Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

Dette manuskriptet beskriver hvordan å screene for thermostabilizing mutasjoner, rense den menneskelige serotonin transporter, generere høy affinitet antistoffer, og krystallisere serotonin transporter-antistoff kompleks bundet til antidepressive medikament S -citalopram. Denne protokollen kan tilpasses til studiet av andre utfordrende membran transportører, reseptorer og kanaler.

Abstract

Serotonintransportøren er en natrium og klorid-coupled transporter som "pumper" ekstracellulært serotonin inn i celler. S -citalopram er et stoff som brukes til å behandle depresjon og angst ved binding til serotonin transporter med høy affinitet, blokkerer serotonin reuptake. Her rapporterer vi en effektiv prosedyre og et sett med verktøy for å stabilisere, uttrykke, renser, og krystalliserer serotonin transporter-antistoffkomplekser bundet til S -citalopram og andre antidepressiva. Mutasjoner som stabiliserer serotonintransportøren ble identifisert ved hjelp av en S -citalopram bindingsbestemmelse. Serotonin transporter uttrykt i baculovirus-omsatte HEK293S GnTI - celler, ble rekonstruert i proteoliposomes og brukes til å heve høy affinitet antistoffer. Vi har utviklet en strategi for å oppdage antistoffer som er nyttige for strukturstudier. En grei tilnærming for uttrykket av antistoff-fragmenter i Sf9 celler er også etablert.Transporter-antistoffkomplekser renset ved hjelp av denne prosedyren er veloppdragen og lett krystalliserer, produsere komplekser med S -citalopram at diffract røntgen til 3-4 en løsning. Strategiene utvikles her kan anvendes for å bestemme strukturen til andre utfordrende membranproteiner.

Introduction

Den serotonin transporter (Sert) er en integrert membranprotein som forenkler transport av serotonin over mobilnettet membraner 1. Sert tilhører en familie av Nevrotransmitter Sodium Symporters (NIH) som også omfatter dopamin og noradrenalin transportører 2. Sert er den molekylære målet for vidt foreskrevet antidepressiva og angstdempende medikamenter som virker å kompetitivt hemme serotonin transport tre. Sert utnytter energisk gunstig cotransport av natrium for å fjerne nevrotransmitter fra den synaptiske spalten. Omfattende karakterisering av serotonerge systemet har vist at endringer i serotonin metabolisme synes å påvirke nesten alle nevrologiske prosesser, inkludert humør, søvn, smerte, kognisjon og aggresjon atferd fire. Sert funksjonen kan endres gjennom bruk av antidepressiva og selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) som S -citalopram, samt av psychostimulants og vanedannende legemidler som amfetamin og 3,4-metylendioksy- N -methylamphetamine eller "ecstasy" 1,2.

SSRI er uhyre viktig for behandlingen av stemningslidelser, men den eksakte strukturelle basis for deres virkning er ikke godt forstått. WT Sert er ustabil i vaskemiddel miceller, og dermed hindrer utvikling mot en tredimensjonal (3D) struktur av Sert 5,6. Nylig har vi utviklet varianter av SERT som er robust stabile i et bredt spekter av vaskemidler og bibeholder SSRI bindingsaktivitet 6. Disse termostabile Sert varianter ble valgt ved hjelp av en scintillation nærhet basert termo analysen. Her beskriver vi en prosedyre for generering av høy affinitet antistoffer som kan binde Sert, og rensing og krystallisering av termostabile Sert, i kompleks med antistoff og S -citalopram.

Denne protokollen forutsetter at Sert og 8B6 gener har vært vellykkety klonet i BacMam 7 og insekt ekspresjonsvektorer, respektivt. For å generere antistoffer, ble cDNA som koder for residuer 73-616 av WT SERT klonet inn i vektoren BacMam med en C-terminal Strep-tag II (Sert IC). For termo skjermen, ble Sert rester 73-616 med C-terminal GFP, Strep II, og 10-Hans tags (Sert TC) som brukes. Individuelle punktmutasjoner ble generert i Sert TC bakgrunnen. For krystallisering protokollen ble Sert-GFP fusjonsprotein brukes med Twin-strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] og 10-Hans tags, bærer de termo mutanter, Y110A, I291A, og T439S og mutasjoner av overflate cysteiner C554A, C580A og C622A (Sert CC). Trombinspaltning sekvenser (LVPRGS) ble også satt inn i den SERT CC etter Q76 og T618 for å tillate fjerning av N- og C-termini. Plasmidet koder for 8B6 Fab ble konstruert for å uttrykke både de tunge og lettekjeder av antistoffet med GP67 sekresjons-sekvenser under kontroll av to atskilte promotorer polyhedrin. Den C-terminale enden av den tunge kjeden av 8B6-antistoff ble merket med en 8-His-tag og en trombin-spaltningssete ble satt inn mellom den tunge kjede og den koden.

