. Mutaties die de serotonine transporter stabiliseren werden geïdentificeerd met een S-citalopram bindingsassay. Serotonine transporter tot expressie gebracht in baculovirus-getransduceerde HEK293S GNTI - cellen werd gereconstitueerd in proteoliposomen en gebruikt om hoge-affiniteit-antilichamen opwekken. Wij hebben een strategie ontwikkeld om antilichamen die bruikbaar zijn voor structurele studies ontdekt. Een eenvoudige benadering voor de expressie van antilichaamfragmenten in Sf9-cellen werd ook vastgesteld.Transporter-antilichaam complexen gezuiverd door het gebruik van deze procedure zijn goed gedragen en gemakkelijk te kristalliseren, het produceren van complexen met S-citalopram dat X-stralen breken tot 3-4 resolutie Å. De ontwikkelde strategieën kunnen worden gebruikt om de structuur van andere uitdagende membraaneiwitten bepalen.

Introduction

De serotonine transporter (SERT) een integraal membraaneiwit dat het transport van serotonine in celmembranen 1 vergemakkelijkt. SERT behoort tot een familie van Neurotransmitter Natrium symporter (NSS), die ook de dopamine en noradrenaline transporters 2. SERT is het moleculaire doelwit van veel voorgeschreven antidepressiva en anxiolytica die werken competitief remmen serotonine transport 3. SERT exploiteert de energetisch gunstige cotransport natrium om neurotransmitter uit de synaptische spleet verwijderen. Uitgebreide karakterisering van het serotonerge systeem blijkt dat veranderingen in serotonine metabolisme beïnvloeden blijken vrijwel alle neurologische processen zoals stemmingswisselingen, slaapstoornissen, pijn, cognitie en agressie gedragingen 4. SERT functie kan worden aangepast door het gebruik van antidepressiva en selectieve serotonineheropnameremmers (SSRI's) zoals S-citalopram, alsmede door psychostimulagen en drugs van verslaving zoals amfetamine en 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine of "ecstasy" 1,2.

SSRIs zijn enorm belangrijk voor de behandeling van stemmingsstoornissen, maar de exacte structurele basis voor hun werking wordt niet goed begrepen. WT SERT instabiel in detergens micellen, waardoor de voortgang belemmeren naar een driedimensionale (3D) structuur van SERT 5,6. Onlangs ontwikkelden we varianten SERT die robuust stabiel in een breed scala van detergentia en behouden SSRI bindingsactiviteit 6. Deze thermostabiele SERT varianten werden geselecteerd onder toepassing van een scintillatie proximity-gebaseerde assay thermostabiliteit. Hier beschrijven we een werkwijze voor het opwekken van antilichamen met hoge affiniteit die SERT kunnen binden, en de zuivering en kristallisatie van thermostabiele SERT, in complex met antilichamen en S-citalopram.

Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de SERT en 8B6 genen succesvol zijn geweesty gekloneerd in de BacMam 7 en insecten expressievectoren respectievelijk. Om antilichamen cDNA dat codeert residuen 73-616 van WT SERT werd gekloneerd in de vector BacMam met een C-terminaal StrepII-aanhangsel (SERT IC). Voor de thermostabiliteit scherm, werd SERT resten 73-616 met C-terminale GFP, Strep II, en 10-His-tags (SERT TC) gebruikt. Afzonderlijke puntmutaties werden gegenereerd in de SERT TC achtergrond. Voor de kristallisatie-protocol, was de SERT-GFP-fusie-eiwit gebruikt met Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] en 10-His-tags, het dragen van de thermostabiele mutanten, Y110A, I291A, en T439S en mutaties van het oppervlak cysteines C554A, C580A en C622A (SERT CC). Trombinesplitsing sequenties (LVPRGS) werden ook opgenomen in de SERT CC na Q76 en T618 om verwijdering van de N- en C-termini mogelijk. Het plasmide codeert voor het 8B6 Fab is ontworpen om zowel de zware als lichte expressketens van het antilichaam met GP67 secretie sequenties onder de controle van twee afzonderlijke polyhedrine promoters. Het C-uiteinde van de zware keten van het 8B6 antilichaam werd gelabeld met een 8-His tag en een thrombine splitsingsplaats werd ingebracht tussen de zware keten en de tag.

Protocol

1. Transfectie van hechtende HEK293S GNTI - Cellen voor Thermostabiliteit Screen

  1. Bereid Poly-D-Lysine (PDL) gecoate 96-well platen. Voer alle werkzaamheden in een steriele laminaire stroming kap.
    1. Filtreer een 25 gg / mL oplossing van (PDL), molecuulgewicht 70,000-150,000 Da, met een 0,2 urn steriel filter. Voeg 50 ul van PDL aan elk putje van een 96-well weefselkweek (TC) plaat, zodat de bodem gelijkmatig bedekt, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    2. Zuig PDL-oplossing en wassen met 200 pi steriel water.
    3. Laat de plaat drogen gedurende 2 uur voor opslag bij 4 ° C. PDL bedekte platen kan meerdere weken bewaard bij 4 ° C.
  2. Trypsine hechtende HEK293S cellen.
    1. HEK293S groeien tot 80% confluentie in een 10 cm schaal gehouden op 37 ° C met 8% CO2. Eén 10 cm schaal moet ongeveer 10 miljoen HEK293S cellen. Niet cellen gebruiken na 30 passages! Aspiraat media en was met 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 1 ml trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine, 0,02% EDTA) cellen en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C.
    2. Voeg 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en resuspendeer cellen door herhaaldelijk op en neer pipetteren met behulp van een serologische pipet.
    3. Pipetteer 10 ul cellen en mengen met 10 pi van trypan blauwe oplossing (0,4%). Bepaal celdichtheid met behulp van een hemocytometer en een lichtmicroscoop. Heeft cellen die blauw gekleurd zijn als zij dood zijn niet te tellen. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 90%.
  3. Grondig resuspendeer getrypsiniseerd HEK293S GNTI - cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS tot een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml in een wegwerp pipet reservoir. Ongeveer 5.000.000 HEK293S cellen nodig zijn voor elke plaat. Een totaal van 24 constructen kunnen worden getransfecteerd op elke plaat met deze protocol.
  4. Met behulp van een multichannel pipet 100 ul cellen aan elk putje van een PDL beklede plaat. Resuspendeer cellen in de pipet reservoir na het vullen elke plaat om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen. Incubeer cellen in een 37 ° C incubator met 8% CO2. Na 24 uur moeten de cellen ongeveer 80% confluentie bereiken.
  5. 1 uur voor transfectie vervangen media. Bereid DNA-transfectiereagens complexen voor transfectie.
    1. Voor elk construct in de SERT TC achtergrond te screenen, mengen 450 ng DNA met 45 pl serumvrij DMEM en meng. Voeg 1,6 ul van het transfectiereagens tot 45 ul serumvrij DMEM en meng.
    2. Voeg onmiddellijk verdunde transfectiereagens oplossing voor DNA-oplossing en meng. Gebruik geen oplossingen mengen in de omgekeerde volgorde. Wacht 10 - 15 min en voeg 20 ul van transfectiereagens / DNA mengsel 4 putjes.
  6. Zodra alle putten zijn getransfecteerd, meng plaat door voorzichtig schommelen terugnd heen en terug naar de 37 ° C incubator.
  7. Na 16-24 uur vervangen medium met DMEM met serum en 10 mM natriumbutyraat.
  8. Ongeveer 48 uur na transfectie verwijderd media en ofwel onmiddellijk voort thermostabiliteit scherm of bevriezen cellen bij -80 ° C tot later gebruik. Cellen kunnen meerdere weken bewaard bij -80 ° C.

