Summary
Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.
Abstract
O transportador da serotonina é um transportador de sódio e acoplado a cloreto de que "bombas" de serotonina extracelular em células. -citalopram S é um medicamento utilizado para tratar a depressão e ansiedade através da ligação ao transportador da serotonina com alta afinidade, bloqueando a recaptação de serotonina. Aqui nós relatamos um procedimento eficiente e um conjunto de ferramentas para estabilizar, expresso, purificar e cristalizar serotonina complexos transportadores de anticorpos ligados a S -citalopram e outros antidepressivos. Mutações que estabilizam o transportador da serotonina foram identificados utilizando um ensaio de ligação S -citalopram. Transportador de serotonina expressa em baculovírus transduzidas HEK293S GnTI - células, foi reconstituída em proteolipossomas e utilizados para produzir anticorpos de elevada afinidade. Nós desenvolvemos uma estratégia para descobrir anticorpos que são úteis para estudos estruturais. Uma abordagem simples para a expressão de fragmentos de anticorpo em células Sf9 também foi estabelecida.Complexos transportadores-anticorpo purificado usando este procedimento são bem-comportado e prontamente cristalizar, produzindo complexos com S -citalopram que difractam raios-X para 3-4 Å de resolução. As estratégias desenvolvidas aqui pode ser utilizado para determinar a estrutura de outras proteínas da membrana desafiantes.
Introduction
O transportador de serotonina (SERT) é uma proteína da membrana integral, que facilita o transporte de serotonina através das membranas celulares 1. SERT pertence a uma família de Neurotransmissor SIMPORTADORES sódio (NSS), que também inclui a dopamina e norepinefrina transportadores 2. SERT é o alvo molecular de medicamentos antidepressivos e anti-ansiedade amplamente prescritos que agem para inibir competitivamente o transporte da serotonina 3. SERT explora o co-transporte energeticamente favorável de sódio para remover o neurotransmissor da fenda sináptica. Caracterização extensiva do sistema serotonérgico tem mostrado que mudanças no metabolismo da serotonina parecem influenciar praticamente todos os processos neurológicos, incluindo humor, sono, dor, cognição e agressão comportamentos 4. SERT função pode ser modificado através da utilização de antidepressivos e de recaptação da serotonina (SSRIs) -citalopram como S, bem como por psychostimulants e drogas de vício tais como anfetaminas e -methylamphetamine N 3,4-metilenodioxi ou "ecstasy" 1,2.
ISRSs são extremamente importante para o tratamento de transtornos de humor, no entanto, a base estrutural para a sua acção preciso não é bem compreendido. WT SERT é instável em micelas de detergentes, impedindo assim o progresso no sentido de uma estrutura tridimensional (3D) de SERT 5,6. Recentemente, desenvolvemos variantes de SERT que são robustamente estável em uma ampla gama de detergentes e reter SSRI actividade 6 vinculativo. Estas variantes SERT termoestáveis foram seleccionados usando um ensaio de estabilidade térmica à base de proximidade de cintilação. Aqui, descrevemos um procedimento para a geração de anticorpos de elevada afinidade que se podem ligar SERT, e a purificação e cristalização de SERT termoestável, em complexo com o anticorpo e S -citalopram.
Este protocolo assume que a SERT e 8B6 genes têm sido bem sucedidaY clonado nos vectores BacMam 7 e insectos de expressão, respectivamente. Para gerar anticorpos, de ADNc que codificam os resíduos 73-616 de WT SERT foi clonado no vector BacMam com um Strep II etiqueta C-terminal (SERT IC). Para a tela de estabilidade térmica, foi usado resíduos SERT 73-616 com GFP C-terminal, Strep II e 10-his (TC SERT). Mutações pontuais individuais foram gerados no fundo SERT TC. Para o protocolo de cristalização, a proteína de fusão SERT-GFP foi usado com Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys], e 10-his, transportando os mutantes termoestáveis, Y110A, I291A, e T439S e mutações de cisteínas superfície C554A, C580A , e C622A (CC SERT). Sequências de clivagem de trombina (LVPRGS) também foram inseridos no CC SERT após Q76 e T618 para permitir a remoção do N- e C-terminais. O plasmídeo que codifica para o Fab de 8B6 foi manipulada para expressar tanto o pesada e levecadeias do anticorpo com sequências de secreção de gp67 sob o controlo de dois promotores poliedrina separados. O C-terminal da cadeia pesada do anticorpo 8B6 foi marcado com um 8-His e um local de clivagem de trombina foi inserido entre a cadeia pesada e a etiqueta.
Protocol
1. A transfecção de Aderente HEK293S GnTI - Pilhas para a tela termoestabilidade
- Prepare poli-D-lisina (PDL) -Revestido placas de 96 poços. Executar todo o trabalho em uma capela de fluxo laminar estéril.
- Filtrar uma solução de 25 ug / mL de (PDL), o peso molecular 70,000-150,000 Da, utilizando um filtro estéril de 0,2 | im. Adicionar 50 uL de PDL para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços (TC), assegurando o fundo é revestido uniformemente, e incubar à TA durante 30 min.
- Aspirar PDL solução e lava-se com 200 mL de água estéril.
- Permitir que a placa secar ao ar durante 2 h antes do armazenamento a 4 ° C. PDL placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas.
- A tripsinização de células aderentes HEK293S.
- Cresça HEK293S a 80% de confluência numa placa de 10 centímetros mantida a 37 ° C com 8% de CO 2. Uma única placa de 10 cm devem ter, aproximadamente 10 milhões de células HEK293S. Não utilize células após 30 passagens! meios Aspirar e lava-se com 5 mL de soluto salino tamponado com fosfato (PBS). Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,02%) para as células e incuba-se durante 2 min a 37 ° C.
- Adicionar 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e ressuspender as células por pipetagens repetidas cima e para baixo com uma pipeta serológica.
- Pipetar 10 ul de células e misturar-se com 10 uL de azul Tripano solução (0,4%). Determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro e um microscópio de luz. Não conte as células que estão manchadas azul como eles estão mortos. Assegure-se que a viabilidade das células é superior a 90%.
- Completamente ressuspender tripsinizadas HEK293S GnTI - células em DMEM suplementado com FBS a 10% a uma densidade de 0,5 X 10 6 células / ml num reservatório pipeta descartável. Cerca de 5 milhões de células HEK293S serão necessários para cada placa. Um total de 24 construções podem ser transfectadas em cada placa utilizando este protocol.
- Usando uma pipeta de canais múltiplos, adiciona-se 100 uL de células para cada poço de uma placa revestida PDL. Ressuspender as células no reservatório de pipeta depois de encher cada placa para assegurar uma distribuição uniforme de células. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C com 8% de CO 2. Após 24 h, as células devem atingir cerca de 80% de confluência.
- 1 h antes da transfecção substituir a mídia. Preparar complexos de reagente de transfecção de ADN para transfecção.
- Para cada construção no fundo SERT TC a ser peneirado, mistura de 450 ng de ADN com 45 mL de DMEM isento de soro e mistura-se. Adicionar 1,6 mL do reagente de transfecção de 45 mL de DMEM isento de soro e mistura-se.
- Imediatamente adicionar solução de reagente de transfecção diluída a solução de ADN e misturar. Não misture soluções na ordem inversa. Esperar 10 - 15 min e adicionar 20? L de mistura de reagente / transfecção de ADN a 4 poços.
- Uma vez que todos os poços foram transfectadas, misture placa por balançando suavemente de volta umND adiante e retornar à temperatura de 37 ° C incubadora.
- Depois de 16 - 24 h substituí meios com DMEM contendo soro e butirato de sódio 10 mM.
- Aproximadamente 48 h após a transfecção remover a mídia e quer prosseguir imediatamente com thermostability tela ou congelar as células a -80 ° C para ser usado mais tarde. As células podem ser armazenadas a -80 ° C durante várias semanas.
Tela de termoestabilidade com base em 2. Proximidade de Cintilação com S -citalopram
- Incubar as células com 200 nM S -citalopram em 25 mL de TBS (Tris-Soro Fisiológico Tamponado com - Tris a 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) durante 5 min à TA.
- Solubiliza-se as células por adição de 25 uL de mM de N-dodecil-β-D-maltopiranósido 8 (C12M), colesterilo hemmisuccinate 1 mM (CHS), cocktail inibidor de protease (fenilmetanossulfonil fluoreto de 2 mM (PMSF), 0,1 mg / ml de aprotinina, 4 g / mL de pepstatina a, e 4 ug / ml de leupeptina) em TBS, e incubação durante 1 h à TA.
- Adicionar 50 ul de TBS with 20 nM de [3H] citalopram (81,7 Ci / mmole), 0,1% de albumina de soro de bovino, e 2 mg / mL de His-tag de afinidade de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) para grânulos de três poços para cada constructo. Para o último poço adicionar a mesma solução listada, mas complementar com 100 sertralina? M para determinar a ligação não específica. Certifique-se de que as contas His-tag de afinidade SPA são misturados ao adicionar a placa de 96 poços.
- Medir [3 H] citalopram de ligação usando um contador de cintilação de 96 poços à temperatura ambiente com um tempo de contagem de 1 min por po. Continue placas de contagem até que as contagens totais planalto (aproximadamente após 36 h).
- placas de calor durante 15 min num bloco de aquecimento com uma tampa aquecida a 33 ° C. Medir a ligação de [3H] citalopram novamente após o aquecimento, tal como descrito em 2.4.
- Repetir o passo 2,4-2,5 e alterar o passo de aquecimento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, e 51 ° C. Ajuste as temperaturas de aquecimento, dependendo da temperatura aparente de fusão (Tm)da proteína alvo e a termoestabilidade da construção mais estável. Continuar a aquecer as placas até que todas as construções têm baixas contagens específicas.
- Analisar os dados para determinar os valores de Tm.
- Determinar as contagens totais médias por minuto (cpm) de cada construção de poços que não contêm sertralina através da média das 3 réplicas de poços. Determinar o CPM não específica pela média das CPM de cada poço contendo sertralina numa única placa.
- Calcular CPM específica subtraindo a CPM não específica do CPM total.
- Calcular a Tm por um ajuste não linear para uma função sigmoidal de Boltzmann. Construções com baixo CPM específica à temperatura ambiente (<10% do WT) geralmente não têm valores precisos Tm. Mutações do mais construções termoestáveis podem ser combinadas e rastreados para aumentos aditivos em thermostability.
3. A expressão do transportador da serotonina humana em HEK293S GnTI 4. A purificação por afinidade do transportador de serotonina para Imunização e cristalização 5. Transportador de reconstituição em lipossomas para imunização 6. Rastreio de anticorpos que reconhecem epitopos 3D 7. Expressão de um fragmento de anticorpo em células Sf9 9. A formação de complexos transportadores-anticorpo e separação por cromatografia de exclusão de tamanho 10. A cristalização de complexos transportadores-anticorpo por enforcamento Gota
NOTA: ADN bacmid deve ser transfectado em células Sf9 imediatamente para obter os melhores resultados, mas podem também ser armazenados a -20 ° C durante várias semanas. <li> Remova a mídia a partir de células e adicionar 2 mL de meio Sf 9 frescos. Adicionam-se 5 ug de ADN bacmeo de 100 uL de meios de Sf9 (solução A).
NOTA: não é recomendado o uso de mais do que 80 ml de vírus P2 desde o HEK293S GnTI - células vão crescer lentamente e pode tornar-se inviável devido a uma alteração no pH. media Sf9 é mais ácida do que a mídia 293 expressão.
NOTA: O rendimento total será de 3 -4 mg de SERT CC e 1 mg de SERT IC. Uma absorvância de 2 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL de SERT.
NOTA: O uso de Tris ajustado com NaOH para um pH de 8,5 como tampão. Não use base Tris ajustado com HCl. A tela pode ser preparado de 2 mL e tubos utilizados até terminar. Tome cuidado para pipetar com precisão PEG 400, utilizando uma pipeta de deslocamento positivo, pois é extremamente viscosa!
NOTA: A placa foi comprado com selante já aplicada à borda dos poços.
NOTA: Monocristais aparecerão dentro de aproximadamente 3 dias e crescer para 100-175 mm após 14 dias.
Representative Results
Uma biblioteca de mutantes de um único ponto no fundo SERT TC foi criado para a tela para thermostabilizing mutações. mutantes individuais foram geradas utilizando a mutagénese padrão. O protocolo de selecção utiliza células HEK293S e uma tela de termoestabilidade com base em proximidade de cintilação transientemente transfectada para rapidamente identidade mutações úteis para a cristalização, conforme descrito na Figura 1A. Valores Trama Tm contra ligado de [3H] citalopram à TA revela construções com elevada termoestabilidade e de expressão de níveis adequados para a purificação de proteínas (Figura 1B). Três mutantes (Y110A, I291A, e T439S) foram combinadas para gerar uma construção altamente estável (Figura 1C). A termoestabilidade está também correlacionada com o aumento da estabilidade em detergentes de cadeia curta necessárias para a cristalização do complexo Fab-SERT.
A expressão em larga escala de SERT humano utilizando baculovírus-transduced HEK293S GnTI - células pode levar menos de 2 semanas e podem produzir quantidades de miligramas, tal como ilustrado na Figura 2A. Utilização da proteína SERT CC GFP permite a SERT ser convenientemente seguido durante a expressão e a purificação por fluorescência (Figura 2B). A nossa estratégia de purificação envolveu 1) solubilização de SERT ligado a S -citalopram a partir de GnTI HEK293S - células em C12M na presença de CHS como um lípido de estabilização; 2) ligação do SERT a uma matriz de afinidade Strep; 3) a remoção de proteínas contaminantes por lavagem exaustiva; e 4) eluição da SERT funcional com tampão contendo destiobiotina (Figura 2C). A proteína eluída é em grande parte isenta de outras proteínas detectáveis por coloração com azul de Coomassie e monodisperso como julgado por FSEC (Figura 2D, E).
Uma estratégia semelhante foi feita para purificar SERT com uma etiqueta Strep II que foi usada para reconstitution e imunização (Figura 3A, B). Incorporação de SERT em proteolipossomas aumenta a meia-vida no soro e a estabilidade da SERT e aumenta a probabilidade de isolamento de anticorpos de elevada afinidade. Além disso, a inclusão de lípido A, um componente da parede celular bacteriana, serve como um potente adjuvante 9. Os lipossomas multilamelares foram preparados pela adição de tampão para uma mistura de lípidos secos em tubos de vidro e ressuspensas em tampão. A extrusão de lipossomas através de filtros de tamanho de poro de 200 nm produz monodispersas suspensões lipossómicas unilamelares. Os lipossomas são, em seguida, saturado com um detergente, seguida pela adição de SERT purificada em detergente. Finalmente, o detergente é removido por adição de resina hidrofóbica de absorção para o lípido: mistura detergente. ligando adicional deve ser adicionado à amostra reconstituída para seleccionar anticorpos que reconhecem a conformação ligada antidepressivo. A presença de SERT nas proteolipossomos deve ser confirmado porsolubilização de uma pequena amostra com tintura SDS-PAGE carga ou C12M e em execução no SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D).
linhas celulares de hibridoma que expressam anticorpos SERT pode ser rastreada para ligantes de afinidade elevada que reconhecem epítopos em 3D. Estas propriedades são cruciais para o eventual sucesso de cristalização, como o anticorpo deve manter-se firmemente ligada a uma região estruturada para promover empacotamento cristalino de homogéneos, domínios bem ordenadas. No primeiro passo, os anticorpos que reconhecem regiões não estruturados são identificados. SERT é desnaturado e transferido para uma membrana de nitrocelulose; anticorpos que se ligam SERT desnaturado será ocidental-positiva e provavelmente reconhecem epítopos lineares. Na Figura 4A, que mostram exemplos de 2 anticorpos que são ocidental-positiva e, provavelmente, não é útil para promover crystallogenesis. Na Figura 4B, os restantes anticorpos ocidental-negativos são incubadas com 100 nM de SERT-GFP e separados porFSEC. Os anticorpos que se ligam SERT irá deslocar o pico de GFP-positiva para uma posição anterior. Os complexos SERT-anticorpo pode ser diluída adicionalmente em detergente para determinar se eles podem ligar-se com afinidade nanomolar, seguido de análise por FSEC. A adição de resultados de serotonina em alterações conformacionais no transportador e, portanto, os anticorpos podem ser novamente pesquisadas para determinar se são capazes de reconhecer especificamente a conformação SSRI-ligado. Na Figura 4C, os anticorpos são mostrados para ligar SERT na presença de serotonina, que mostra que o epitopo (s) não mudam do SSRI ao substrato estado ligado. Finalmente, na Figura 4D combinações de anticorpos são testados quanto à sua capacidade para se ligar epitopos distintos, o que resulta em mais um desvio para a esquerda. Aqui, o 15B8 ou 8A11 anticorpos reconhecem um epitopo que é diferente do 8B6.
O anticorpo 8B6 foi escolhido para posterior análise estrutural com base na triagem de cristal preliminar com trea papaínated Fab. Os genes de 8B6 do Fab foram clonados num vector de expressão de células de insecto. Fab podem ser expressas e segregadas a partir de células Sf9 em crescimento em suspensão. O 8B6 Fab pode ser purificado a partir do sobrenadante de células Sf9 por His-tag de afinidade (Figura 5A, B) e cromatografia de permuta catiónica (Figura 5C, D) resultando em proteína que aparece livre de contaminantes em geles de SDS-PAGE. Na Figura 5E, o recombinante 8B6 Fab é mostrado ligar SERT e é usado em experiências bioquímicas e biofísicas subsequentes.
A afinidade purificado SERT CC é digerida com trombina e a EndoH e misturado com 8B6 Fab de modo a formar um complexo na presença de S -citalopram. O complexo transportador-anticorpo é então separado por SEC em C8M (Figura 6A) e as fracções de pico conter tanto SERT e Fab como mostrado por SDS-PAGE (Figura 6B). Uso de C8M é crucial para a formação de cristais, provavelmente porqueo detergente de cadeia curta permite uma melhor embalagem entre as moléculas na rede cristalina. FSEC é empregada para determinar quais as fracções devem ser recolhidas para cristalização (Figura 6C); As fracções que não são monodispersas e / ou contêm grandes quantidades de SERT livre ou Fab não devem ser combinados.
Prisma cristais SERT-anticorpo em forma podem ser cultivadas na presença de S -citalopram usando este protocolo por enforcamento difusão de vapor de queda (Figura 7A). Os cristais resultantes difratar raios-X para uma resolução de 3,15 Å 10 (Figura 7B).
Figura 1: proximidade de cintilação à base de termoestabilidade Ensaio A.. Visão geral do protocolo para o rastreio de termoestabilidade na presença de [3H] citalopram. B. Máxima ligado [3 (Tm). As linhas pontilhadas representam os valores para o transportador WT. Os 3 mutantes mais termoestáveis são rotulados. Área cinzenta representa mutantes que têm menos de 10% de [3H] citalopram em relação ao WT e valores de Tm de ligação, portanto, imprecisas devido a uma baixa relação sinal-ruído. C. Curvas termoestabilidade para WT SERT TC e os 3 primeiros mutantes. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão de mamíferos heterólogos Protein Expression A.. Visão geral esquematizado de geração de vírus BacMam e expressão de SERT em HEK293S GnTI -. Células B. ELEK293S GnTI - células que expressam o CC SERT (fluorescência da GFP) C.. Perfil de eluição de CC SERT em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Análise de afinidade purificado CC SERT numa 4 - gel de 15% SDS-PAGE E.. FSEC de afinidade CC SERT purificada detectado pelo GFP fluorescência (excitação: 480 nm; emissão: 510 nm). O pico de eluição de 15 mL é SERT (#) e 18 mL é GFP livre (*). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante Affinity Purificação e Reconstituição da SERT IC A.. Visão esquemática da geração de anticorpos. <strong> B. Perfil de eluição observado a 280 nm de a purificação por afinidade de SERT IC em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Análise de afinidade purificados e reconstituídos num SERT 4 - gel de 15% SDS-PAGE D.. FSEC de SERT solubilizado após a reconstituição. A fluorescência dos resíduos de triptofano foi usado para detectar SERT (Excitação: 280 nm; emissão: 335 nm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Análise do representante SERT Antibodies A. O rastreio de anticorpos por Western blot. Aproximadamente 1 ug de CC SERT com ou sem GFP foi aplicado a 4 - 15% de SDS-gel de PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A ligação foi detectada utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com corante IV. 2G4 e 10F2 são western positivo. B. A ligação de anticorpos a 100 nM SERT GFP e detecção por FSEC detectada utilizando GFP fluorescência. C. A ligação de Fab seleccionados a 100 nM SERT GFP na presença de 1 mM de serotonina. D. A ligação de 8A11 ou 15B8 Fabs para Sert-8B6 Fab. Picos menores de eluição de 18 ml são GFP livre. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A purificação representativas do 8B6 de Fab a partir de células Sf9 Um.. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por His-tag de afinidade chromatograp HY. Vestígio verde representa a concentração de imidazole, 0 - 50% (0 - 250 mM) B.. Não-redutoras e redutoras em gel de SDS-PAGE depois de purificação por afinidade de His-tag. Proteína que corre perto de 50 kDa é Fab não reduzido (#) e as espécies menores de 25 kDa é reduzido Fab (*). C. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por permuta catiónica exibindo um único pico simétrico que elui sob um gradiente linear de cloreto de sódio. Vestígio verde representa a concentração de NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Análise do 8B6 Fab num gel de SDS-PAGE a 12,5%, após purificação por permuta catiónica. E. Ligação do 8B6 Fab a 10 nM SERT GFP, detectada usando fluorescência da GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6: Cromatograf ia de Filtração em Gel representativas do Complexo SERT-8B6 na presença de S Uma -citalopram.. Gel perfil de eluição da filtração purificado complexo SERT-8B6. pico principal que elui a 11,5 mL é o complexo SERT-8B6. Pico em 15-17 mL contém GFP e Fab B.. Análise do complexo SERT-8B6 purificado numa 4 - em gel de SDS-PAGE a 15%. As posições de SERT e as cadeias pesada e leve do Fab são mostrados por uma barra. C. FSEC das fracções separadas por tamanho. complexos SERT-8B6 foram detectados utilizando a fluorescência do triptofano. Fracção 17 contém uma quantidade maior de SERT que não fez complexo com Fab. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Cristalização do Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. A microscopia de luz em forma de paralelepípedo de cristais do complexo SERT-8B6 após 2 semanas de crescimento. A barra de escala é igual a 200 um. B. cristais SERT-8B6 difratar raios-X a 3,15 Å. anel azul representa 3,15 Å. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1:. A tela cristalização para o Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram Por favor clique aqui para baixar esta tabela.
Discussion
Determinação de estrutura de proteína de membrana por técnicas biofísicas permanece uma tarefa difícil para muitos transportadores clinicamente significativos, receptores e canais 11. Aqui temos conhecimentos partilhar detalhada desenvolvido para a determinação da estrutura do transportador de serotonina humano ligado a S -citalopram. Prevemos que estes métodos irão ser úteis para determinar estruturas de SERT em outros estados conformacionais, bem como estruturas de outras proteínas de membrana difíceis. Além disso, as técnicas bioquímicas descritos aqui também podem ser usadas para estudar a função de SERT purificada em detergente e um ambiente quase nativo lípido.
SERT cristalização articulada sobre o desenvolvimento de várias técnicas e ferramentas. Em primeiro lugar, as melhorias na estabilidade térmica transportador produzidos variantes SERT que foram bem-comportado em várias micelas de detergentes seguintes extração do transportador a partir de membranas 6. Em segundo lugar, o uso-citalopram do ligando de afinidade elevada ao longo S purificação e cristalização adicional estabilidade melhorada e reduzida heterogeneidade conformacional. Em terceiro lugar, o desenvolvimento do sistema de expressão BacMam 7 permitido para a produção de grandes quantidades de SERT em um curto período de 2 semanas, o que facilita tanto a imunização e cristalização. Finalmente, o desenvolvimento de estratégias para seleccionar anticorpos de afinidade elevada que reconhecem epitopos 3D permitiu a descoberta de que o anticorpo 8B6 que promove a embalagem bem ordenada de complexos anticorpo-SERT em cristais.
Há uma série de passos e reagentes críticos, bem como problemas comuns que ocorrem frequentemente ao longo do protocolo. Em primeiro lugar, a geração de elevado título de vírus SERT P2 pode ser problemático. A adição de concentrações baixas de vírus P1 para gerar vírus P2, como descrito neste protocolo normalmente mitiga este problema, e nos casos em que o título do vírus P2 é baixo, vírus P3 podem ser feitos Utilizang vírus a uma MOI de 0,0001. Os vírus com um título inferior a 1 x 10 8 partículas de vírus / ml não devem ser utilizados e quase sempre resultar em rendimentos baixos da proteína. Para a expressão, HEK293S GnTI - células foram escolhidos uma vez que falta N -acetylglucosaminyltransferase eu actividade e, assim, não pode sintetizar-glicanos complexos n, em vez produzindo apenas N-glicanos de manose elevada. Cliva EndoH N -ligada glicosilação de altas glicanos de manose em dois locais na alça extracelular 2 (EL2), deixando uma acetilglicosamina N ligado a asparagina. A digestão de N -linked açúcares reduz entropia superfície de EL2 que é provável importante para a cristalização. Para a geração de anticorpos, o SERT IC deve ser utilizada para a imunização. GFP é altamente imunogénica e 12 não deve ser usada como uma etiqueta de fusão para gerar anticorpos uma vez que é difícil de remover completamente por SEC. A N- flexível e C-terminal da SERT também não eramincluída na construção, a fim de evitar os anticorpos contra estas regiões. Os ratos podem ser imunizados com 30 ug de proteína reconstituída; continuar ratinhos imunizantes até concentrações elevadas no soro de anticorpos pode ser detectada e produzir células de hibridoma, tal como descrito 13. Uma construção thermostabilized é geralmente a melhor escolha para a imunização; se o transportador é bem comportado e mantém a actividade biológica após purificação, esta é muitas vezes suficiente para produzir anticorpos. O anticorpo 8B6 foi levantada contra WT SERT. Para a cristalização, apenas as fracções de pico contendo de Sec complexo monodisperso como julgado por FSEC devem ser combinadas e concentradas. cristais SERT-8B6 crescer em uma estreita faixa de condições e há uma série de passos que devem ser tomadas para solucionar problemas especificamente relacionados ao crescimento SERT cristal. Tris base ajustado com HCl, não deve ser usado na solução de reservatório, uma vez que este tampão não suporta o crescimento de cristais; é, assim, CRIticos em vez disso, use Tris ajustado com NaOH. cristais SERT crescer numa estreita faixa de concentrações de PEG 400, de modo que se cristais não crescem ou se se observarem cristais muitos pequenos, mesmo um pequeno aumento ou diminuição da concentração de PEG 400 seria aconselhável. Além disso, o aditivo de ácido 6-amino-hexanóico também foi utilizado no ecrã optimizado para melhorar a nucleação. A proporção gota de proteína: solução bem é também uma chave determinante para o crescimento de cristais. Gota rácios de 1,5-2: 1 são recomendados, com proporções mais estreitas gota a 2: 1, tipicamente de suporte do crescimento de cristais de 3-dimensionais maiores. Finalmente, o uso de baixo perfil placas de 24 poços também é crucial para o crescimento de cristais, presumivelmente devido à alteração da taxa de difusão de vapor.
Uma abordagem alternativa para o método SPA foi desenvolvido para o rastreio de mutantes que estabilizam o transportador de serotonina rato numa conformação ligado a cocaína utilizando um filtro de ensaio de ligação 5. Em contrapartida, o ba SPAensaio sed permite passos de aquecimento sequenciais seguintes por determinação da fração de SERT, que permanece ligada ao ligando. Assim, isto permite a determinação rápida da temperatura de fusão a partir de um pequeno número de amostras. O método SPA baseia-se na disponibilidade de um ligando de alta afinidade marcado radioactivamente e, se não se conhecem os ligandos que se ligam com afinidade submicromolar, em seguida, uma abordagem alternativa será necessário. Muitos outros métodos são geralmente usados para medir a estabilidade da proteína tais como a ligação de corantes fluorescentes e de calorimetria 14 mas são de baixo rendimento e são incapazes de medir directamente a função ou requerem grandes quantidades de proteína. Se o método SPA não pode ser utilizado, uma abordagem alternativa de elevado rendimento é uma termoestabilidade Ensaio Baseado em FSEC 15 (FSEC-TS), em que a amostra é aquecida seguido pela separação da fracção de permanecer transportador. FSEC-TS é uma abordagem útil para aceder comportamento cromatográfica e estado oligomérico e é apferramenta complementar owerful que pode ser usado juntamente com o método SPA.
Uma comparação de vários sistemas de expressão de proteína comum, também foi encontrada para favorecer a utilização de células de mamífero para expressão e sem surpresa SERT 16 esta é provavelmente o caso para muitas proteínas de origem mamífera. Os métodos que usamos para a expressão foram adaptados para SERT, mas é provável facilmente adaptável. As condições que favorecem elevados níveis de expressão deve ser cuidadosamente identificados através da variação do tempo de expressão, temperatura, concentração de vírus, e a presença de inibidores de histona-desacetilase, tais como o butirato de sódio.
Em geral, favorecem a purificação por afinidade de um detergente de cadeia longa, tais como C12M leve juntamente com CHS antes da reconstituição para manter o ligando de alta afinidade de ligação. Reconstituição utilizando absorção hidrofóbica é uma técnica suave que se descobriram ser eficaz para vários outros transportadores e receptores. Se estenão é bem sucedida, a remoção de detergentes com altas concentrações de micelas críticas por diálise, de diluição, ou SEC pode ser empregue 17, desde que o antigénio seja suficientemente estável em tais detergentes. Nos casos em que não há anticorpos adequados são encontrados, nós quase sempre encontrar o problema é devido à perda de função ou desnaturação do antígeno e, nesses casos, foi realizada com sucesso novas imunizações prestando especial atenção à bioquímica de proteínas. Finalmente, os ligandos e anticorpos que se ligam com afinidade elevada deve formar a base para um experimento de cristalização racionalmente planeada, e tirando partido de uma variante termoestável, pode-se o despiste de uma gama mais ampla de condições, fazendo variar as propriedades de diferentes detergentes. Além disso, a cristalização de uma mesofase lipídica 18 ou usando bicelles 19 deve ser sempre considerada como uma alternativa à cristalização em micelas.
Estes princípios e métodos podem ser usados com algum modificação para muitas outras proteínas transmembranares que são difíceis de expressar e purificar a partir de outros hospedeiros de expressão, e será particularmente útil para a determinação da estrutura de alvos de drogas de alta afinidade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
| Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
| Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
| Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside | Anatrace | I1003 | IPTG |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
| Sf9 | ATCC | CRL-1711 | |
| Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
| HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
| Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 0984018DJ | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
| S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
| Asolectin | Sigma | 11145 | |
| Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
| Lipid A | Sigma | L5399 | |
| Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
| Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
| Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary antibody for western blotting |
| Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
| Serotonin | Sigma | H9523 | |
| pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
| Imidazole | Sigma | 56749 | |
| n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
| Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
| Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris is used for preparation of crystallization reservoirs |
| PEG 400 | Sigma | 91893 | |
| 6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
| Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
| PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
| Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
| Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
| ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
| SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
| 0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
| 1 L filter system | Corning | 430517 | |
| 2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
| 2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
| Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
| Extruder | Northern Lipids | ||
| Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
| XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
| 100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
| 30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
| Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
| HPLC | Shimadzu | 51476 | |
| Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
| Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
| 0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
| 30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
| Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
| 1 mL HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
| 24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
| 18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
| Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
| MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
| HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
| Sertraline | Sigma | S6319 |
References
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