Protocol

1. Transfeksjon av Heft HEK293S GnTI - Cells for termostabilitet Screen

  1. Fremstille poly-D-lysin (PDL)-belagte 96-brønners plater. Utføre alt arbeid i en steril laminær hette.
    1. Filtrere en 25 mikrogram / ml oppløsning av (PDL), molekylvekt 70,000-150,000 Da, ved hjelp av et 0,2 pm sterilt filter. Tilsett 50 mL av PDL til hver brønn av en 96-brønn vevskultur (TC) plate, som sikrer at bunnen er jevnt belagt, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
    2. Aspirer PDL-løsning og vask med 200 ul sterilt vann.
    3. La platen lufttørke i 2 timer forut for lagring ved 4 ° C. PDL-belagte platene kan lagres ved 4 ° C i flere uker.
  2. Trypsinering de heft HEK293S celler.
    1. Vokse HEK293S til 80% konfluens på en 10 cm plate holdt ved 37 ° C med 8% CO2. En enkelt 10 cm retten skal ha rundt 10 millioner HEK293S celler. Ikke bruk celler etter 30 passasjer! Sug media og vask med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Tilsett 1 ml Trypsin-EDTA-løsning (0,25% trypsin, 0,02% EDTA) til celler og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C.
    2. Tilsett 10 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og resuspender cellene ved gjentatt pipettering opp og ned ved hjelp av en serologisk pipette.
    3. Pipetter 10 ul celler og blandes med 10 mL av trypanblått-oppløsning (0,4%). Bestemme celletetthet ved hjelp av et hemocytometer og et lysmikroskop. Ikke telle celler som er farget blå som de er døde. Sørg for at cellen levedyktighet er over 90%.
  3. Grundig Resuspender trypsinisert HEK293S GnTI - celler i DMEM supplert med 10% FBS til en tetthet på 0,5 x 10 6 celler / ml i en engangspipette reservoaret. Omtrent 5 millioner HEK293S celler vil være nødvendig for hver plate. Hele 24 konstruksjoner kan transfekteres på hver plate ved hjelp av denne protocol.
  4. Ved hjelp av en multikanal pipette, tilsett 100 ul celler til hver brønn i en PDL-belagt plate. Resuspender celler i pipetten i reservoaret etter fylling hver plate for å sikre en jevn fordeling av celler. Inkuber cellene i et 37 ° C inkubator med 8% CO2. Etter 24 timer, bør cellene når tilnærmet 80% sammenflytning.
  5. 1 time før transfeksjon erstatte mediet. Forbered DNA-transfeksjon reagenvolumer komplekser for transfeksjon.
    1. For hver konstruksjon i SERT TC bakgrunn skal skjermes, bland 450 ng DNA med 45 ul serumfritt DMEM og bland. Legg 1,6 mL av transfeksjon reagenset til 45 ul serumfritt DMEM og bland.
    2. Umiddelbart legge fortynnet transfeksjon reagens løsning på DNA-løsning og bland. Ikke bland løsninger i omvendt rekkefølge. Vent 10 - 15 min og legge til 20 mL av transfeksjon reagens / DNA blandingen til 4 brønner.
  6. Når alle brønnene har blitt tilført, bland plate ved å riste tilbakend frem og tilbake til 37 ° C inkubator.
  7. Etter 16 - 24 timer erstatte mediet med DMEM inneholdende serum og 10 mM natriumbutyrat.
  8. Omtrent 48 timer etter transfeksjon fjerne media og enten umiddelbart videre med termo skjerm eller fryse celler ved -80 ° C som skal brukes senere. Celler kan lagres ved -80 ° C i flere uker.

2. Scintillation Proximity-basert termo skjerm med S -citalopram

  1. Inkuber cellene med 200 nM S -citalopram i 25 ul TBS (Tris-bufret saltløsning - 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) i 5 min ved RT.
  2. Oppløse cellene ved å tilsette 25 ul av 8 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranosid (C12M), 1 mM kolesteryl hemmisuccinate (CHS), protease-inhibitor cocktail (2 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinin, 4 g / ml pepstatin A, og 4 ug / ml leupeptin) i TBS, og inkubering i 1 time ved RT.
  3. Tilsett 50 mL av TBS with 20 nM [3H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% bovint serumalbumin, og 2 mg / ml His-tag affinitet scintillasjonsproksimitetsanalyse (SPA) perler på tre brønner for hver konstruksjon. For den siste brønnen legge til samme løsning oppført, men supplere med 100 mikrometer sertralin å bestemme spesifikk binding. Sørg for at Hans-tag affinitet SPA perler er grundig blandet når du legger til 96-brønns plate.
  4. Måler [3H] citalopram-binding ved hjelp av en 96-brønn-scintillasjonsteller ved RT med et 1 min telling gang per brønn. Fortsett å telle plater til totaltellinger platå (ca. etter 36 h).
  5. Varme plater i 15 minutter i en varmeblokk med en oppvarmet lokk ved 33 ° C. Måler [3H] citalopram binding igjen etter oppvarming, som beskrevet i 2.4.
  6. Gjenta trinn 2.4 til 2.5 og endre oppvarmingstrinnet til 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, og 51 ° C. Justere oppvarmingstemperatur, avhengig av den tilsynelatende smeltetemperaturen (Tm)av målproteinet og termostabiliteten av den mest stabile konstruksjonen. Fortsett å varme tallerkener til alle konstruksjoner har lave spesifikke teller.
  7. Analysere data for å bestemme Tm verdier.
    1. Bestem gjennomsnittlig tellinger per minutt (CPM) for hver konstruere for brønner som ikke inneholder sertralin ved gjennomsnitt de 3 replikere brønnene. Bestemme den ikke-spesifikke CPM som gjennomsnittet av CPM for hver brønn inneholdende sertralin i en enkelt plate.
    2. Beregn spesifikk CPM ved å trekke spesifikk CPM fra total CPM.
    3. Beregn Tm av en ikke-lineær tilpasning til en sigmoidal Boltzmann funksjon. Konstruksjoner med lav spesifikk CPM ved RT (<10% av WT) vanligvis ikke har nøyaktige Tm verdier. Mutasjoner fra de fleste termostabile konstruksjoner kan kombineres sammen og vist for additive økning i termostabilitet.