2. Scintillation Proximity-gebaseerde Thermostabiliteit scherm met S-citalopram

  1. Incubeer cellen met 200 nM S-citalopram in 25 pl TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing - 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Oplosbaar cellen door toevoeging van 25 pl 8 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 mM cholesteryl hemmisuccinate (CHS), cocktail van proteaseremmers (2 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinine, 4 g / ml pepstatine A, en 4 ug / ml leupeptine) in TBS en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 50 ul TBS with 20 nM [3H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% runderserumalbumine en 2 mg / ml His-tag affiniteit scintillatie proximity assay (SPA) bolletjes drie putjes per construct. Voor de laatste goed toe te voegen dezelfde oplossing genoemd, maar te vullen met 100 uM sertraline niet-specifieke binding te bepalen. Zorg ervoor dat de His-tag affiniteit SPA kralen zijn goed gemengd bij het toevoegen van de 96-well plaat.
  4. Meet [3 H] citalopram binding met behulp van een 96-well scintillatieteller bij RT met een 1 min aantal keer per well. Ga door het tellen van platen tot totale tellingen plateau (ongeveer na 36 uur).
  5. Warmte platen gedurende 15 minuten in een verwarmingsblok met een verwarmd deksel bij 33 ° C. Meet [3H] citalopram binding weer na verhitting zoals beschreven in 2.4.
  6. Herhaal stap 2,4-2,5 en wijzig de verwarmingsstap tot 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C en 51 ° C. Aanpassen verwarmingstemperatuur afhankelijk van de schijnbare smelttemperatuur (Tm)van het doeleiwit en de thermostabiliteit van de meest stabiele constructie. Doorgaan om platen te verwarmen totdat alle constructen laag soortelijk telt.
  7. Analyseer gegevens naar Tm waarden te bepalen.
    1. Bepaal de gemiddelde totale tellingen per minuut (CPM) van elk construct voor putten die niet sertraline bevatten door het gemiddelde van de 3 herhalingsputjes. Bepaal de niet-specifieke CPM door het gemiddelde CPM van elk putje sertraline in een enkele plaat.
    2. Bereken specifieke CPM door het aftrekken van de niet-specifieke CPM van de totale CPM.
    3. Bereken de Tm door een niet-lineaire fit een Boltzmann sigmoïdale functie. Constructen met geringe specifieke CPM bij kamertemperatuur (<10% van WT) algemeen geen nauwkeurige Tm waarden. Mutaties van de thermostabiele constructen kunnen worden gecombineerd en gescreend op additieve toename in de thermostabiliteit.

3. Expressie van het Human serotonine transporter in HEK293S GNTI

  1. Transformeer chemisch competente DH10Bac cellen met 1 ng van het plasmide.
    1. plasmide toevoegen aan 50 ul van DH10Bac cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min.
    2. Heat shock DH10Bac cellen bij 42 ° C gedurende 30 sec. Voeg 200 pl SOC medium en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden.
    3. Plaat alle bacteriën op een Luria Broth (LB) platen bevattende 50 ug / ml kanamycine, 7 ug / ml gentamicine, 10 ug / ml tetracycline, 100 ug / ml 5-broom-3-indolyl β-D-galactopyranoside, en 40 ug / ml isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
  2. Isoleren lacZ - kolonies (witte kolonies) gekweekt bij 37 ° C gedurende 2 dagen op LB agarplaten.
  3. Groeien verschillende kolonies O / N bij 37 ° C in 5 ml LB met antibiotica en isoleren bacmide DNA.
    1. Spin down kiemen bij 1000 xg in een centrifuge gedurende 5 minuten. Teruggooi supernatant. Resuspendeer bacteriën met 200 pl miniprep resuspension buffer.
    2. Lyse bacteriën door toevoeging van 200 pl miniprep lysisbuffer en het buisje voorzichtig 10 keer. Voeg 200 pl neutralisatiebuffer.
    3. Onoplosbare fractie te verwijderen door het draaien bij 14.000 xg gedurende 10 minuten in een centrifuge. Voeg 1 ml isopropanol supernatant en kou bij -20 ° C gedurende 20 min om DNA te precipiteren.
    4. Spin bij 14.000 xg gedurende 15 minuten in een centrifuge en gooi supernatant.
    5. Wassen DNA pellet met 70% EtOH en weer draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min. Teruggooi supernatant. Droging DNA totdat alle EtOH is verdampt en resuspendeer in 50 ul van water.
      OPMERKING: Bacmid DNA worden getransfecteerd in Sf9-cellen onmiddellijk voor de beste resultaten, maar kan ook meerdere weken bewaard bij -20 ° C.
  4. Transfecteren bacmide DNA in 1x10 6 cellen van hechtende Sf9 gekweekt in een bevochtigde kamer bij 27 ° C in een 6-putjes. Voer alle celcultuur manipulaties in een steriele laminaire stroming kap.
      <li> media Verwijderen uit cellen en voeg 2 ml vers Sf9 media. Voeg 5 ug bacmide DNA 100 ul van Sf9 media (oplossing A).
    1. Voeg 8 pi van een kationogeen lipide Sf9 transfectiereagens tot 100 ul van Sf9 media (oplossing B). Incubeer buis met Oplossing B voor 5 min.
    2. Meng buis met oplossing A met Oplossing B en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min en voeg alle oplossing voor de Sf9-cellen.
    3. Na 96 h, oogst supernatant (P1 virus) door passage door een 0,2 urn filter. P1 virus kan enkele maanden opgeslagen bij 4 ° C in het donker en hergebruikt om P2 virus zo nodig.
  5. Voeg 100 gl P1 virus 1 liter Sf9-cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in Sf9 media. Cellen infecteren gedurende 96 uur groeien bij 27 ° C op een schudinrichting bij 100 rpm.
  6. Spin down cellen in een centrifuge bij 4000 xg gedurende 15 minuten en filter supernatant bevattende virusdeeltjes door een 0,2 urn filter. Gooi cel pellet. determine virale dichtheid met behulp van een virale plaque-test of een virus tegen te gaan. Het virus dichtheid moet> 1 x 10 8 virusdeeltjes per milliliter. P2 virus kan worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker en gebruikt voor verscheidene maanden.
  7. Infect 10 l HEK293S GNTI - cellen 7 groeien in suspensie bij 37 ° C met 8% CO2 en 85% vochtigheid op een schudinrichting bij 130 tpm in 293 expressie medium aangevuld met 2% FBS bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 2 en een dichtheid van 3 x 10 6 cellen / ml, gewoonlijk 30 - 50 ml P2 virus per 800 ml van cellen in een 2 L kolf war.
    LET OP: Het is niet aan te raden om meer dan 80 ml P2 virus gebruiken omdat de HEK293S GNTI - cellen zullen langzaam groeien en kunnen levensvatbaar worden als gevolg van een wijziging in de pH. Sf9 media is zuurder dan de 293 uitdrukking media.
  8. 12-16 uur na infectie, voeg natriumbutyraat tot een concentratie van 10 mM van een 1 M voorraadoplossing. 48-60 uur na infectie, oogst cellen door centrifugeren bij4000 xg gedurende 15 min. Verwijder het supernatant.
  9. Resuspendeer cellen in 150 ml TBS, 2 pM S-citalopram of andere remmers SERT en bewaar bij -80 ° C tot gereed voor zuivering.

4. Affiniteit Zuivering van het serotonine transporter voor immunisatie en kristallisatie

  1. Dooi cellen van 10 liter van de cultuur in warm water (ongeveer 30 ° C) en resuspendeer door snel het passeren van een 10 ml pipet tot homogeen.
  2. Bereid schoonmaakmiddel voor solubilisatie (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl bevattende 40 mM C12M, 5 mM CHS en proteaseremmer cocktail.
  3. Voeg alle cellen in een bekerglas met een roerstaaf en voeg alle detergensoplossing naar de cellen onder roeren. Oplosbaar bij 4 ° C gedurende 1 uur onder roeren.
  4. Spin lysaat bij 8000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi pellet en decant supernatant in schone ultracentrifuge buizen. Spin bij 100.000 xg gedurende 1 uur per ultracentrifuge. Gooi pellet en filter bovenstaande vloeistof door een 0,2 pm filter.
  5. Passen lysaat in 10 ml Strep affiniteit hars gepakt in een kolom met een peristaltische pomp geëquilibreerd in wasbuffer: 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glycerol, 25 uM lipide (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero- 3-fosfocholine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol bij een molaire verhouding van 1: 1: 1), en 1 uM S-citalopram of SSRI in TBS.
  6. Verbinding Strep affiniteitskolom een ​​Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) systeem waskolom bij 2 ml / minuut met 66 ml (6,6 kolomvolumina) wasbuffer. Elueer gezuiverd eiwit in dezelfde buffer gesupplementeerd met 5 mM desthiobiotine bij 0,5 ml / min met behulp van 33 ml (3,3 kolomvolumina) buffer. Verzamel 1 ml fracties; de piekfracties zal ~ 10 ml. Gezuiverd eiwit kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 2 - 3 d indien gewenst.
    LET OP: De totale opbrengst zal zijn 3 -4 mg SERT CC en 1 mg van SERT IC. Een absorptie van 2 AU bij 280 nm gelijk aan 1 mg / ml SERT.

5. Reconstitutie van Transporter in liposomen voor immunisatie

  1. Bereid liposomen die asolectin: cholesterol: lipide A: hersenen polair lipide (molverhouding 60: 17: 3: 20). Lipiden oplossen in 1 ml chloroform en voeg 40 mg totaal lipide een 100 ml glazen rondbodemkolf met gebruik van de molverhouding.
    1. Damp chloroform gedurende ten minste 1 uur onder vacuüm met de rondbodemkolf draaien in warm water, ongeveer 30 ° C.
    2. Hydrateren lipiden door toevoeging van 10 ml TBS. Incubeer in buffer gedurende 10 min.
    3. Bevries de lipide door het plaatsen van de kolf in vloeibare N2.
    4. Ontdooien. Dompel bolvormige bodem van de kolf in een bekerglas gevuld met warm water, ongeveer 30 ° C. Ultrasone trillingen in een badsonicator gedurende 5 minuten.
    5. Vortex en herhaal stappen 5.1.3 - 5.1.4 10 keer of totdat de lipidevolledig geresuspendeerd van de bodem en vormt een troebele suspensie.
    6. Extrusie van de gehele lipide mengsel tweemaal door middel van 200 nm filters. De lipide zal verschijnen als een melkachtige suspensie voorafgaand aan extrusie; daarna wordt deze doorschijnend. Mis gehele lipide mengsel niet aan de extruder tegelijkertijd als het verstopt raken, wat resulteert in verlies van monster.
    7. Spin lipiden bij 100.000 xg gedurende 20 min en resuspendeer in 0,5-1 ml TBS in een concentratie van 40 mg / ml.
  2. Concentreer gezuiverde SERT IC 250-500 pL met een 100 kDa MWCO centrifuge concentrator eiwit tot 2-4 mg / ml en verzadiging liposomen met 5 mM C12M. Voeg gezuiverd SERT aan het wasmiddel: lipide mengsel in 1 ml eindvolume.
  3. Verwijder C12M door 3 opeenvolgende toevoegingen van 80 mg / ml hydrofobe absorptie hars. Voor de eerste 2 toevoegingen, incubeer met hars met rotatie gedurende 2 uur bij 4 ° C. Verwijder hars door het passeren door glaswol. Voer de laatste incubatie met hars's nachts.
  4. Concentreer proteoliposomen door centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 20 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer pellet in 250-500 ul TBS.
  5. Voeg 10 uM eindconcentratie van S-citalopram met het opgeloste eiwit na de laatste verwijdering van hars.
  6. Oplosbaar 2,5 pi van de proteoliposomen in SDS-PAGE laadbuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% broomfenolblauw, 100 mM DTT) en gerund op een SDS-PAGE gel bij 200 V gedurende 1 h dat SERT zorgen met succes opgelost. Proteoliposomen kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C in porties voor lange termijn opslag en ontdooid op ijs voorafgaand aan elke immunisatie.

6. Screening voor antilichamen die 3D-epitopen

  1. Screen hybridoma cellijnen door western blot. Antilichamen die SERT herkennen door western blot waarschijnlijk binden lineaire epitopen en zal waarschijnlijk niet nuttig zijn voor structurele studies.
    1. Meng 1 ug opzuiveringed SERT IC of SERT CC en draaien op een 4-15% SDS-PAGE gel bij 200 V gedurende 1 uur.
    2. Verwijzing naar een nitrocellulosemembraan bij 200 mA gedurende 30 min met behulp Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v / v) methanol, 0,1% SDS). Het membraan kan worden gedroogd en voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur bewaard.
    3. Herbevochtiging membraan met 10% methanol, en wassen met PBS (10 mM fosfaat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
    4. Blokkeren met 5% melkpoeder in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Wassen met PBS en geïncubeerd met 1 ug / ml antilichaam in PBS met 0,1% melk.
    6. Was uitvoerig met PBS dat 0,1% Tween-20.
    7. Incuberen met geiten anti-muis antilichaam geconjugeerd aan een IR kleurstof verdund 1: 10.000 in PBS met 0,1% Tween 20 en 0,1% melk.
    8. Wassen uitvoerig en scannen met een beeldvormingssysteem.
  2. Meng hybridoma supernatant dat westerse negatieve antilichamen met 100 nM SERT CC eiwit met een molaire verhouding van 1: 2 (SERT: mAb) in 200 pl TBS met 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, en 1 pM S-citalopram. Centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 20 min. Analyseer supernatant dat SERT-mAb complexen en te analyseren met behulp van fluorescentie-detectie Size Exclusion Chromatography (FSEC) 8. Gooi de pellet.
    1. Run 100 pl supernatant op een gelfiltratiekolom bij 0,5 ml / min met behulp van een High Performance Liquid Chromatography (HPLC) systeem uitgerust met een fluorescentiedetector (excitatie: 480 nm, Emissie: 510 nm) onder toepassing van een loopbuffer met TBS, 0,4 mM lauryl maltose neopentylglycol en 1 uM S-citalopram. Antilichamen die complexen vormen zal de GFP-fusie-eiwit eerder dan de vrije transporter van de grootte-uitsluiting kolom elueren.
    2. Verdun complexen tot en met 10, 1, 0,1 nM in 200 pi TBS met 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, en 1 uM S-citalopram en herhaling FSEC. Antilichamen die nog steeds de vervoerder piek kan verschuiven bij lage nanomolaire concentratieshoge affiniteit binders en goede kandidaten voor structurele studies.
  3. Hertest binding van FSEC in aanwezigheid van 1 mM serotonine. Antilichamen die specifiek het SSRI gebonden conformatie herkennen binden in aanwezigheid van het substraat. Antilichamen die een 3D epitoop die niet verandert als gevolg van conformatie herkennen bindt ongeacht de ligand aanwezig.
  4. Meng paarsgewijze verschillende combinaties van antilichamen en testen van binding door FSEC. Antilichamen die verschillende epitopen herkennen veroorzaken SERT eerder elueren wanneer gecombineerd vergelijking met binding van een enkel antilichaam.
  5. Voor initiële structurele studies, selecteert u de hoogste affiniteit antilichamen die 3D-epitopen herkennen.

7. Weergave van antilichaam Fragment in Sf9 Cells

  1. Kloon variabele en constante domeinen van Fab door PCR in de insectencellen expressiesysteem voor expressie in Sf9-cellen met behulp van standaard protocollen.
  2. Transfecteren 1 x 10 6 Sf9 cellen met 5 ug Bacmid DNA dat voor de lichte en zware ketens van het 8-His gemerkte 8B6 Fab met een GP67 secretie sequentie (zoals in Sectie 3,4).
  3. Oogst P1 virus 96 uur na de transfectie en voeg 500 gl P1 virus 1 liter Sf9-cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in een 2 L kolf P2 virus te maken. Cellen infecteren gedurende 96 uur bij 27 ° C.
  4. Harvest P2 virus (volgens paragraaf 3.6).
  5. Infect 6 l Sf9-cellen bij een dichtheid van 2-3 x 10 6 cellen / ml met een MOI van 2 met P2 virus, kenmerkend 40 - 50 ml per kolf 1 liter Sf9 cellen per 2 L kolf.
  6. Oogst cellen ongeveer 96 uur na infectie. Voeg 50 ml fosfaatbuffer, pH 8 bij een eindconcentratie van 50 mM aan de cellen en centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 min. Gooi de celpellet en filter bovenstaande vloeistof door een 0,2 um filter tangentiële stroom cel. Verzamel supernatant en bewaar bij 4 ° C gedurende 2-3 dagen indien gewenst.

  1. Concentreer Sf9 supernatant met behulp van een 30 kDa moleculair gewicht Cut Off (MWCO) tangentiële flow cel tot ongeveer 400-800 ml.
  2. imidazool, pH 8 toe te voegen op een eindconcentratie van 10 mM en 10 ml His-tag affiniteitshars. Roer in een bekerglas gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  3. Verzamel His-tag affiniteit hars door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 minuten. Teruggooi supernatant.
  4. Verpak His-tag affiniteit hars in een kolom en aan te sluiten op een FPLC.
  5. Wassen His-tag affiniteit hars bij 2 ml / minuut met 66 ml (6,6 kolomvolumina) van 50 mM pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazool.
  6. Elueer 8B6 Fab in 33 ml 50 mM fosfaat pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazool. Verzamel 1 ml fracties.
  7. Verdun affiniteit gezuiverd Fab met een 10-voudig volume ijskoude 20 mM acetaat, pH 5.
  8. Fab binden aan een 1 ml kation uitwisselende kolom onder toepassing van een peristaltische pomp bij 1 ml / minuut.
  9. Aparte Fab met behulp van een 30 ml linoor gradiënt van NaCl (0-500 mM) in 20 mM acetaat pH 5,5 onder toepassing van een FPLC. Fab elueren als een enkele piek bij ~ 300 mM NaCl.
  10. Analyseren op een 12,5% SDS-PAGE onder toepassing monsterbuffer bevattende 100 mM DTT. De zware en lichte ketens van het 8B6 Fab loopt bij 27 en 25 kDa, respectievelijk, op een reducerende SDS-PAGE gel.
  11. Pool fracties die Fab en concentreer tot minstens 10 - 15 mg / ml met een 30 kDa MWCO eiwit concentrator in een swinging bucket centrifuge bij 3000 x g.
  12. Op pH 8 door toevoeging van 1 M Tris pH 8 tot een eindconcentratie van 50 mM en gezuiverd Fab opslag voor lange termijn bij 4 ° C. De totale opbrengst wordt 25-30 mg. Een absorptie van 1,4 AU bij 280 nm gelijk aan 1 mg / ml 8B6 Fab.

9. Vorming van Transporter-antilichaam complexen en Scheiden door Size Exclusion Chromatography

  1. Voor kristallisatie, zuiveren de SERT CC by Strep affiniteitschromatografie in C12M zoals eerder beschreven (hoofdstuk 4).
  2. Meng geconcentreerd SERT met Fab bij een molaire verhouding van 1: 1,2 in een hoeveelheid van minder dan 500 pl. Centrifugeer bij 100.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. Verzamel supernatant dat SERT-Fab complex. Discard pellet.
  3. Gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) onder toepassing van een FPLC op een gelfiltratiekolom geëquilibreerd in TBS dat was aangevuld met 40 mM n-octyl-β-D-maltoside (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glycerol, 25 uM lipide (zelfde als in stap 4,5), en 1 pM S-citalopram bij 0,5 ml / min.
  4. 0,5 ml fracties te verzamelen en te analyseren op 4-15% SDS-PAGE gels en door tryptofaan fluorescentie door SEC. GFP hebben SERT zal ongeveer 80 kDa lopen op een SDS-PAGE gel. Na verwijdering van de termini en N-gekoppelde suikers zal draaien als een 45 kDa eiwit.
  5. Determine die fracties te combineren door het samenbrengen alleen de fracties die monodisperse zijn zoals beoordeeld door analyse van de fracties van tryptofaan fluorescentie SEC (excitatie: 280, emissie: 335 nm).
  6. WINKEL gezuiverd SERT-complex 8B6 bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.

10. Kristallisatie van Transporter-antilichaam complexen door Opknoping Drop

  1. Voorafgaand aan kristallisatie concentreren piekfracties van de SEC scheiding van de SERT-complex 8B6 2 mg / ml met behulp van een 100 kDa MWCO centrifuge concentrator eiwit. Een absorptie van 2 AU bij 280 nm gelijk aan 1 mg / ml.
  2. Voeg extra Fab in een verhouding van 1: 0,05 complex: vrij Fab. Voeg 10 uM gratis S-citalopram.
  3. Centrifugeer bij 100.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. Verzamel supernatant dat de SERT-Fab complex. Discard pellet.
  4. Het opzetten van een hangende druppel 24-well scherm bij 4 ° C volgens tabel 1. Grow diffractie kwaliteit kristallen over reservoir oplossingenbevattende 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, 25-125 mM KCl, 32,5-34% PEG 400 en 0,5% 6-aminohexaanzuur.
    OPMERKING: Gebruik Tris ingesteld met NaOH op pH 8,5 als buffer. Gebruik geen Tris-base bijgesteld met HCl. Het scherm kan worden bereid in 2 ml buizen en gebruikt tot het werk klaar. Zorg om nauwkeurig pipet PEG 400 met behulp van een positieve verplaatsing pipet want het is zeer stroperige!
    1. Pipetteer 500 ul van elke voorraadoplossing in een low profile 24-wells plaat met afdichtmiddel aangebracht in elk putje. Pipette 1,5, 1,75 en 2 pi van de SERT-8B6 complex op een 18 mm gesiliconiseerde glazen afdekplaat slip. Pipetteer 1 pl voorraadoplossing bovenop het eiwitmonster.
      OPMERKING: De plaat werd aangekocht kit reeds aangebracht op de rand van de putjes.
    2. Solliciteer dekking dia om de 24-wells met de dalingen tegenover het reservoir oplossing en sluit direct door te drukken dekglas op kit vooraf aangebracht in elk putje.
    3. Ga door tot alle 24-wells zijn opgezet. Laat de voltooide plaat in een goed geïsoleerde kamer bij 4 ° C. Mis platen niet storen minstens 3 dagen
      LET OP: Single kristallen verschijnen binnen ongeveer 3 dagen en groeien tot 100-175 urn na 14 dagen.
  5. Harvest kristallen in cryoloops en direct flash-cool in vloeibare N 2 voorafgaand aan de X-ray diffractie verzamelen van gegevens.
  6. Indien nodig, vindt aanvullende kristallisatie voorwaarden door brede screening met opknoping druppels. Met drie druppels met eiwit: neerslagmiddel verhoudingen van 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Als een robot beschikbaar is, dan is het opzetten van 100-150 nL druppels op 70 pi van het reservoir oplossing in een 96-well plaat. 3D grotere kristallen kunnen worden gekweekt in 24-wells.
  7. Score gebaseerd op het uiterlijk van de daling: 0, duidelijk; 1, stof; 2, granulair precipitaat; 3, fasescheiding; 4, microkristallijne; 5, naalden; 6, borden; 7, 3D kristallen.
  8. Opgericht kristallisatie door opknoping daling methoden in 24-wells zoals hierboven is beschreven in de buurt van nieuw geïdentificeerde conditions.

Representative Results

Een bibliotheek van enkel punt mutanten in het SERT TC achtergrond is gemaakt om het scherm voor thermostabilizing mutaties. Individuele mutanten werden gegenereerd onder gebruikmaking van standaard mutagenese. De screening protocol maakt gebruik van tijdelijk getransfecteerde HEK293S cellen en een scintillatie nabijheid gebaseerde thermostabiliteit scherm snel identiteit nuttig mutaties voor kristallisatie zoals in Figuur 1A. Plotten Tm-waarden tegen gebonden [3H] citalopram bij kamertemperatuur onthult constructen met hoge thermostabiliteit en expressieniveaus geschikt voor eiwitzuivering (Figuur 1B). Drie mutanten (Y110A, I291A en T439S) werden gecombineerd om een zeer stabiele constructie (figuur 1C) te genereren. De thermostabiliteit is ook gecorreleerd met verhoogde stabiliteit in kortketenige detergentia noodzakelijk is voor de kristallisatie van de SERT-Fab complex.

De grootschalige expressie van humaan SERT gebruik van baculovirus-transduced HEK293S GNTI - cellen minder dan 2 weken en kan milligram hoeveelheden produceren, zoals geïllustreerd in figuur 2A. Gebruik van het GFP-gelabeld eiwitten SERT CC laat SERT gemakkelijk te volgen tijdens expressie en zuivering door fluorescentie (figuur 2B). Onze zuiveringsstrategie betrokken 1) oplossen van SERT gebonden aan S-citalopram uit HEK293S GNTI - cellen C12M in aanwezigheid van CHS als stabiliserende lipide; 2) de binding van SERT een Strep affiniteitsmatrix; 3) verwijdering van verontreinigende eiwitten door uitgebreid wassen; en 4) elutie van de functionele SERT met buffer bevattende desthiobiotine (figuur 2C). Het geëlueerde eiwit grotendeels vrij van andere eiwitten gedetecteerd door Coomassie blauwkleuring en monodisperse zoals beoordeeld door FSEC (figuur 2D, E).

Een soortgelijke strategie werd naar SERT zuiveren met StrepII die is gebruikt voor reconstitution en immunisatie (Figuur 3A, B). Incorporatie van SERT in proteoliposomen verhoogt het serum halfwaardetijd en stabiliteit van SERT en verbetert de kans isolatie van hoge affiniteit-antilichamen. Bovendien opname van lipide A, een component van de bacteriële celwand dient als een krachtig adjuvans 9. Multilamellaire liposomen werden bereid door de toevoeging van buffer tot een gedroogde lipidemengsel in glazen buizen en geresuspendeerd in buffer. Extrusie van de liposomen door middel van 200 nm poriegrootte filters produceert monodisperse unilamellaire liposomale suspensies. De liposomen worden vervolgens verzadigd met detergens, gevolgd door de toevoeging van gezuiverd SERT in detergens. Tenslotte wordt detergens verwijderd door toevoeging van hydrofobe absorptie hars om de lipide: detergensmengsel. Aanvullende ligand worden toegevoegd aan het opgeloste monster antilichamen te selecteren die het antidepressivum conformatie herkennen. De aanwezigheid van SERT in de proteoliposomen moet worden bevestigd doorsolubiliserende een klein monster met SDS-PAGE loading dye of C12M en actief is op SDS-PAGE en FSEC (Figuur 3C, D).

Hybridoma cellijnen SERT antilichamen kunnen worden gescreend op hoge-affiniteit binders die 3D-epitopen herkennen. Deze eigenschappen zijn belangrijk voor het uiteindelijke succes van kristallisatie, als het antilichaam verankerd moet blijven gebonden aan een gestructureerd regio pakkingspatronen homogene, goed geordende domeinen bevorderen. In de eerste stap worden antilichamen die ongestructureerde regio herkennen geïdentificeerd. SERT is gedenatureerd en geblot op een nitrocellulose membraan; antilichamen die gedenatureerde SERT binden zal western-positief zijn en waarschijnlijk herkennen lineaire epitopen. In figuur 4A tonen wij 2 voorbeelden van antilichamen die western-positieve en waarschijnlijk niet nuttig crystallogenesis bevorderen zijn. In figuur 4B, worden de resterende western-negatieve antilichamen geïncubeerd met 100 nM SERT-GFP en gescheiden doorFSEC. Antilichamen die binden SERT de GFP-positieve piek verschuiven naar een eerdere positie. De SERT-antilichaam complexen kunnen verder worden verdund reinigingsmiddel te bepalen of zij met nanomolaire affiniteit gevolgd door analyse door FSEC kan binden. Toevoeging van serotonine leidt tot conformatieveranderingen in de transporter en dus de antilichamen worden gescreend om te bepalen of ze specifiek de SSRI-gebonden conformatie kan herkennen. In figuur 4C worden de antilichamen aangetoond SERT binden in de aanwezigheid van serotonine, waaruit blijkt dat de epitoop (en) niet veranderen van de SSRI gebonden toestandsubstraat. Tenslotte in figuur 4D combinaties van antilichamen getest op hun vermogen om verschillende epitopen binden, wat resulteert in een verdere verschuiving naar links. Hier de 15B8 of antilichamen 8A11 herkennen een epitoop die verschilt van 8B6.

De 8B6 antilichaam werd gekozen voor verdere structurele analyse op basis van voorlopige kristal screening met papaïne Treated Fab. De genen van de 8B6 Fab gekloneerd in een insectencel expressievector. Fab kan worden uitgedrukt en afgescheiden door Sf9-cellen in suspensie te groeien. De 8B6 Fab kan worden gezuiverd uit Sf9 celsupernatant door His-tag affiniteit (Figuur 5A, B) en kationenuitwisselingschromatografie (figuur 5C, D) resulteert in eiwit dat vrij is van verontreinigingen op SDS-PAGE gelen weergegeven. In figuur 5E is de recombinante 8B6 Fab aangetoond SERT binden en in aansluitende biochemische en biofysische experimenten.

De affiniteit gezuiverde SERT CC wordt gedigereerd met thrombine en EndoH en gemengd met 8B6 Fab van een complex in de aanwezigheid van S-citalopram te vormen. De transporter-antilichaamcomplex wordt vervolgens gescheiden door SEC C8M (figuur 6A) en de piekfracties bevatten zowel SERT en Fab zoals getoond door SDS-PAGE (Figuur 6B). Het gebruik van C8M is cruciaal voor kristalvorming waarschijnlijk omdatde korte keten wasmiddel mogelijk maakt betere verpakking tussen moleculen in het kristalrooster. FSEC wordt gebruikt om te bepalen welke fracties worden samengevoegd voor kristallisatie (figuur 6C); fracties die niet monodispers zijn en / of grote hoeveelheden vrije SERT of Fab mag niet worden gecombineerd.

Prismavormige kristallen SERT-antilichaam kan worden gekweekt in aanwezigheid van S-citalopram met dit protocol door opknoping druppel dampdiffusie (Figuur 7A). De resulterende kristallen buigen röntgenstralen een resolutie van 3,15 A 10 (figuur 7B).

Figuur 1
Figuur 1: Scintillation Proximity-gebaseerde Thermostabiliteit Assay A.. Overzicht protocol voor het screenen thermostabiliteit in aanwezigheid van [3H] citalopram. B. Maximale gebonden [3 (Tm). De gestippelde lijnen geven waarden voor de WT transporter. De 3 meest thermostabiele mutanten zijn gelabeld. Grijze gebied representeert mutanten die minder dan 10% van [3H] citalopram binding ten opzichte van WT en dus onnauwkeurig Tm waarden als gevolg van een lage signaal-ruis. C. Thermostabiliteit curves voor WT SERT TC en de top 3 mutanten. Fout balken geven de standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Overzicht van Mammalian heterologe eiwitexpressie A.. Schematisch overzicht van BacMam virus generatie en expressie van SERT in HEK293S GNTI -. Cellen B. HIJK293S GNTI - cellen die het SERT CC (GFP fluorescentie) C.. Elutieprofiel van SERT CC op Strep affiniteit hars. Groene spoor geeft de concentratie van desthiobiotine, 0-100% (0-5 mM) D.. Analyse van affiniteit gezuiverd SERT CC op een 4-15% SDS-PAGE gel E.. FSEC van affiniteit gezuiverd SERT CC gedetecteerd door GFP-fluorescentie (excitatie: 480 nm; Emissie: 510 nm). De piek eluerend bij 15 ml is SERT (#) en 18 ml is gratis GFP (*). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Representatieve Affiniteit Zuivering en Reconstructie van het SERT IC A.. Schematisch overzicht van generatie antilichaam. <strong> B. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de affiniteitszuivering van SERT IC op Strep affiniteitshars. Groene spoor geeft de concentratie van desthiobiotine, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analyse van affiniteit gezuiverd en opnieuw SERT op een 4-15% SDS-PAGE gel D.. FSEC van opgeloste SERT na reconstitutie. De fluorescentie van tryptofaan residuen werd gebruikt om SERT (excitatie: 280 nm; Emissie: 335 nm) te detecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4:. Analyse van representatieve SERT antilichamen A. Screening van antilichamen door western blot. Ongeveer 1 ug SERT CC met of zonder GFP werd op een 4-15% SDS-PAGE gel en geblot op een nitrocellulose membraan. Binding werd gedetecteerd met een geit anti-muis-antilichaam geconjugeerd met IR Dye. 2G4 en 10F2 zijn westerse positief. B. Binding van antilichamen tegen 100 nM GFP-gelabeld SERT en detectie door FSEC gedetecteerd met GFP-fluorescentie. C. Binding van geselecteerde Fabs tot 100 nM GFP-gelabeld SERT in aanwezigheid van 1 mM serotonine. D. Binding van 8A11 of 15B8 Fabs aan SERT-8B6 Fab. Kleine pieken eluerend bij 18 ml zijn gratis GFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Representatieve Zuivering van de 8B6 Fab van Sf9 cellen A.. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de zuivering van de 8B6 Fab door His-tag affiniteit chromatograp hy. Groen trace vertegenwoordigt de concentratie van imidazool, 0-50% (0-250 mM) B.. Niet-reducerende en reducerende SDS-PAGE gel na His-tag affiniteitszuivering. Eiwit dat wordt uitgevoerd in de buurt van 50 kDa is niet-gereduceerde Fab (#) en kleinere soorten bij 25 kDa wordt gereduceerd Fab (*). C. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de zuivering van de 8B6 Fab door kationenuitwisseling tonen een symmetrische piek die elueerde onder een lineaire natriumchloridegradiënt. Groene spoor geeft de concentratie van NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analyse van de 8B6 Fab op een 12,5% SDS-PAGE-gel na zuivering door kationenuitwisseling. E. Binding van de 8B6 Fab tot 10 nM-GFP-tag SERT, gedetecteerd met behulp van fluorescentie van GFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

e 6 "src =" / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
Figuur 6: Representatieve gelfiltratiechromatografie van de SERT-8B6 complex in aanwezigheid van S-citalopram A.. Gelfiltratie elutieprofiel gezuiverd SERT-complex 8B6. Hoofdpiek elueerde bij 11,5 ml is het SERT-8B6 complex. Piek bij 15-17 ml bevat GFP en Fab B.. Analyse van het gezuiverde SERT-8B6 complex op een 4-15% SDS-PAGE gel. De posities van SERT en de zware en lichte ketens van het Fab wordt getoond door een streepje. C. FSEC van het formaat gescheiden fracties. SERT-8B6 complexen werden gedetecteerd met behulp tryptofaan fluorescentie. Fractie 17 bevat een grotere hoeveelheid SERT die niet complex deed met Fab. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7 Figuur 7: kristallisatie van het SERT-8B6 Complex Bound to S-citalopram A.. Lichtmicroscopie van parallellepipedum gevormde kristallen van de SERT-complex 8B6 na 2 weken groei. Schaal bar is gelijk aan 200 pm. B. SERT-8B6 kristallen buigen X-stralen tot 3,15 Å. Blauwe ring vertegenwoordigt 3,15 Å. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1:. Kristallisatie scherm voor de SERT-8B6 Complex Bound to S-citalopram Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Bepaling van membraaneiwit structuur door biofysische technieken blijft een enorme onderneming voor veel medisch significante transporters, receptoren en kanalen 11. Hier delen we gedetailleerde kennis ontwikkeld voor de structuur bepaling van de menselijke serotonine transporter gebonden aan S-citalopram. We verwachten dat deze methoden nuttig zijn om structuren van SERT bepalen in andere conformationele staten, alsook structuren van andere moeilijke membraaneiwitten zal zijn. Bovendien is de biochemische technieken die hier beschreven kunnen ook worden gebruikt om de functie van gezuiverd SERT schoonmaakmiddel en een bijna-natieve lipide omgeving bestuderen.

SERT kristallisatie scharnierend op de ontwikkeling van diverse tools en technieken. Ten eerste, verbeteringen in de transporter thermostabiliteit geproduceerd SERT varianten die werden goed gedragen in verschillende detergent micellen na extractie van de vervoerder van membranen 6. Ten tweede, het gebruikvan de hoge affiniteit ligand S-citalopram gedurende zuivering en kristallisatie verder verbeterde stabiliteit en verminderde conformationele heterogeniteit. Ten derde, de ontwikkeling van het expressiesysteem BacMam 7 toegelaten voor de productie van grote hoeveelheden SERT in een korte periode van 2 weken, vergemakkelijkt zowel immunisatie en kristallisatie. Tenslotte, de ontwikkeling van strategieën om te selecteren op antilichamen met hoge affiniteit die 3D epitopen toegelaten voor de ontdekking van het 8B6 antilichaam dat geordende pakking van SERT-antilichaamcomplexen in kristallen bevordert herkennen.

Er zijn een aantal kritische stappen en reagentia alsmede gemeenschappelijke problemen die vaak optreden gedurende het protocol. Ten eerste kan de vorming van hoge titer virus SERT P2 problematisch zijn. Toevoegen van lage concentraties van P1 tot P2 virus virus te genereren zoals beschreven in dit protocol vermindert meestal dit probleem, en wanneer de P2 virustiter laag is, kan P3 virus usin wordeng virus bij een MOI van 0,0001. Virussen met een titer van minder dan 1 x 10 8 virusdeeltjes / ml mag niet worden gebruikt en zullen vrijwel altijd tot lage eiwitopbrengsten. Voor expressie, HEK293S GNTI - cellen werden gekozen omdat ze geen N -acetylglucosaminyltransferase I-activiteit en daardoor niet synthetiseren complexe N-glycanen, maar uitsluitend hoog- mannose N-glycanen. EndoH splitst N-gebonden glycosylering van hoge mannose glycanen op twee locaties in de extracellulaire lus 2 (EL2), waardoor een N-acetylglucosamine gekoppeld aan asparagine. Vertering van N-gebonden suikers vermindert oppervlak entropie van EL2 die waarschijnlijk belangrijk is voor kristallisatie. Voor het genereren van antilichamen, zou de SERT IC worden gebruikt voor immunisatie. GFP zeer immunogeen 12 en mag niet worden gebruikt als een fusie-tag antilichamen omdat het moeilijk volledig te verwijderen door SEC. De flexibele N- en C-terminus van SERT waren evenminin het construct om antilichamen tegen deze gebieden te voorkomen. Muizen kunnen worden geïmmuniseerd met 30 ug opgeloste eiwit; verder immuniseren van muizen tot hoge serumconcentraties van antilichamen kan worden gedetecteerd en produceren hybridoomcellen zoals beschreven 13. Een thermostabilized construct is meestal de beste keuze voor immunisatie; indien de vervoerder is goed gedragen en behoudt biologische activiteit na zuivering, is dit vaak voldoende om antilichamen op te wekken. De 8B6 antilichaam werd opgewekt tegen WT SERT. Kristallisatieoplosmiddel moet alleen het piekfracties van SEC met monodisperse complex zoals beoordeeld door FSEC worden gecombineerd en geconcentreerd. SERT-8B6 kristallen groeien in een beperkt aantal omstandigheden en er zijn een aantal stappen die moeten worden genomen om specifieke problemen in verband met SERT kristalgroei lossen. Tris-base ingesteld met HCl mag niet worden gebruikt in de reservoiroplossing, aangezien deze buffer ondersteunt geen kristalgroei; het is dus crische gebruiken in plaats Tris ingesteld met NaOH. SERT kristallen groeien in een smal concentratiegebied van PEG 400, dus als kristallen niet groeien of als er veel kleine kristallen worden waargenomen, zou zelfs een kleine toename of afname van de concentratie PEG 400 worden geadviseerd. Verder werd het additief 6-aminohexaanzuur ook gebruikt in de geoptimaliseerde scherm om kiemvorming te verbeteren. De daling verhouding eiwit: goed oplossing ook een belangrijke bepalende factor voor kristalgroei. Daling verhouding van 1,5-2: 1 de voorkeur, met drop ratio dichter bij 2: 1 typisch ondersteunen van de groei van grote 3-dimensionale kristallen. Tenslotte, het gebruik van lage profile 24-well platen is ook cruciaal richting kristalgroei, waarschijnlijk als gevolg van wijziging van de snelheid van dampdiffusie.

Een alternatieve benadering voor de SPA methode ontwikkeld voor het screenen voor mutanten die de rat serotonine transporter stabiliseren in een cocaïne gebonden conformatie met een filter bindingsbepaling 5. Daarentegen is de SPA based-test zorgt voor sequentiële verwarming stappen gevolgd door het bepalen van de fractie van SERT, die gebonden is aan ligand blijft. Aldus maakt dit de snelle bepaling van de smelttemperatuur van een klein aantal monsters. De SPA werkwijze berust op de beschikbaarheid van een radioactief gemerkte hoge affiniteit ligand en als er geen liganden bekend die binden submicromolaire affiniteit dan een alternatieve benadering nodig. Vele andere werkwijzen worden gewoonlijk toegepast om eiwitstabiliteit meten zoals binding van fluorescente kleurstoffen en calorimetrie 14 maar zijn laag-throughput en hetzij niet rechtstreeks functie te meten of vereisen grote hoeveelheden eiwit. Indien de SPA methode niet kan worden gebruikt, een alternatieve high-throughput benadering is een FSEC gebaseerde thermostabiliteit test 15 (FSEC-TS), waarbij het monster wordt verwarmd en vervolgens afscheiding van de fractie van overblijvende transporter. FSEC-TS is een nuttige aanpak voor de toegang tot chromatografisch gedrag en oligomere staat en is apowerful aanvullend instrument die naast de SPA-werkwijze kan worden gebruikt.

Een vergelijking van verschillende gemeenschappelijke eiwitexpressiesystemen bleek ook het gebruik van zoogdiercellen voor expressie SERT 16 bevorderen en verrassend is dit waarschijnlijk het geval is voor veel eiwitten van zoogdieren. De methoden die we hebben gebruikt voor expressie zijn op maat gemaakt voor SERT, maar zijn waarschijnlijk gemakkelijk aan te passen. Omstandigheden die hoge expressieniveaus bevorderen moeten zorgvuldig worden geïdentificeerd door het variëren van het tijdstip van expressie, temperatuur, virusconcentratie en aanwezigheid van histon deacetylase inhibitoren zoals natriumbutyraat.

Wij zijn voorstander van het algemeen affiniteit zuivering in een milde lange-keten detergent zoals C12M samen met CHS vóór reconstitutie met hoge affiniteit ligand binding te behouden. Reconstructie met behulp van hydrofobe absorptie is een milde techniek die we hebben gevonden effectief voor een aantal andere vervoerders en receptoren te zijn. Als ditis niet succesvol, verwijdering of detergentia aan hoge kritische micelconcentratie door dialyse, verdunning of SEC worden toegepast 17 verschaft het antigeen voldoende stabiel in dergelijke wasmiddelen. In gevallen waarin geen geschikte antistoffen worden gevonden, vinden we bijna altijd het probleem is te wijten aan het verlies van functie of denaturatie van het antigeen en in dergelijke gevallen hebben we met succes nieuwe vaccinaties met speciale aandacht voor eiwit biochemie uitgevoerd. Tenslotte liganden en antilichamen die binden met hoge affiniteit zou de basis voor een rationeel geplande kristallisatie experiment vormen en door gebruik te maken van een thermostabiel variant kan men een grotere verscheidenheid van omstandigheden screenen door het variëren van de eigenschappen van verschillende detergentia. Verder kristallisatie in een lipide mesofase 18 of via bicelles 19 moet altijd worden beschouwd als een alternatief voor kristallisatie in micellen.

Deze principes en werkwijzen kunnen worden gebruikt met bepaalde wijzicatie voor vele andere transmembraan eiwitten die moeilijk uit te drukken en te zuiveren van andere expressiegastheren en zullen bijzonder nuttig zijn voor de structuurbepaling van doelwitten met hoge affiniteit drugs zijn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).
  7. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Tags

Biochemie structurele biologie kristallisatie membraaneiwit antilichaam immunisatie reconstructie serotonine transporter neurotransmitter antidepressiva selectieve serotonine heropname remmers thermostabiliteit
Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coleman, J. A., Green, E. M.,… More

Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter