Summary
Здесь мы опишем количественный метод протеомики с помощью метода стабильных изотопов маркировки аминокислот в клеточной культуре (SILAC) для анализа последствий инфекции ВИЧ-1 на хосте exosomal протеомов. Этот протокол может быть легко адаптирован к клеткам при различных стрессовых условиях или инфекции.
Introduction
Многие заболевания человека, в том числе вирусных инфекций, часто связаны с характерными клеточными процессами, которые происходят внутри и вокруг пораженных клеток. Белки, часто выступая в качестве конечных клеточных эффекторов, опосредуют эти процессы. Анализ белков часто может дать ценную информацию относительно локального окружения пораженных клеток и помогают нам понять основной механизм патогенеза болезни. Среди различных методов анализа белков, протеомики имеет особенно большие перспективы. В качестве мощного, крупномасштабного инструмента, протеомики может обеспечить системное понимание клеточных процессов, в частности, в области функции и взаимодействия белков. Анализ специфических белков становится проще путем разработки методов маркировки, которые позволяют исследователям контролировать экспрессию клеточных компонентов, в частности белков, в месте расследования. Хотя многие протеомики анализы были выполнены на клеточномпротеом шкала, протеомические характеризации на субклеточных отсеков оказались особенно информативными 1. Примером этого может служить также в исследованиях ВИЧ-1-инфекции.
Экзосомы, 30-100 нм мембранные везикулы , секретируемые широким спектром типов клеток 2, 3, являются важнейшими компонентами межклеточной коммуникации и молекулярного транспорта. Они были ранее обнаружены, играют важную роль в процессе ВИЧ-1 многообещающий 4, 5. Объединив Протеомические анализ с функциональным рассечения, мы обнаружили , что экзосомы , освобожденные из инфицированных ВИЧ-1 клеток состоят из уникальных и количественно различных белков подписи и гавани регуляторных молекул , которые влияют на клеточные свойства на соседних восприимчивых клеток, в том числе клеточного апоптоза и пролиферации 6. Эти методы описаны в данном протоколе,а именно SILAC (стабильный изотоп маркировки аминокислотами в культуре клеток) 7 на основе протеомики характеристик экзосомы от инфицированных ВИЧ-1 клеток. Аналогичные подходы могут быть применены, чтобы лучше понять других субклеточных компартментах в процессе патогенеза, регулируя экспериментальную нагрузку на конкретном отделении или доли интереса и внесение необходимых изменений в описанных процедур.
Принимая во внимание недавнее развитие количественных методов протеомическим, есть много, чтобы выбрать из при выборе наиболее эффективного метода для конкретного эксперимента. Среди них на химической основе iTRAQ (изобарических метки для относительного и абсолютного квантификации) 8 и метка свободной МРМ (множественный мониторинг реакции) 9 методов. Оба метода являются мощными инструментами и являются хорошим выбором для конкретных установок. Для типичной лаборатории в основном работают с клеточными линиями, однако, эти два метода имеют relativelу более высокие затраты и более трудоемким по сравнению с методом, основанным SILAC. SILAC является метаболическим на основе технологии маркировки, которая включает в себя нерадиоактивных изотопные формы аминокислот из культуральной среды в клеточные белки. Как правило, SILAC эксперименты начинаются с двух клеточных популяций, например, для инфицированных и неинфицированных. Каждый из них по-разному маркированы в своей специфической среде изотопного до полной маркировки не будет достигнута. Меченые экзосомы этих клеток затем подвергают экстракции белка. После извлечения меченые exosomal белки анализировали с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс - спектроскопии 10. Наконец, результаты масс-спектрометрии и значительно меченые белки подвергаются статистической и биоинформатика анализа, а также строгой биохимического контроля. Наши предыдущие следственные доклады свидетельствуют о том, что процедуры SILAC / экзосома являются более подходящими для клеточных линий, чем первичные клетки, так как клеточные линии, как правило, находятся вАктивное состояние пролиферирующих для эффективной маркировки изотопном,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток и ВИЧ-1 инфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов, рекомендуется проверить жизнеспособность клеток через трипанового синего окрашивания 11 и их пролиферацию через МТТ 12. Также важно использовать недавно подготовленный SILAC среду. Различные клеточные линии могут быть использованы, пока они находятся в активно пролиферативной стадии, и восприимчивы к инфекции ВИЧ-1, либо испытуемое условием выбора. В этом протоколе, используют клеточную линию H9 в качестве примера.
- Семя 2 × 10 6 клеток H9 в каждую колбу для культивирования клеток. Grow одну группу в 10 мл среды RPMI 1640 , меченных среду , содержащую 10% диализированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мг / л 13 C 6 L-лизин и 100 мг / л 13 C 6 15 N 4 L-аргинин. Grow другую группу в 10 мл среды RPMI непомеченная 1640 с добавлением 10% FBS, диализу, 100 мг / л L-лизина и 100 мг / л L-аргинина.
- Grow клетки в течение шести удвоений в какой момент белки клеток в меченой среды практически полностью размеченный (> 99%) с тяжелыми аминокислотами. Добавить свежую среду, или регулярно менять носители (каждые 1-3 дней в зависимости от типа клетки. Для H9 клетки, менять среду каждые 3 дня). В конце маркировки, увеличение объема культуры (например , ~ 30 мл) , чтобы учитывать рост более ячеек.
Примечание: Для точного определения ячейки время удвоения в начале эксперимента через окрашивания трипановым синим и подсчета клеток. - Инфицировать меченых клеток с ВИЧ-1 NL4-3 с использованием стандартного ВИЧ-1 инфекции протокол 13 в течение 48 часов. Инкубируйте клетки с соответствующими количествами вируса с множественностью инфекции (MOI) около 0,3. Проверка на ВИЧ-1-инфекции путем p24 квантификации супернатантов культуры с помощью ВИЧ-1-антигена р24 ELISA набор. Провести анализ 14 иммунофлюоресценции для подтверждения успешного инфицирования клеток. Keeр растет немеченых клеток в немаркированной среде без ВИЧ-1 инфекции.
- Урожай супернатантах обеих групп в конце инфекции (этап 2.1).
2. экзосома Изоляция
Примечание: Через ряд шагов ультрацентрифугирования, exosomal фракции из супернатантов культур обогащены 15. Выполните все следующие шаги при 4 ° С, с ультрацентрифуге ротора, который может достигать скорости по меньшей мере 100000 х г.
- Собирают супернатанты культур в 50 мл конические пробирки, избегая клеток. Центрифуга их в течение 10 мин при 300 мкг для удаления оставшихся клеток.
- Собирают супернатанты в новые 50 мл конические пробирки и центрифуге их в течение 10 мин при 2000 мкг для удаления мертвых клеток. Передача в результате супернатанты на коммерческих роторных-совместимых трубок, которые способны выдерживать ультрацентрифугирования.
- Обязательно, чтобы сбалансировать ультрацентрифуге трубки. Центрифуга пробирки в течение 30 мин при 10000 мкг, чтобы удалитьостатков клеток.
- Собирают супернатанты в ультрацентрифуге труб и центрифуги в течение 70 мин при 100000 х г. Откажитесь от супернатантов.
- Ресуспендируют экзосома богатых гранул в 5 мл свежего PBS. Перенесите решения свежих ультрацентрифуге труб и центрифуга снова в течение 70 мин при 100000 х г.
- Отбросить супернатанты. Для хранения экзосомы долгосрочных, ресуспендируют гранул в 50 мкл PBS и хранить при температуре -80 ° C. В качестве альтернативы, переходить непосредственно к экстракции белка, как показано ниже.
3. Белки Добыча и подготовка
- Растворите изолированные exosomal гранулы в 100-200 мкл RIPA лизиса и экстракции буфером с добавлением коктейлей ингибиторов протеазы. Буфер состоит из 25 мМ Трис-гидрохлорида, 150 мМ хлорида натрия, 1% NP-40, 1% дезоксихолата натри и 0,1% SDS (додецилсульфата натрия), при рН 7,6. Коктейли ингибитор протеазы должны содержать различные ингибиторы протеазы, такие как апротинин, бестатин, Leupeptin, пепстатин А и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), что может ингибировать полный спектр протеиназ.
- Центрифуга растворенные растворов в течение 10 мин при 13000 х г (4 ° C), и передавать очищенные супернатанты к новым 1,5 мл микропробирок.
- Количественно концентрации белка в каждом образце экзосомы с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) или Бредфорда 16.
- Смешайте равное количество белков (2 мкг) из меченых и немеченых образцов и запустить равную смесь на 4-20% геле SDS-PAGE при 120 мА / 200 В в течение 30 мин.
- Пятно гель с Кумасси синим с последующим Обесцвечивание 17.
- С помощью лезвия бритвы, вырезать образец полосу из геля. Затем вырежьте полосу геля на 10-15 равных частей. Положите каждый кусок в свежую 1,5 мл микроцентрифужных трубки в общей сложности 10-15 трубок.
- Погрузитесь кубов в 25 мМ NH 4 HCO 3 в 50% ацетонитрила, вихря, и отбросить супернатанты. Повторите дважды. сухойкубов в вакуумном концентраторе 18, 19.
- Увлажняет кубов с 10 мМ дитиотреитола (DTT), вихревые и центрифуги кратко. Инкубируют при 56 ° С в течение 1 часа. Удалите супернатант.
- Погрузитесь гель кубов в 55 мМ иодацетамида, вихря, и спина. Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин. Удалите супернатант.
- Погрузитесь кубов в 25 мМ NH 4 HCO 3, вихря, спина, и отбросить супернатант.
- Погрузитесь кубов в 25 мМ NH 4 HCO 3 в 50% ацетонитрила, вихря, и спина. Повторите 3.9 и 3.10.
- Сухие кубы в вакуумной концентратором. Добавьте 25 мкл секвенирование сорта модифицированного трипсина в 25 мМ NH 4 HCO 3, инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин, и отбрасывать избыток раствора. Погрузить кубики в 25 мМ NH 4 HCO 3 без трипсина и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
- Кратко спина кубы вниз и передать полученный пептид дополнительныйкт в новую пробирку. Добавить 30 мкл 5% -ной муравьиной кислоты в 50% ацетонитрила в кубах, вортексе в течение 30 мин, и спина. Смешайте супернатант с экстрактом. Сухие пептидные экстракты с вакуумным концентраторе до менее чем 5 мкл.
- Представить образцы для масс-спектрометрического основного средства для анализа ЖХ-МС / МС. Анализ данных МС, которые могут быть сгенерированы из программного обеспечения с открытым исходным кодом, как правило, включает в себя инвентарный номер для каждого белка идентифицирована, маркированная / немаркированные соотношения и количество уникальных пептидов, идентифицированных.
4. Вестерн-блоттинг Проверка
Примечание: Вестерн-блоттинг рекомендуется проверить результаты масс-спектрометрии.
- Последующие стандартные протоколы Вестерн-блоттинга и обеспечить, чтобы равное количество белка из каждой группы загружены. Использование антител против белков , представляющих интерес (например , аннексина A5, лактатдегидрогеназы B - цепи) , выявленных с помощью МС. Вестерн-блоттинга обнаружения, наряду с денситометрии analysis, может подтвердить, что идентификация белков MS и количественное определение являются правильными.
5. Анализ данных Протеомный
Примечание: Оценка качества данных, предварительная обработка данных, расчет и определение значимых кандидатов белка сделаны отдельно для каждой MS репликации. После того, как вышеуказанные анализы будут завершены, анализируемые данные повторах сравниваются и комбинированные 6, 20, 21.
- Оценка качества данных MS.
- Во-первых, log2 преобразование SILAC-MS маркированная / немаркированные соотношения белков в количественной оценке программе электронных таблиц.
- В научных графиков и статистического программного обеспечения, групповые отношения в 40-100 отношение бункеров и построить число коэффициентов в бункере для создания гистограммы. Нормальное распределение гистограммы указывает на хорошее качество данных MS 6. Сделайте этот шаг для всех MS размножается.
- Для повышения уверенности и точности коэффициентов пептидных MS, рассмотреть возможность удаления белков, которые имеют менее двух количественных пептидов.
- Чтобы определить , значительно вверх и вниз регулируется кандидатов белка, используйте следующие шаги для расчета значения порогов 22.
- В научных графиков и статистического программного обеспечения, генерировать нелинейной регрессии или кривой подгонки к данным распределения частот. Этот шаг дает значения, которые могут быть использованы для расчета значений среза. Вычислить значения светотеневой границы, как медиана ± 1,96 а, для 95% предельных величин или 2,56 сг на 99% предельных величин.
Примечание: Конкретные детали расчета отсечек можно найти на сайте Эммотт и др. 22. - Выберите кандидатов белка, чьи отношения либо больше, чем 1,96 (или 2,56) стандартных отклонений выше средней (значительно сверхвыражен) или ниже, чем 1,96 (или 2,56) стандартных отклонений ниже медианы (значительно недостаточно выражены).
- В научных графиков и статистического программного обеспечения, генерировать нелинейной регрессии или кривой подгонки к данным распределения частот. Этот шаг дает значения, которые могут быть использованы для расчета значений среза. Вычислить значения светотеневой границы, как медиана ± 1,96 а, для 95% предельных величин или 2,56 сг на 99% предельных величин.
- Сравните повторов идентифицированного выше значимых кандидатов для достижения согласованности. Убедитесь в том, что они отвечают следующим критериям, чтобы пройти этот заключительный этап отбора: кандидаты должны быть последовательно определены во всех повторах; и повторностях кандидата должны быть последовательными в их направлении регулирования (предпочтительно, по меньшей мере, 2 из 3-х повторах кандидата должны быть либо вверх или вниз регулируется регулируемым).
- Доработка данные для кандидатов, которые отвечают вышеупомянутым критериям путем объединения данных своих повторах.
6. Биоинформатика Проверка и определение характеристик
Примечание: Существующий геномных и биоинформатики информация предлагает огромное количество информации практически для каждого белка. Интеллектуальный анализ данных и анализ биоинформатики на этой информации может помочь в получении большое понимание в собственность и функциях значимых кандидатов. Это процесс, как правило, необходимо разработать соответствующие эксперименты вниз по течению мокрой лаборатории.
- Используя их номера GenBank , или идентификаторы UniProt, поиск кандидатов против текущих баз данных экзосом (Exocarta 23, Evpedia 24) , чтобы убедиться , что кандидат белки были ранее найдены в экзосома. Этот шаг добавляет уровень уверенности, что кандидаты действительно в экзосомы.
- http://www.exocarta.org/ Access, нажмите на кнопку "Запрос" и введите либо ген или белок, имя / присоединение. Сводка появится страница и доказательства в экзосома будет показано ниже, при условии, если есть.
- Поиск кандидатов против ВИЧ-1 и базы данных Взаимодействие человеческого белка 25. В качестве альтернативы, поиск конкретных баз данных, которые могут предоставить информацию о взаимодействии кандидата белков и условия испытания.
- Доступ к базе данных на www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVВзаимодействий. На записи "доменного имени белка ', введите имена кандидатов или инвентарные номера, и нажмите кнопку поиска. Результаты поиска могут дать представление о взаимодействии между ВИЧ-1 и кандидатов белка, и предполагают, кто из кандидатов может быть действительно ВИЧ-1 связаны.
- Импорт GenBank числа присоединение или идентификаторы UniProt кандидатов в программное обеспечение анализа GO (например, FunRich, функциональный обогатительной инструмент 26 анализа) и запустить программное обеспечение.
- Скачать программное обеспечение на http://www.funrich.org/. После установки, откройте программное обеспечение, при обогащении анализа, нажмите кнопку "Добавить набор данных", и загрузить список белков / генов. Затем выберите тип диаграммы для визуализации анализа GO.
Примечание: GO Результаты анализа будут визуализированы в виде круговых диаграмм. Этот шаг поможет нам получить представление о глобальной, связанной с кандидатами в области биологического процесса (BP), клеточный компонент (CС), и молекулярной функции (МФ).
- Скачать программное обеспечение на http://www.funrich.org/. После установки, откройте программное обеспечение, при обогащении анализа, нажмите кнопку "Добавить набор данных", и загрузить список белков / генов. Затем выберите тип диаграммы для визуализации анализа GO.
- Доступ к DAVID на http://david.ncifcrf.gov/ 27, нажмите кнопку "функциональная аннотация Tool" на своем веб - сайте. Введите список кандидатов, выберите "Идентификатор" гена, таких как "UniProt ID", выберите "Список ген" и поиска. Обогащенный GO термины, р-значения, а также другие параметры можно найти, перейдя на страницу "Аннотация Краткое изложение результатов" в категории "Gene_Ontology".
- Для того, чтобы исследовать потенциальные взаимодействия кандидатов с другими белками, открыто использовать базу данных , доступную 28 STRING для выяснения потенциальных взаимодействий белок-белковых и возможных биохимических путей.
Примечание: GO анализ и функциональная аннотация (раздел 6,3-6,4) также может быть выполнена с использованием последней версии программного обеспечения струна.- Доступ к базе данных на http://string-db.org/. Введите ID белок или последовательность в обозначенных хкоробка и нить поиск выбрать правильные виды для анализа. Нажмите кнопку "Поиск". Результаты будут давать информацию о как прямых (физических) и косвенных (функциональных) ассоциаций. Первые десять известных матчей за кандидата exosomal будут отображаться и должны быть рассмотрены для значительного отбора кандидатов.
Примечание: Большое количество информации, связанной с кандидатами могут быть проанализированы с использованием описанных выше действий. Наиболее значимые кандидаты могут быть выбраны для дальнейшего вниз по течению молекулярного и биохимического анализа.
- Доступ к базе данных на http://string-db.org/. Введите ID белок или последовательность в обозначенных хкоробка и нить поиск выбрать правильные виды для анализа. Нажмите кнопку "Поиск". Результаты будут давать информацию о как прямых (физических) и косвенных (функциональных) ассоциаций. Первые десять известных матчей за кандидата exosomal будут отображаться и должны быть рассмотрены для значительного отбора кандидатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1А представлена блок - схема с изложением процедуры 21 маркировки SILAC. Для того, чтобы очистить экзосомы, образцы должны быть осаждали с помощью центрифуги. На фиг.1В показаны этапы очистки экзосома от последовательного ультрацентрифугирования 21. После очистки экзосомы подлежат экспериментальной протеомики анализа, как описано в процедуре.
На фиг.2А показана схема последовательности операций для определения значимых кандидатов белка из протеомическим данных 21. Отобранные кандидаты затем используются для анализа вниз по течению протеомики. На фиг.2В показан пример SILAC гистограммы отображения репрезентативных соотношений типичных результатов Количественную оценку белка (этот показатель был изменен с Li и др. 6), а в таблице 1 представляет собойп Пример определения значения среза для значимых кандидатов 6 из этих соотношение SILAC гистограмм. Следуя инструкциям, описанным в разделе 6.3, были рассчитаны значения отсечки для определения значительно вверх или вниз регулируемых белков. В этом репрезентативных данных, белки с тяжелым / светом (H / L) соотношение выше верхнего значения отсечки считались значительно повышающей регуляции, в то время как белки с отношением / L H ниже нижнего значения отсечки считались значительно понижающей регуляции , Значительно регулируемые белки-кандидаты будут подвергнуты дальнейшему исследованию.
На рисунке 3 представлены общие процедуры анализа биоинформатики и интеллектуального анализа данных для выбранных значимых кандидатов. Таблица 2 представляет собой пример интеллектуального анализа данных , который использует экзосома и ВИЧ-1 / хост базы взаимодействия 6 с целью сбора информации о кандидатах (Эта вкладкале был изменен с Ли и др. 6). Добывая тока экзосома и базы данных взаимодействия с ВИЧ-1 / хост, тринадцать из четырнадцати кандидатов были найдены ассоциировать с экзосомы. Пять из четырнадцати кандидатов были также известно, взаимодействуют с ВИЧ-1. Среди них, четыре кандидата (hspa4, теплового шока 70 кДа белка 4; LDHB, L-лактат - дегидрогеназы В цепи NUTF2, ядерный транспортный фактор 2;; PTGES3, простагландин Е синтазы 3) были обнаружены ассоциировать с обоими экзосома и ВИЧ-1. Среди hspa4, NUTF2, PTGES3 и LDHB, только LDHB последовательно под экспрессируется в инфицированной фракции (тяжелая маркированы). Через ряд анализов, мы выбрали LDHB быть самым важным кандидатом, который может быть подвергнут дальнейшему изучению. Вниз по течению протеомики анализа показаны на рисунке 4. Рисунок 4A показывает краткие этапы генной онтологии (GO) анализа; Рисунок 4B перечислены этапы выполнени DAVIанализ D; Рисунок 4C показывает , как выполнить анализ сети с использованием струна. Фигуры 5А, 5В и 5С ДЭВИДА анализ набора четырнадцати белков в BP, CC и МФ; Рисунок 5D показывает десятку взаимодействующих партнеров LDHB; Рисунок 5E показывает , что большинство взаимодействующих партнеров LDHB, также связаны с экзосома и ВИЧ-1. Первоначальные результаты DAVID анализ показал, что многие кандидаты связанных с апоптозом и, вероятно, участвуют в связывании белка. Дальнейший анализ подтвердил, что СТРОКА LDHB связывающие партнеры также функционально и locationally связаны с экзосома и ВИЧ-1. Все эти результаты дают ценную информацию для потенциальных последующих исследований.
Рисунок 1: маркировка SILAC и очистка экзосом с использованием дифференциальной ультрацентрифугирования.(А) две группы клеток выращивают отдельно. Одна группа выращивают в среде меченого шесть удвоений для полной маркировки. Другая группа выращивают в нормальной среде немаркированной за тот же период. Затем меченые клетки инфицируют ВИЧ-1, в то время как немаркированные клетки не являются. И, наконец, экзосомы из обеих групп изолированы параллельно. (B) образцов (супернатанты или шарики) , используемые в центрифугирования при каждом шаге указаны в пробирках. Фракции, которые будут отброшены отмечены на правой стороне пробирок. Скорость и длительность каждого центрифугирования также показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Шаги для проверки Протеомические набора данных (ы) и определения существенного прокандидаты. белковые (А) Блок - схема определения значимых кандидатов белка из протеомического набора данных (ов). Эти четыре шага обеспечивают надежное выбор значимых кандидатов. Во-первых, SILAC отношение гистограмма график для оценки качества данных. Далее, менее идеальные кандидаты, которые могли бы уменьшить точность удалены. На третьем этапе, статистические методы используются, чтобы установить пороговые значения для значимости потенциальных кандидатов белка. Наконец, реплицировать данные о значительных кандидатов анализируются на предмет согласованности и объединяются в конечном итоге. (B) представитель Гистограмма коэффициентов SILAC. Гистограмма показало симметричное распределение вдоль отношения = 1 (log2 = 0) линии тренда. Коэффициенты log2 трансформировали сгруппированы в соотношении бункерах, а ось ординат показывает относительное количество обнаруженных соотношений в бункере. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: анализ и данные Общие процедуры биоинформатики горных работ для значимых кандидатов. Процедуры содержат добычу exosomal и ВИЧ-1 / хост данных, Джин Онтология характеристику, анализ и прогнозирование DAVID сети. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Шаги к выполнению гена онтологий характеристику, обогащение и пути анализа. (A) Шаги к выполнению гена онтологий (GO) характеристику. Для того, чтобы получить представление о функциях и субклеточных локализаций значимых кандидатов, шаги для проведения анализа с помощью приложения GOropriate программного обеспечения 26 проиллюстрированы. (B) шаги для проведения анализа обогащения GO Term. Для того, чтобы получить информацию по обогащению урана из значимых кандидатов, краткие шаги для выполнения анализа DAVID показаны. (C) Шаги к выполнению взаимодействия и анализа путей. Для выяснения возможных путей и найти функциональных партнеров, шаги для выполнения взаимодействия или сетевого анализа с помощью STRING показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Представитель DAVID и результаты анализа струна. Результаты обогащения (A) BP из четырнадцати кандидатов с помощью анализа Дэвиде. процессы, связанные клеточной смерти значительно обогащается. (B) CC enrichmen Результаты т четырнадцати кандидатов с помощью анализа Дэвиде. Многие белки имеют внутриклеточный происхождение. Результаты обогащения (C) BP из четырнадцати кандидатов с помощью анализа Дэвиде. Большинство кандидатов участвуют в связывании белка. (D) Десять взаимодействующих партнеров LDHB , идентифицированной STRING. (Е) Большинство партнеров LDHB также связаны с экзосома и ВИЧ-1, который также поддерживает роли LDHB в экзосома / ВИЧ-1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Представитель вычисление значений обрезания для значительного белка возмущения.
e2.jpg "/>
Таблица 2: Ассоциации между SILAC кандидатов и их exosomal локализаций и взаимодействия с ВИЧ-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В процедурах, описанных в этой статье, мы продемонстрировали применение методики SILAC, чтобы исследовать влияние ВИЧ-1-инфекции на хосте exosomal протеома. Первоначально неинфицированных и инфицированных ВИЧ-1 клетки дифференцированно меченого изотопом. Дифференциально меченые экзосомы затем очищают перед проведением экстракции белка. Затем жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии используют для анализа exosomal протеома. И, наконец, полученные данные масс-спектрометрии и потенциальные кандидаты белки подвергаются статистической и биоинформатики анализ, прежде чем вниз по течению биохимических вскрытий.
Критические шаги по всему протоколу необходимо соблюдать для достижения результатов оптимизированными. На начальных этапах протокола, маркировка SILAC может зависеть от типа клеток и маркировочной среды. Здоровые и высоко пролиферативные клетки должны быть использованы для получения высокой эффективности маркировки. Критически, маркировка мedium должен быть свежеприготовленным использованием диализовали фетальной бычьей сыворотки (FBS), а не регулярные FBS. Диализовали ФБС обедняется аминокислот и пептидов и, следовательно, менее вероятно, мешать маркировке SILAC. Следует, однако, отметить, что диализованной сыворотки не могут быть пригодны для некоторых клеточных линий, особенно первичных клеток. Нормальный рост в среде с диализованных ФБС должны быть подтверждены перед использованием стратегии SILAC. Кроме того, использование двойной "тяжелый" изотопной метки (13 C 6 L-лизина и 13 С 6 15 N 4 L-аргинин) , вместо того , чтобы использовать 13 C 6 L-лизина по отдельности, можно увеличить количество квантифицированных пептидов в масс - спектрометрии анализ. Минимальное количество клеток, необходимых для успешного последующего анализа протеома зависит от многих факторов, таких, чувствительность масс-спектрометра, масса каждой клетки, и протеомом целевой (весь протеома или посттрансляционных модифицированные белки). На основании наших выводов, мы рекомендуем десять миллионов клеток в качестве первоначальной суммы при расчете необходимого количества клеток, необходимых для масс-спектрометрии.
Экзосома изоляция из супернатантов клеточных культур может быть улучшена путем добавления стадии фильтрации следующим образом. Для получения суспензии клеток, начальный этап центрифугирования при 200g в течение 10 мин делается для удаления клеток , суспендированных в надосадочной жидкости , с последующей фильтрацией через фильтр 29, 30 0,22 мкм. Для адгезивных клеток, супернатант может быть собран непосредственно из культуры и фильтруют таким же образом. Фильтрация является важным шагом для отделения экзосомы от загрязняющих веществ, таких как небольшие молекулы и пептиды. В экзосомы затем может быть выделен из супернатанта с использованием классического метода ультрацентрифугирования или с использованием коммерчески доступных реагентов экзосома изолирующие комплекты. Чистота экзосома может быть проверена путем nanopartiАнализ отслеживания НКУ или электронной микроскопии 31.
Так как ВИЧ-1 вирионов, как правило, близки по размерам к экзосомы, они могут загрязнять экзосомы очищенные от ВИЧ-1-инфицированных образцов. В протеомическим экранах, потенциальные вирусные примеси могут быть отфильтрованы путем ограничения поиска в базе данных только для белков человека. Дальнейшие методы выделения с использованием установленных методик , таких как градиенты плотности йодиксанол и изоляции иммунноаффинной также может быть использован для отделения ВИЧ-1 вирионов из экзосомы 32, 33.
Далее мы обсудим некоторые предложения для обеспечения надежного анализа данных для выявления потенциально значимых кандидатов после получения результатов MS получаются из изолированных экзосомы. На начальном этапе анализа, соотношение гистограмма SILAC должен следовать нормальному распределению. Если распределение данных искажено в определенном направлении, то читатель должен был бы определить йе вызывают, прежде чем приступить к анализу. Например, меченые и немаркированные образцы не могут быть смешаны в равных пропорциях. Кроме того, некоторые пептиды могут не иметь значения соотношения SILAC тяжелые / легкие, и должны быть исключены из потенциальных кандидатов белка. После того, как выбраны кандидаты, программное обеспечение и базы данных могут быть использованы для проверки обогащения экзосома, взаимодействия с условиями испытаний, а также возможных путей. Взаимодействие между кандидатами белков и условия испытания должны быть добыты с помощью конкретных баз данных перед анализом биоинформатики. Для биоинформатики характеризации, генная онтология аннотации могут быть идентифицированы с использованием различного программного обеспечения и баз данных,
Техника SILAC, используемое здесь предлагает систематический и простой подход к анализу хост exosomal протеом. Большинство биомедицинских лабораторий сможет принять процедуры с минимальным дополнительным оборудованием и за дополнительную плату. Техника SILAC, однако, в первую очередь деподписал контракт исследований с использованием клеточных линий. Таким образом, другие методы, возможно, должны быть использованы для изучения различных биологических образцов. Например, метод без наклеек МРМ (множественный мониторинг реакции) могут быть использованы для целевого количественного определения белков и пептидов в клинических образцах 9, 34. В то время как в случае определения содержания белка на основе многочисленных исследований, метод SILAC также может быть использован для исследования двух или более образцов. Метод химической маркировки iTRAQ (изобарических метки для относительного и абсолютного количественного) или ТМТ основе (масс-тег тандем) методы позволяют гораздо выше мультиплексирование и будет лучше подходит для нескольких образцов.
Процедура, описанная здесь, не ограничивается протеомического характеристике экзосомы от инфицированных ВИЧ-1 клеток. С изменениями, он может быть адаптирован для анализа экзосомы в широком диапазоне испытательных и стрессовых условиях, таких как бактериальные инфекции, вирусные инфекции, и радиантельная. Он также подходит для изучения других субклеточных отсеков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ARRA дополнения к / Продолжительность жизни Тафтса / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 и K24HD080539 БР. Эта работа была также поддержана Фондом Продолжительность жизни пилотного исследования (# 701- 5857), Род-Айленд Фонда медицинских исследований Грант (# 20133969) и NIH Кобре URI / Роге пилотного исследования Grant (P20GM104317) ОД. Мы благодарим Джеймса Myall и Vy Dang за помощь в рукописи и фигурного подготовки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