3. Expression of Human Serotonin Transporter i HEK293S GnTI

  1. Transform kjemisk kompetente DH10Bac celler med en ng plasmid.
    1. Legg plasmid til 50 ul av DH10Bac celler og inkuber på is i 30 min.
    2. Varmesjokk DH10Bac celler ved 42 ° C i 30 sek. Tilsett 200 pl av SOC-medium og inkuber ved 37 ° C i 4 timer med risting.
    3. Plate alle bakterier bort på et Luria-medium (LB) plate inneholdende 50 ug / ml kanamycin, 7 ug / ml gentamicin, 10 ug / ml tetrasyklin, 100 ug / ml 5-brom-3-indolyl β-D-galaktopyranosid, og 40 ug / ml isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG).
  2. Isolere lacZ - kolonier (hvite kolonier) dyrket ved 37 ° C i 2 dager på LB-agarplater.
  3. Vokse flere kolonier O / N ved 37 ° C i 5 ml LB inneholdende antibiotika og isolere bacmid DNA.
    1. Spinne ned bakterier ved 1000 x g i en sentrifuge i 5 min. Kast supernatant. Resuspender bakterier med 200 ul av miniprep resuspension buffer.
    2. Lyse bakterier ved å tilsette 200 ul av miniprep lyseringsbuffer og snu røret forsiktig 10 ganger. Tilsett 200 ul av nøytralisering buffer.
    3. Fjern uløselig fraksjon ved spinning ved 14 000 xg i 10 minutter i en sentrifuge. Tilsett 1 ml isopropanol for å supernatant og kjøle ved -20 ° C i 20 minutter for å utfelle DNA.
    4. Rotere ved 14 000 xg i 15 minutter i en sentrifuge og kast supernatant.
    5. Vask DNA-pellet med 70% EtOH og spinne igjen ved 14.000 xg i 15 min. Kast supernatant. Lufttørk DNA inntil alt EtOH har fordampet og resuspendert i 50 pl vann.
      MERK: bacmid DNA bør transfektert inn Sf9 celler umiddelbart for best resultat, men kan også lagres ved -20 ° C i flere uker.
  4. Transfektere bacmid DNA til 1x10 6 celler av adherent Sf9 dyrket i et fuktet kammer ved 27 ° C i en 6-brønners skål. Utføre alle cellekultur manipulasjoner i en steril laminær hette.
      <li> Ta ut mediet fra celler og tilsett 2 ml fersk Sf9 medier. Tilsett 5 ug bacmid DNA til 100 mL av Sf9 media (løsning A).
    1. Legg 8 ul av en kationisk lipid-Sf9 transfeksjon-reagens og 100 ul av Sf9 media (Oppløsning B). Inkuber rør inneholdende Oppløsning B i 5 min.
    2. Bland rør inneholdende Løsning A Løsning B med og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter og tilsett alt av oppløsningen til Sf9-celler.
    3. Etter 96 timer ble supernatant-avling (P1-viruset) ved passering gjennom et 0,2 um filter. P1 viruset kan lagres i flere måneder ved 4 ° C i mørke og gjenbrukes for å gjøre P2 virus etter behov.
  5. Tilsett 100 ul av P1 virus til 1 liter av Sf9-celler ved en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml i Sf9 media. Infisere celler i 96 timer, vokser ved 27 ° C på en ristemaskin ved 100 rpm.
  6. Spinne ned celler i en sentrifuge ved 4000 xg i 15 min og filter supernatant inneholdende viruspartikler gjennom et 0,2 um filter. Kast celle pellet. Determine viral tetthet ved hjelp av en viral plakkassay eller et virus teller. Viruset Tettheten bør være> 1 x 10 8 viruspartikler per milliliter. P2 virus kan lagres ved 4 ° C i mørke og brukt i flere måneder.
  7. Infisere 10 L av HEK293S GnTI - celler 7 som vokser i suspensjon ved 37 ° C med 8% CO2 og 85% fuktighet i et risteapparat ved 130 rpm i 293 ekspresjons media supplert med 2% FBS ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 2 og en tetthet på 3 x 10 til 6 celler / ml, typisk 30 - 50 ml av P2-virus pr 800 ml av celler i en 2 liters kolbe forvirret.
    MERK: Det anbefales ikke å bruke mer enn 80 ml av P2-viruset siden HEK293S GnTI - celler vil vokse sakte og kan bli unviable grunn av en endring i pH. Sf9 media er surere enn 293 uttrykk media.
  8. Av 12 - 16 timer etter infeksjon, tilsett natriumbutyrat til en konsentrasjon på 10 mM av en 1 M lager. 48 - 60 timer etter infeksjon, slakte cellene ved sentrifugering i4000 x g i 15 min. Fjern supernatanten.
  9. Resuspender celler i 150 ml TBS, 2 mikrometer S -citalopram eller andre Sert hemmere og oppbevares ved -80 ° C til de er klare for rensing.

4. Affinitetsrensing av Serotonin Transporter for immunisering og Krystallisering

  1. Tine-celler fra 10 L av kulturen i varmt vann (ca. 30 ° C), og resuspenderes ved raskt å passere gjennom en 10 ml pipette til homogen tilstand.
  2. Fremstille vaskemiddeloppløsning for oppløsning (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl inneholdende 40 mM C12M, 5 mM CHS, og protease-inhibitor cocktail.
  3. Legge til alle cellene i et beger med en rørestav og legge til alle vaskemiddeloppløsning til cellene under omrøring. Oppløseliggjøre ved 4 ° C i 1 time under omrøring.
  4. Spinne løsningen ved 8000 xg i 15 min ved 4 ° C. Kast pellet og dekanter supernatanten i rene ultrasentrifuge rør. Spin på 100 000 xg i 1 time i en ultracentrifuge. Kast pellet og filter supernatanten gjennom et 0,2 mikrometer filter.
  5. Lysatet passere over 10 ml Strep affinitet harpiks pakket i en kolonne ved bruk av en peristaltisk pumpe ekvilibrert med vaskebuffer: 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glycerol, 25 mM lipid (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero- 3-fosfokolin, 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine, og 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoglycerol ved et molart forhold på 1: 1: 1), og ett iM S -citalopram eller SSRI i TBS.
  6. Koble Strep affinitetskolonne til en Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system og vaske kolonnen med 2 ml / min med 66 ml (6,6 kolonnevolumer) i vaskebuffer. Elute rensede proteinet i samme buffer supplert med 5 mM desthiobiotin ved 0,5 ml / min ved anvendelse av 33 ml (3,3 kolonnevolumer) av buffer. Samle 1 ml fraksjoner; toppfraksjonene blir ~ 10 ml. Renset protein kan bli lagret ved 4 ° C i 2 - 3 d hvis ønskelig.
    MERK: Totalt utbytte vil være 3 -4 mg Sert CC og 1 mg Sert IC. En absorbans på 2 AU ved 280 nm er lik 1 mg / mL Sert.

5. Tilberedning av Transporter inn i liposomer for Immunization

  1. Forbered liposomer som inneholder asolectin: kolesterol: lipid A: hjerne polare lipid (molforhold 60: 17: 3: 20). Oppløs lipider i 1 ml kloroform og tilsett 40 mg av total lipid i en 100 ml glassrundkolbe ved den angitte molforhold.
    1. Fordampe kloroform i minst 1 time under vakuum med den rundbunnet kolbe som roterer i varmt vann, ca. 30 ° C.
    2. Rehydrere lipider ved tilsetning av 10 ml TBS. Inkuber i buffer i 10 min.
    3. Fryse lipid ved å plassere kolben i flytende N2.
    4. Smelte. Dyppe sfærisk bunnen av kolben i et begerglass fylt med varmt vann, ca. 30 ° C. Sonikere i et bad sonikator i 5 minutter.
    5. Vortex og gjenta trinn 5.1.3 - 5.1.4 10 ganger eller inntil lipider fullstendig resuspendert fra bunnen og danner en uklar suspensjon.
    6. Extrude hele lipid blandingen to ganger gjennom 200 nm filtre. Den lipid vil vises som en melkeaktig suspensjon før ekstrudering; etterpå vil den bli gjennomskinnelig. Ikke legg hele lipid blandingen til ekstruderen samtidig som det kan bli tett, noe som resulterer i tap av prøven.
    7. Spin lipider ved 100.000 xg i 20 min og resuspendert i 0,5 til 1 ml TBS ved en konsentrasjon på 40 mg / ml.
  2. Konsentrer renset SERT IC til 250 - 500 ul ved bruk av et 100 kDa MWCO sentrifuge-konsentrator-proteinet til 2 - 4 mg / mL, og mette liposomer med 5 mM C12M. Legg renset Sert på vaskemiddel: lipid blanding i 1 ml sluttvolum.
  3. Fjern C12M ved 3 suksessive tilsetninger av 80 mg / ml hydrofobt absorpsjon harpiks. For de første 2 tilsetninger, inkuber med harpiks med rotasjon i 2 timer ved 4 ° C. Fjern harpiksen ved å passere gjennom glassull. Utfør den endelige inkubasjon med harpiksover natten.
  4. Konsentrer proteoliposomes ved sentrifugering ved 100 000 xg i 20 min. Kast supernatant og resuspender pellet i 250-500 mL TBS.
  5. Tilsett 10 pM sluttkonsentrasjon på S -citalopram til det rekonstituerte protein etter den siste fjerning av harpiks.
  6. Oppløse 2,5 mL av de proteoliposomes i SDS-PAGE ladningsbuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromfenolblått, 100 mM DTT), og kjørt på en SDS-PAGE-gel ved 200 V i 1 time for å sikre at SERT har blitt rekonstituert. Proteoliposomes kan oppbevares ved -80 ° C i alikvoter for langtidslagring og tint på is før hver immunisering.

6. Screening for antistoffer som gjenkjenner 3D-epitoper

  1. Skjerm hybridoma cellelinjer av western blot. Antistoffer som gjenkjenner Sert av western blot sannsynlig binde lineære epitoper og vil trolig ikke være nyttig for strukturelle studier.
    1. Bland 1 mikrogram av purifiered SERT IC eller SERT CC og kjørt på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel ved 200 V i 1 time.
    2. Overfør til en nitrocellulosemembran ved 200 mA i 30 minutter ved hjelp av Towbin-buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% (v / v) metanol, 0,1% SDS). Membranen kan tørkes og lagres på ubestemt tid ved værelsestemperatur.
    3. Gjenfuktning membran med 10% metanol, og vask med PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
    4. Blokk med 5% tørrmelk i PBS i 30 minutter ved romtemperatur.
    5. Vask med PBS og inkuberes med 1 ug / ml antistoff i PBS med 0,1% melk.
    6. Vask grundig med PBS inneholdende 0,1% Tween-20.
    7. Inkuber med geit-anti-mus-antistoff konjugert til et IR-fargestoff fortynnet 1: 10.000 i PBS med 0,1% Tween 20 og 0,1% melk.
    8. Vask grundig og skanne med et bildebehandlingssystem.
  2. Bland hybridom supernatant inneholdende vestlige negative antistoffer med 100 nM SERT CC-protein ved hjelp av et molart forhold på 1: 2 (SERT: mAb) i 200 mL TBS med 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, og 1fiM S -citalopram. Sentrifuger ved 100.000 xg i 20 min. Analyser supernatant inneholder Sert-mAb komplekser og analysere ved fluorescens-påvisning Size Exclusion Chromatography (FSEC) 8. Kast pelleten.
    1. Drevet 100 ul av supernatanten på en størrelseseksklusjonskolonne ved 0,5 ml / min ved hjelp av en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) system utstyrt med en fluorescensdetektor (Eksitasjon: 480 nm, emisjon: 510 nm) ved anvendelse av en buffer inneholdende TBS, 0,4 mM lauryl maltose neopentylglykol, og 1 pM S -citalopram. Antistoffer som danner komplekser vil bevirke at GFP-fusjonsprotein for å eluere tidligere enn den frie transportøren fra den størrelseseksklusjonskolonne.
    2. Spe komplekser til 10, 1, 0,1 nM i 200 mL TBS med 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, og 1fiM S -citalopram og reprise FSEC. Antistoffer som fortsatt kan skifte transportør peak ved lave nanomolare konsentrasjoner erhøy affinitet permer og gode kandidater for strukturelle studier.
  3. Test på nytt binding av FSEC i nærvær av 1 mM serotonin. Antistoffer som spesifikt gjenkjenner SSRI bundet konformasjon vil ikke binde i nærvær av substratet. Antistoffer som gjenkjenner en 3D-epitop som ikke endrer seg som et resultat av konformasjon vil binde uavhengig av ligand til stede.
  4. Bland parvise ulike kombinasjoner av antistoffer og teste binding av FSEC. Antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper vil føre SERT å elueres tidligere, når den kombineres sammen i forhold til bindingen av et enkelt antistoff.
  5. For første strukturelle studier, velger de høyeste affinitet antistoffer som gjenkjenner 3D-epitoper.

7. Expression of antistoffragment i Sf9 Cells

  1. Clone variable og konstante domener av Fab ved PCR inn i insekt ekspresjonssystemet for ekspresjon i Sf9-celler under anvendelse av standardprotokoller.
  2. Transfektere 1 x 10 6 Sf9-celler med 5 ug bacmid DNA som koder for de lette og tunge kjeder av de 8-His merket 8B6 Fab med en GP67 sekresjon sekvens (som angitt i del 3.4).
  3. Avling P1 virus 96 t posttransfection og tilsett 500 ul av P1 virus til 1 liter av Sf9-celler ved en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml i en 2 liters kolbe for å gjøre P2 virus. Infisere celler i 96 timer ved 27 ° C.
  4. Harvest-P2 virus (som angitt i del 3.6).
  5. Infisere 6 L av Sf9-celler ved en tetthet på 2 - 3 x 10 6 celler / ml med en MOI på 2 med P2-viruset, vanligvis 40 - 50 ml pr flaske med 1 liter av Sf9-cellene i hver 2 L kolbe.
  6. Høste celler ca 96 h postinfection. Tilsett 50 ml fosfatbuffer, pH 8 ved en sluttkonsentrasjon på 50 mM til cellene og sentrifugering ved 4000 xg i 20 min. Kast cellepelleten og filter supernatanten gjennom et 0,2 um filter tangensiell-strømningscelle. Samle supernatanten og oppbevares ved 4 ° C i 2 - 3 dager hvis ønskelig.

  1. Konsentrer Sf9 supernatant ved hjelp av en 30 kDa Molekylvekt Cut Off (MWCO) tangential strømningscellen til ca 400-800 ml.
  2. Legg imidazol, pH 8 ved en sluttkonsentrasjon på 10 mM og 10 ml His-tag affinitet harpiks. Rør i et begerglass i 1 time ved 4 ° C.
  3. Samle His-tag affinitet harpiksen ved sentrifugering ved 2000 xg i 5 min. Kast supernatant.
  4. Pakk His-tag affinitet harpiks i en kolonne og koble til en FPLC.
  5. Vask His-tag affinitet harpiksen ved 2 ml / min med 66 ml (6,6 kolonnevolumer) av 50 mM fosfat pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol.
  6. Elute 8B6 Fab i 33 ml 50 mM fosfat pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazol. Samle 1 ml fraksjoner.
  7. Fortynn affinitetsrenset Fab med et 10 gangers volum av iskald 20 mM acetat, pH 5.
  8. Fab bindes til en 1 ml kationbytter-kolonne under anvendelse av en peristaltisk pumpe ved 1 ml / min.
  9. Separate Fab ved bruk av en 30 ml linøre gradient av NaCl (0-500 mM) i 20 mM acetat, pH 5,5 ved anvendelse av en FPLC. Fab vil eluere som en enkelt topp ved ~ 300 mM NaCl.
  10. Analyser på en 12,5% SDS-PAGE-gel ved bruk av prøvebuffer inneholdende 100 mM DTT. De tunge og lette kjeder av 8B6 Fab vil kjøre på 27 og 25 kDa, respektivt, på en reduserende SDS-PAGE-gel.
  11. Pool fraksjoner inneholdende Fab og konsentrer til minst 10 - 15 mg / mL ved å bruke et 30 kDa MWCO-protein konsentratoren i en svingende spann sentrifuge ved 3000 x g.
  12. Juster til pH 8 ved tilsetning av 1 M Tris pH 8 til en endelig konsentrasjon på 50 mM og lagre renset Fab for lang sikt ved 4 ° C. Totalt utbytte vil være 25 - 30 mg. En absorbans på 1,4 ved 280 nm AU er lik 1 mg / ml av 8B6 Fab.

9. Dannelse av Transporter-antistoff komplekser og separasjon etter størrelse Exclusion Chromatography

  1. For krystallisering, rense Sert CC av streptokokk affinitetskromatografi i C12M som beskrevet tidligere (kapittel 4).
  2. Bland konsentrert SERT med Fab ved et molart forhold på 1: 1,2 i et volum mindre enn 500 pl. Sentrifuger ved 100 000 xg ved 4 ° C i 20 min. Samle supernatanten inneholder Sert-Fab kompleks. Forkast pellet.
  3. Atskilt ved Size Exclusion Chromatography (SEC) ved anvendelse av en FPLC på en størrelseseksklusjonskolonne ekvilibrert i TBS supplert med 40 mM n-oktyl-β-D-maltosid (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glycerol, 25 mM lipid (samme som i trinn 4.5), og 1 pM S -citalopram ved 0,5 ml / min.
  4. Samle 0,5 ml fraksjoner og analysere på 4 - 15% SDS-PAGE-geler, så vel som av tryptofanfluorescens ved SEC. GFP tagget Sert vil kjøre på ca 80 kDa på SDS-PAGE gel. Etter fjerning av termini og N-koblede sukker vil det kjøres som en 45 kDa protein.
  5. Determine hvilke fraksjoner å kombinere ved å samle bare de fraksjoner som er monodisperse som vurdert ved analyse av fraksjonene av tryptofanfluorescens SEC (Eksitasjon: 280, emisjon: 335 nm).
  6. Oppbevares renset Sert-8B6 kompleks ved 4 ° C i opp til en uke.

10. Krystallisering av Transporter-antistoff komplekser ved henging Drop

  1. Før krystallisering, konsentrere toppfraksjoner fra SEC separasjon av SERT-8B6-komplekset til 2 mg / ml ved anvendelse av en 100 kDa MWCO sentrifuge-protein konsentratoren. En absorbans på 2 AU ved 280 nm er lik 1 mg / ml.
  2. Legg til ekstra Fab i forholdet 1: 0,05 kompleks: gratis Fab. Tilsett 10 mikrometer gratis S -citalopram.
  3. Sentrifuger ved 100 000 xg ved 4 ° C i 20 min. Samle supernatanten inneholder Sert-Fab kompleks. Forkast pellet.
  4. Sett opp en hengende dråpe 24-brønns skjermen ved 4 ° C i henhold til tabell 1. Grow diffraksjon kvalitet krystaller løpet reservoar løsningerinneholdende 100 mM tris-NaOH, pH 8,5, 25 til 125 mM KCl, 32,5 til 34% PEG 400, og 0,5% 6-aminoheksansyre.
    MERK: Bruk Tris justert med NaOH til pH 8,5 som en buffer. Ikke bruk Tris-base justeres med HCl. Skjermen kan fremstilles i 2 ml rør og brukes inntil ferdig. Ta vare å nøyaktig pipette PEG 400 ved hjelp av en positiv forskyvning pipette som det er ekstremt tyktflytende!
    1. Pipetter 500 mL av hver reservoarløsningen i en lav profil 24-brønns plate med tetningsmasse påført til hver brønn. Pipetter 1,5, 1,75 og 2 mL av Sert-8B6 kompleks på en 18 mm silikonisert glass dekkglass. Pipetter en mL av forrådsløsningen på toppen av proteinprøven.
      MERK: Platen ble kjøpt med fugemasse allerede søkt til randen av brønnene.
    2. Gjelder deksel skyv til 24-brønners med dråpene som vender mot forrådsløsningen og forsegle umiddelbart ved å trykke dekkglass på tetningsmasse forhånds påført til hver brønn.
    3. Fortsett til alle 24-brønner har blitt satt opp. La den ferdige platen i et godt isolert rom ved 4 ° C. Ikke forstyrr plater i minst 3 dager
      MERK: Enkelt krystaller vil vises i ca 3 dager, og vokse til 100-175 nm etter 14 dager.
  5. Slakte krystaller i cryoloops og direkte flash-cool i flytende N2 før røntgendiffraksjon datainnsamling.
  6. Hvis det er nødvendig, finne flere krystallisering forholdene ved bred screening med hengende dråper. Bruke tre dråper med proteinfellingsmiddel: forhold på 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Hvis en robot er tilgjengelig, og deretter sette opp 100-150 nL faller over 70 mL av reservoaret løsning i en 96-brønns plate. Større 3D-krystaller kan dyrkes i 24-brønner.
  7. Resultat basert på utseendet på rulle: 0, klart; 1, støv; 2, granulat bunnfall; 3, faseseparasjon; 4, mikrokrystallinsk; 5, nåler; 6, plater; 7, 3D-krystaller.
  8. Sett opp krystallisering ved henging slipp metoder i 24-brønner som beskrevet ovenfor rundt nylig identifiserte dirigentitions.

Representative Results

Et bibliotek av enkle punkt mutanter i Sert TC bakgrunn ble opprettet for å skjerm for thermostabilizing mutasjoner. Individuelle mutanter ble generert ved hjelp av standard mutagenese. Screeningen protokoll benytter transient transfektert HEK293S celler og en scintillasjons nærhet basert termostabilitet skjermen for å hurtig identitet nyttige mutasjoner for krystallisering som skissert i figur 1A. Plotting Tm-verdier versus bundne [3H] citalopram ved RT avdekker konstruksjoner med høy termostabilitet og ekspresjonsnivåer egnede for proteinrensing (figur 1B). Tre mutanter (Y110A, I291A, og T439S) ble kombinert for å generere en meget stabil konstruksjon (figur 1C). Termostabilitet er også korrelert med økt stabilitet i kortkjedede vaskemidler som er nødvendig for krystallisering av SERT-Fab-komplekset.

Det store omfanget uttrykk for menneskelig Sert hjelp baculovirus-transduced HEK293S GnTI - celler kan ta mindre enn 2 uker, og kan produsere milligram-mengder, som vist i figur 2A. Bruk av GFP-merket Sert CC protein gjør Sert å være beleilig følges under uttrykk og rensing av fluorescens (figur 2B). Vår strategi involvert rensning 1) oppløsning av SERT bundet til S -citalopram fra HEK293S GnTI - celler i C12M i nærvær av CHS som en stabiliserende lipid; 2) binding av Sert til en streptokokk affinitet matrise; 3) fjerning av forurensende proteiner etter omfattende vask; og 4) eluering av det funksjonelle SERT med buffer inneholdende desthiobiotin (figur 2C). Det eluerte proteinet er stort sett fritt for andre påvisbare proteiner ved Coomassie blå farging og monodisperse som bedømt ved FSEC (figur 2D, E).

En liknende strategi ble tatt for å rense SERT med en streptokokk II-kode som ble brukt til reconstitution og immunisering (figur 3A, B). Inkorporering av SERT inn proteoliposomes øker halveringstiden i serum og stabilitet av SERT og forbedrer sannsynligheten for isolering av antistoffer med høy affinitet. Videre inkludering av lipid A, en bestanddel av bakteriecelleveggen, tjener som en potent adjuvans 9. Multilamellære liposomer ble fremstilt ved tilsetning av buffer til en tørkede lipidblandingen i glassrør og slemmet opp igjen i buffer. Ekstrudering av liposomene gjennom 200 nm porestørrelse filter frembringer monodisperse unilamellære liposomale suspensjoner. Liposomene blir så mettet med rengjøringsmiddel etterfulgt av tilsetning av renset Sert i vaskemiddel. Til slutt blir vaskemiddel fjernes ved tilsetning av hydrofobe absorpsjonsharpiks til lipid: blanding vaskemiddel. Ytterligere ligand bør tilsettes til den rekonstituerte prøve for å velge antistoffer som gjenkjenner det antidepressive bundet konformasjon. Tilstedeværelsen av Sert i proteoliposomes bør bekreftes avoppløsende en liten prøve med SDS-PAGE lasting fargestoff eller C12M og kjører på SDS-PAGE og FSEC (figur 3C, D).

Hybridom-cellelinjer som uttrykker SERT antistoffer kan screenes for høyaffinitets-bindemidler som gjenkjenner 3D-epitoper. Disse egenskapene er avgjørende for eventuell suksess for krystallisering, som antistoffet må forbli fast bundet til en strukturert regionen for å fremme krystall pakking av homogene, velordnet domener. I det første trinnet, blir antistoffer som gjenkjenner ustrukturerte regioner identifisert. Sert er denaturert og blottet på en nitrocellulosemembran; antistoffer som binder denaturert Sert vil være western-positive og sannsynlig gjenkjenne lineære epitoper. I figur 4A, viser vi 2 eksempler på antistoffer som er western-positive og sannsynligvis ikke nyttig å fremme crystallogenesis. I figur 4B, blir de gjenværende western-negative antistoffer inkubert med 100 nM SERT-GFP og separert vedFSEC. Antistoffer som binder Sert vil skifte GFP-positive topp til en tidligere stilling. De Sert-antistoffkomplekser kan fortynnes videre i vaskemiddel for å finne ut om de kan binde seg med nanomolar affinitet etterfulgt av analyse av FSEC. Tilsetning av serotonin fører til konformasjonsendringer i transportøren og dermed antistoffene kan bli screenet på nytt for å bestemme om de kan spesifikt gjenkjenne SSRI-bundet konformasjon. I figur 4C, blir antistoffene vist å binde SERT i nærvær av serotonin, som viser at epitopen (e) ikke endrer fra SSRI til underlaget bundet tilstand. Til slutt, i figur 4D kombinasjoner av antistoffer testet for deres evne til å binde distinkte epitoper, noe som resulterer i en ytterligere bevegelse mot venstre. Her 15B8 eller 8A11 antistoffene gjenkjenner en epitop som er forskjellig fra 8B6.

Den 8B6 antistoff ble valgt for videre strukturell analyse basert på foreløpige krystall screening med papain treated Fab. Genene av 8B6 Fab ble klonet inn i et insektcelle ekspresjonsvektor. Fab kan bli uttrykt og utskilt fra Sf9-celler som vokser i suspensjon. Den 8B6 Fab kan bli renset fra Sf9 celle supernatanten ved His-tag affinitet (figur 5A, B) og kationebytter-kromatografi (figur 5C, D) som resulterer i protein som synes fri for forurensninger på SDS-PAGE-geler. I figur 5E, blir det rekombinante 8B6 Fab vist å binde SERT og anvendes i de følgende biokjemiske og biofysiske eksperimenter.

Den affinitetsrenset SERT CC blir spaltet med trombin og EndoH og blandet med 8B6 Fab for å danne et kompleks i nærvær av S -citalopram. Transportøren-antistoff-komplekset ble deretter separert ved SEC i C8M (figur 6A), og toppfraksjonene inneholder både SERT og Fab, som vist ved SDS-PAGE (figur 6B). Bruk av C8M er avgjørende for krystalldannelse sannsynligvis fordikort kjede vaskemiddel gir bedre pakking mellom molekyler i krystallgitteret. FSEC anvendes for å bestemme hvilke fraksjoner som skulle være felles for krystalliseringen (figur 6C); Fraksjonene som ikke er monodisperse og / eller inneholder store mengder fri SERT eller Fab bør ikke kombineres.

Prismeformede Sert-antistoff krystaller kan dyrkes i nærvær av S -citalopram bruke denne protokollen ved henging slipp damp diffusjon (figur 7A). De resulterende krystaller diffract X-stråler til en oppløsning av 3,15 Å 10 (figur 7B).

Figur 1
Figur 1: Scintillation Proximity Assay-baserte termostabiliteten A.. Oversikt over protokoll for screening termostabilitet i nærvær av [3H] citalopram. B. Maksimal bundet [3 (Tm). Stiplede linjene representerer verdier for WT transporter. De 3 mest termostabile mutanter er merket. Grey området representerer mutanter som har mindre enn 10% av [3H] citalopram-binding i forhold til WT og således unøyaktige Tm-verdier på grunn av et lavt signal-til-støy. C. Termo kurver for WT Sert TC og de 3 beste mutanter. Feilfelt representerer standardavvik (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Oversikt over Pattedyr heterologe Protein Expression A.. Skjematisert oversikt over BacMam virus generasjon og uttrykk for Sert i HEK293S GnTI -. Celler B. HANK293S GnTI - celler som uttrykker Sert CC (GFP fluorescens) C.. Elueringsprofilen Sert CC på Strep affinitet harpiks. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av desthiobiotin, 0 - 100% (0-5 mm) D.. Analyse av affinitetsrenset Sert CC på en 4-15% SDS-PAGE gel E.. FSEC av affinitetsrenset Sert CC oppdaget av GFP fluorescens (Eksitasjon: 480 nm; Emisjon: 510 nm). Toppen eluere på 15 ml er Sert (#) og 18 ml er gratis GFP (*). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Representant Affinity Rensing og Tilberedning av Sert IC A.. Skjematisk oversikt av antistoffgenerering. <strong> B. Elueringsprofil observert ved 280 nm av affinitetsrensing av SERT IC på Strep affinitet harpiks. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av desthiobiotin, 0 - 100%. (Til 0 - 5 mM) C. Analyse av affinitet renset og rekonstituert Sert på en 4-15% SDS-PAGE gel D.. FSEC av oppløste Sert etter rekonstituering. Fluorescens av tryptofan rester ble brukt til å oppdage Sert (Eksitasjon: 280 nm; Emisjon: 335 nm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Analyse av Representative Sert Antistoffer A. Screening av antistoffer ved Western blot. Omtrent 1 pg SERT CC med eller uten GFP ble applisert på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel og blottet på en nitrocellulosemembran. Binding ble påvist ved anvendelse av et geite-anti-mus-antistoff konjugert til IR Dye. 2G4 og 10F2 er vestlige positive. B. Binding av antistoffer til 100 nM GFP-merket Sert og deteksjon av FSEC oppdages ved hjelp av GFP fluorescens. C. Binding av utvalgte Fab-fragmenter til 100 nM GFP-merket SERT i nærvær av 1 mM serotonin. D. Binding av 8A11 eller 15B8 Fabs til Sert-8B6 Fab. Mindre elueringstoppene på 18 ml er gratis GFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Representative Rensning av 8B6 Fab fra Sf9-celler A.. Elueringsprofil observert ved 280 nm for rensing av 8B6 Fab ved His-tag affinitet Chromatogr hy. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av imidazol, 0-50% (0-250 mM) B.. Ikke-reduserende og redusere SDS-PAGE gel etter His-tag affinitet rensing. Protein som går nær 50 kDa kan ikke redusert Fab (#) og mindre arter på 25 kDa er redusert Fab (*). C. Elueringsprofil observert ved 280 nm for rensing av 8B6 Fab med kationerbytte å vise en enkelt symmetrisk topp som eluerer under en lineær gradient natriumklorid. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analyse av 8B6 Fab på en 12,5% SDS-PAGE-gel etter rensing ved kationbytting. E. Binding av 8B6 Fab til 10 nM GFP-merket Sert, oppdaget ved hjelp av fluorescens fra GFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

e 6 "src =" / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
Figur 6: Representant Gelfiltreringskromatografi av Sert-8B6 Complex i nærvær av S -citalopram A.. Gelfiltrering elueringsprofilen renset SERT-8B6-komplekset. Hoved topp eluere på 11,5 ml er Sert-8B6 kompleks. Topp på 15-17 ml inneholder GFP og Fab B.. Analyse av det rensede SERT-8B6-komplekset på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel. Posisjonene til SERT og de tunge og lette kjeder av Fab-er vist med en strek. C. FSEC av størrelsesseparert fraksjoner. Sert-8B6 komplekser ble oppdaget ved hjelp av tryptofan fluorescens. Fraksjon 17 inneholder en større mengde Sert som ikke kompleks med Fab. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7 Figur 7: Krystallisasjon av SERT-8B6-komplekset bundet til S -citalopram A.. Lysmikroskopi av parallellepiped formede krystaller av Sert-8B6 kompleks etter 2 uker med vekst. Scale bar tilsvarer 200 mikrometer. B. Sert-8B6 krystaller diffract røntgen for å 3,15 Å. Blå ring representerer 3,15 Å. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1:. En Krystallisering Screen for Sert-8B6 Complex Bundet til S -citalopram Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Fastsettelse av membranproteinstruktur ved biofysiske teknikker fortsatt en skremmende oppgave for mange medisinsk betydelige transportører, reseptorer, og kanaler 11. Her deler vi detaljert kunnskap utviklet for strukturbestemmelse av den menneskelige serotonin transporter bundet til S -citalopram. Vi forventer at disse metodene vil være nyttig for å bestemme strukturer av Sert i andre konforme stater samt strukturer i andre vanskelige membran proteiner. Videre kan de biokjemiske teknikker som beskrives her også brukes til å studere funksjonen av renset SERT i vaskemiddel og en tilnærmet opprinnelig lipid miljø.

Sert krystallisering hengslet på utviklingen av flere verktøy og teknikker. Først forbedringer i transporter termo produsert Sert varianter som var veloppdragne i ulike vaskemiddel miceller etter ekstraksjon av transporter fra membraner 6. For det andre, brukav høyaffinitets-ligand S -citalopram hele rensing og krystallisering ytterligere forbedret stabilitet og redusert conformational heterogenitet. For det tredje, utvikling av BacMam ekspresjonssystemet 7 åpnet for produksjon av store mengder SERT i en kort periode på 2 uker, fasiliterer både immunisering og krystallisering. Til slutt, til utvikling av strategier selektere for høy-affinitets antistoffer som gjenkjenner epitoper 3D tillatt for oppdagelsen av 8B6-antistoffet som fremmer velordnet pakking av SERT-antistoffkomplekser til krystaller.

Det finnes en rekke kritiske trinn og reagenser, så vel som vanlige problemer som ofte forekommer i løpet av protokollen. For det første kan generering av høy titer SERT P2 virus være problematisk. Legge til lave konsentrasjoner av P1 virus å generere P2 virus som beskrevet i denne protokollen begrenser vanligvis dette problemet, og i tilfeller der P2 virustiter er lav, kan P3 virus gjøres using virus ved en MOI på 0,0001. Virus med en titer mindre enn 1 x 10 8 viruspartikler / ml bør ikke brukes, og vil nesten alltid resultere i lave utbytter protein. For uttrykk, HEK293S GnTI - celler ble valgt fordi de mangler N -acetylglucosaminyltransferase Jeg aktivitet og dermed kan ikke syntetisere komplekse N -glycans, i stedet produserer bare høy mannose N -glycans. EndoH kløyver N -bundne glykosylering av høye mannose glykaner på to steder i ekstracellulære sløyfe 2 (EL2), forlater en N -acetylglucosamine knyttet til asparagin. Fordøyelse av N -bundne sukker reduserer overflate entropien av EL2 som sannsynligvis viktig for krystallisering. For generering av antistoffer, må SERT IC bli brukt for immunisering. GFP er sterkt immunogent 12 og bør ikke brukes som en fusjon signal for å generere antistoffer, siden det er vanskelig å fjerne ved SEC. Den fleksible N- og C-terminalen av Sert var heller ikkesom inngår i konstruksjonen, for å unngå antistoffer mot disse regionene. Mus kan immuniseres med 30 ug rekonstituerte protein; fortsette immuniserer mus inntil høye serumkonsentrasjoner av antistoffer kan påvises og fremstille hybridomceller, som beskrevet 13. En thermostabilized konstruksjon er vanligvis det beste valget for immunisering; hvis transporter er veloppdragen og beholder biologisk aktivitet etter rensing, er dette ofte tilstrekkelig til å danne antistoffer. Den 8B6 antistoff ble reist mot WT Sert. For krystallisering, bør bare toppfraksjonene fra SEC som inneholder monodisperse komplisert som bedømmes av FSEC kombineres og konsentrert. Sert-8B6 krystaller vokser i et smalt spekter av tilstander, og det finnes en rekke tiltak som bør iverksettes for å feilsøke problemer spesielt knyttet til Sert krystallvekst. Tris-base justert med HCl bør ikke brukes i reservoaret løsning, da denne bufferen tillater ikke krystallvekst; det er derfor critiske til stedet bruke Tris justert med NaOH. SERT krystaller vokse i et smalt konsentrasjonsområde av PEG 400, slik at hvis krystaller ikke vokse eller hvis mange små krystaller viser seg, vil selv en liten økning eller minskning i PEG 400-konsentrasjonen være oppmerksom på. Videre kan additivet 6-aminoheksansyre ble også brukt i den optimerte skjermen for å forbedre kjernedannelse. Dråpen Forholdet mellom protein: vel løsningen er også en viktig avgjørende faktor for krystallvekst. Drop forholdstall på 1,5 til 2: 1 er anbefalt, med drop forholdstall nærmere 2: en typisk støtte veksten av større tre-dimensjonale krystaller. Endelig er bruken av lav profil 24-brønners plater også avgjørende mot krystallvekst, sannsynligvis på grunn av endring av hastigheten av dampdiffusjon.

En alternativ tilnærming til SPA-metoden har blitt utviklet for å skjerm for mutanter som stabiliserer rotte serotonintransportøren i en kokain-bundet konformasjon ved bruk av filterbindingsbestemmelse 5. I motsetning SPA-based-analyse gjør det mulig for sekvensielle oppvarmingstrinn etter ved bestemmelse av den fraksjon av SERT som forblir bundet til ligand. Således gir mulighet for den raske bestemmelse av smeltetemperaturen fra et lite antall prøver. SPA-metoden er avhengig av tilgjengeligheten av en radiomerket ligand med høy affinitet og hvis ingen ligander er kjent som binder med submicromolar affinitet deretter en annen løsning vil være nødvendig. Mange andre fremgangsmåter blir ofte brukt til å måle proteinstabilitet, for eksempel binding av fluorescerende fargestoffer og kalorimetri 14 men er lav gjennomstrømming og er enten ikke i stand til direkte å måle funksjon eller kreve store mengder protein. Hvis ikke kan anvendes SPA-metoden, er en alternativ high-throughput tilnærming en FSEC-baserte termostabilitet Assay 15 (FSEC-TS), hvor prøven blir oppvarmet etterfulgt av separering av den fraksjon av gjenværende transporter. FSEC-TS er en nyttig tilnærming for å få tilgang kromatografisk oppførsel og oligomere staten og er apowerful komplementærverktøy som kan brukes sammen med SPA-metoden.

En sammenligning av ulike felles protein uttrykk systemer ble også funnet å favorisere bruk av pattedyrceller for Sert uttrykk 16 og rask dette er trolig tilfelle for mange proteiner av opphav hos pattedyr. Metodene som vi har brukt for uttrykket er skreddersydd for Sert men sannsynligvis lett tilpasses. Betingelser som favoriserer høye nivåer av ekspresjon bør være nøye identifiseres ved å variere tidspunktet for ekspresjon, temperatur, viruskonsentrasjon, og nærværet av histondeacetylase inhibitorer slik som natriumbutyrat.

Vi vanligvis favorisere affinitetsrensing i en mild langkjedet vaskemiddel som C12M sammen med CHS før rekonstituering for å beholde høy affinitet ligandbinding. Rekonstituering ved hjelp av hydrofob absorpsjon er en mild teknikk som vi har funnet å være effektive for flere andre transportører og reseptorer. Hvis detteer ikke vellykket, fjerning av vaskemidler med høye kritiske micelle konsentrasjon av dialyse, fortynning, eller SEC kan være ansatt 17 forutsatt at antigenet er tilstrekkelig stabilt i slike vaskemidler. I tilfeller der det ikke egnede antistoffer er funnet, vi nesten alltid finne problemet skyldes tap av funksjon eller denaturering av antigen og i slike tilfeller vi vellykket utført nye vaksinasjoner betalende spesiell oppmerksomhet til protein biokjemi. Til slutt bør ligander og antistoffer som binder med høy affinitet danne grunnlag for et rasjonelt planlagt krystallisering eksperiment og ved å ta fordel av en termostabil variant, kan man screene et bredere spekter av tilstander ved å variere egenskapene til forskjellige vaskemidler. Videre krystallisering i et lipid mesofase 18 eller ved hjelp av bicelles 19 bør alltid betraktes som et alternativ til krystallisering i miceller.

Disse prinsippene og metoder kan brukes med noen modifikation for mange andre transmembranproteiner som er vanskelig å uttrykke og rense fra andre ekspresjonsverter, og vil være spesielt nyttig for strukturbestemmelse av mål med høy affinitet legemidler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).
  7. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Tags

Biokjemi strukturbiologi krystallisering membran protein antistoff immunisering tilberedning serotonin transporter nevrotransmitter antidepressiva selektive serotonin reuptake inhibitor termostabilitet
Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coleman, J. A., Green, E. M.,… More

Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter