Summary
Ici, nous décrivons une méthode de protéomique quantitative en utilisant la technique de marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) pour analyser les effets du VIH-1 infection sur protéomes exosomales hôte. Ce protocole peut être facilement adapté à des cellules sous différentes contraintes ou infection conditions.
Introduction
De nombreuses maladies humaines, y compris les infections virales, sont souvent associés à des processus cellulaires distincts qui ont lieu dans et autour des cellules affectées. Les protéines, agissant souvent comme les effecteurs cellulaires ultimes, la médiation de ces processus. L'analyse des protéines peuvent souvent fournir des informations précieuses à l'environnement local des cellules affectées et nous aider à comprendre le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse de la maladie. Parmi les différentes techniques d'analyse des protéines, la protéomique tient particulièrement grande promesse. Comme un outil puissant, à grande échelle, la protéomique peut fournir une compréhension systémique des processus cellulaires, en particulier dans le domaine de la fonction et l'interaction des protéines. L'analyse des protéines spécifiques est simplifiée grâce au développement des techniques de marquage, qui permettent aux chercheurs de surveiller l'expression de composants cellulaires, en particulier des protéines, dans le site de l'enquête. Bien que de nombreuses analyses protéomiques ont été réalisées au cellulaireéchelle de protéome, caractérisations protéomiques sur des compartiments subcellulaires se sont révélés être particulièrement instructifs 1. Ceci est bien illustré dans les études de HIV-1 infection.
Exosomes, 30-100 vésicules membranaires nm sécrétées par une large gamme de types de cellules 2, 3, sont des composantes essentielles de la communication intercellulaire et de transport moléculaire. Ils ont déjà été découverts à jouer un rôle important dans le processus du VIH-1 en herbe 4, 5. En combinant l' analyse protéomique dissection fonctionnelle, nous avons constaté que les exosomes libérés par le VIH-1 des cellules infectées sont constitués d'une molécule de régulation unique et quantitativement différentes signatures de protéines et de ports qui ont un impact propriétés cellulaires sur des cellules réceptives, y compris l' apoptose et la prolifération cellulaire 6 voisine. Les méthodes sont décrites dans ce protocole,à savoir SILAC (de marquage isotopique stable par les acides aminés dans une culture cellulaire) 7 caractérisation protéomiques à base d'exosomes à partir du VIH-1 des cellules infectées. Des approches similaires peuvent être appliquées à mieux comprendre les autres compartiments intracellulaires pendant la pathogenèse en ajustant le stress expérimental au compartiment ou une fraction d'intérêt spécifique et apporter les changements nécessaires aux procédures décrites.
Compte tenu de l'évolution récente des méthodes protéomiques quantitatives, il y a beaucoup de choix lors de la sélection de la méthode la plus efficace pour une expérience particulière. Parmi ceux - ci sont la iTRAQ base chimique (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) 8 et le sans étiquette MRM (surveillance de réaction multiple) 9 techniques. Les deux méthodes sont des outils puissants et sont de bons choix pour les réglages spécifiques. Un laboratoire typique travaillant principalement avec des lignées cellulaires, cependant, ces deux méthodes ont relatively des coûts plus élevés et sont plus de temps par rapport à la méthode basée sur SILAC. SILAC est une technique de marquage métabolique à base qui intègre les formes isotopiques non radioactifs d'acides aminés à partir du milieu de culture dans les protéines cellulaires. Typiquement, les expériences SILAC commencent avec deux populations de cellules, par exemple, infectées et non infectées. Chacun est marqué de manière différentielle dans son environnement isotopique spécifique jusqu'à l'étiquetage complet est atteint. Les exosomes marqués de ces cellules sont ensuite soumises à une extraction des protéines. Une fois extraites, les protéines exosomales marquées sont analysées par chromatographie en phase liquide tandem spectroscopie de masse 10. Enfin, les résultats de spectrométrie de masse et les protéines marquées de façon significative sont soumis à des statistiques et bioinformatique analyses ainsi que la vérification biochimique rigoureuse. Nos rapports d'enquête précédents suggèrent que les procédures SILAC / exosomes sont plus appropriés pour les lignées cellulaires que les cellules primaires, comme les lignées cellulaires sont habituellement dans unétat de prolifération active efficace étiquetage isotopique,
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Protocol
1. Culture cellulaire et VIH-1 Infection
NOTE: Avant de commencer les expériences, il est recommandé de vérifier la viabilité des cellules par coloration au bleu Trypan 11 et leur prolifération par le biais d' un test MTT 12. Il est également essentiel d'utiliser milieu SILAC nouvellement préparé. Diverses lignées cellulaires peuvent être utilisés, tant qu'ils sont à un stade de prolifération active et sont sensibles à l'infection par le VIH-1, ou la condition de test de choix. Dans ce protocole, utiliser la lignée cellulaire H9 comme l'exemple.
- Semences 2 x 10 6 cellules H9 dans chaque flacon de culture cellulaire. Cultiver un groupe dans 10 ml marquées du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum dialyse de fœtus bovin (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lysine et 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginine. Cultiver l'autre groupe dans 10 ml de milieu non marqué RPMI 1640 avec 10% de FBS dialyse, 100 mg / L de L-lysine et 100 mg / L de L-arginine.
- Cultiver les cellules pendant six doublements à quel point les protéines des cellules dans le milieu marqué sont pratiquement totalement étiquetés (> 99%) avec des acides aminés lourds. Ajouter un milieu frais ou changer de support régulièrement (tous les 1-3 jours selon le type de cellule. Pour cellule H9, changement de milieu tous les 3 jours). A la fin du marquage, d' augmenter le volume de la culture (par exemple , ~ 30 ml) pour tenir compte de la croissance de plusieurs cellules.
REMARQUE: déterminer le temps de doublement cellulaire exacte au début de l'expérience, par la coloration au bleu Trypan et le comptage des cellules. - Infect les cellules marquées avec le VIH-1 en utilisant la norme NL4-3 VIH-1 protocole d'infection 13 pendant 48 heures. Incuber les cellules avec des quantités appropriées de virus à une multiplicité d'infection (MOI) d'environ 0,3. Vérifier infection VIH-1 p24 par quantification des surnageants de culture en utilisant un kit de l'antigène p24 du VIH-1 ELISA. Effectuer un test d'immunofluorescence 14 pour confirmer l' infection réussie de cellules. Keep la croissance des cellules non marquées dans un milieu non marqué sans infection VIH-1.
- Récolter les surnageants des deux groupes à la fin de l'infection (étape 2.1).
2. Exosome Isolation
NOTE: Grâce à une série d'étapes d'ultracentrifugation, fractions exosomales de surnageants de culture sont enrichis 15. Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 ° C, avec un rotor d'ultracentrifugation qui peuvent atteindre une vitesse d'au moins 100 000 x g.
- Collecter les surnageants des cultures dans 50 tubes coniques ml, en évitant les cellules. Centrifuger pendant 10 min à 300 xg pour éliminer les cellules restantes.
- Collecter les surnageants dans de nouveaux tubes de 50 ml coniques et centrifuger pendant 10 min à 2000 xg pour éliminer les cellules mortes. Transfert des surnageants dans les tubes de rotor compatible commerciaux qui sont capables de résister à une ultracentrifugation résultant.
- Assurez-vous d'équilibrer les tubes d'ultracentrifugation. Centrifuger les tubes pendant 30 minutes à 10.000 xg pour éliminerles débris cellulaires.
- Collecter les surnageants dans des tubes d'ultracentrifugation et centrifuger pour 70 min à 100 000 x g. Jeter les surnageants.
- Resuspendre les pellets exosomes riches dans 5 ml de PBS frais. Transférer les solutions dans des tubes d'ultracentrifugation frais et centrifuger à nouveau pendant 70 minutes à 100.000 x g.
- surnageants Jeter. Pour stocker les exosomes à long terme, remettre en suspension les pastilles dans 50 pl de PBS et conserver à -80 ° C. Sinon, passez directement à l'extraction des protéines, comme indiqué ci-dessous.
3. Protein Extraction et préparation
- Dissoudre isolés pellets exosomales dans 100-200 ul RIPA lyse et l'extraction avec un tampon ajouté cocktails d'inhibiteurs de la protéase. Le tampon est composé de 25 mM de Tris-chlorhydrate, chlorure de sodium 150 mM, 1% de NP-40, 1% de désoxycholate de sodium et 0,1% de SDS (sodium dodécyl sulfate), à pH 7,6. Les cocktails d'inhibiteur de protéase doivent contenir une variété d'inhibiteurs de protéase, tels que l'aprotinine, bestatine, leupeptin, pepstatine A et EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), qui peut inhiber une gamme complète de protéases.
- Centrifuger les solutions dissoutes pour 10 min à 13000 xg (4 ° C), et transférer les surnageants défrichées à de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
- Quantifier la concentration en protéine de chaque échantillon d'exosomes en utilisant l' acide bicinchoninique (BCA) ou Bradford dosage 16.
- Mélanger une quantité égale de protéines (2 pg) à partir d'échantillons étiquetés et non étiquetés et exécuter le mélange égal sur un gel SDS-PAGE 4-20% à 120 mA / 200 V pendant 30 min.
- Gel Stain au bleu de Coomassie suivie par détachage 17.
- En utilisant une lame de rasoir, coupe la voie de l'échantillon à partir du gel. Ensuite, couper la voie de gel en 10-15 morceaux égaux. Mettez chaque morceau en 1,5 ml tube frais de microcentrifugeuse pour un total de 10-15 tubes.
- Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3 dans 50% d' acétonitrile, vortex, et jeter surnageants. Répéter deux fois. Seccubes dans un concentrateur sous vide 18, 19.
- Réhydrater cubes avec 10 mM de dithiothréitol (DTT), vortex et centrifuger brièvement. Incuber à 56 ° C pendant 1 h. surnageant Jeter.
- Immergez cubes de gel dans 55 mM d'iodoacétamide, vortex, et de spin. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 45 minutes. surnageant Jeter.
- Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3, vortex, rotation, et éliminer le surnageant.
- Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3 dans 50% d' acétonitrile, vortex, et de spin. Répétez 3.9 et 3.10.
- Sécher les cubes dans un concentrateur sous vide. Ajouter 25 ul séquençage de grade trypsine modifié dans 25 mM NH 4 HCO 3, incuber à 4 ° C pendant 30 min, et jeter l'excès de solution. Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3 sans trypsine, et incuber une nuit à 37 ° C.
- tourner brièvement cubes vers le bas et transférer le peptide supplémentaire résultantct un nouveau tube. Ajouter 30 ul d'acide formique à 5% dans 50% d'acétonitrile aux cubes, vortex pendant 30 min, essorage. Combinez le surnageant avec l'extrait. Sécher les extraits peptidiques avec un concentrateur sous vide à moins de 5 ul.
- Soumettre des échantillons à la masse installation centrale de spectrométrie pour l'analyse LC-MS / MS. Les données d'analyse MS, qui peut être généré à partir d'un logiciel open source, comprend généralement un numéro d'adhésion pour chaque protéine identifiée, étiquetés / rapports non marqués et le nombre de peptides uniques identifiés.
4. Vérification Western blot
NOTE: Western blot est recommandé de vérifier les résultats de spectrométrie de masse.
- Suivre les protocoles de l'Ouest standard de transfert et de veiller à ce que des quantités égales de protéines de chaque groupe sont chargés. Utilisez des anticorps contre les protéines d'intérêt (par exemple A5 annexine, lactate déshydrogénase chaîne B) identifiés par MS. détection Western blot, avec densitométrie analysis, peut réaffirment que MS l'identification des protéines et la quantification sont corrects.
5. Analyse protéomique données
NOTE: L'évaluation de la qualité des données, le prétraitement des données, le calcul et la détermination des candidats de protéines importantes sont effectuées séparément pour chaque MS répliquer. Une fois les analyses ci - dessus sont terminées, les données analysées à partir de répétitions sont comparés et combinés 6, 20, 21.
- Évaluer la qualité des données MS.
- Tout d'abord, LOG2 transformer le SILAC-MS marqué / ratios non marqués de protéines quantifiées dans un programme de tableur.
- Dans graphique scientifique et logiciel statistique, regrouper les ratios dans 40-100 bacs ratio et tracer le nombre de rapports par bac pour générer un histogramme. Une distribution normale de l' histogramme indique une bonne qualité des données MS 6. Effectuez cette opération pour tous les MS se réplique.
- Pour accroître la confiance et la précision des rapports de peptides MS, envisager de supprimer des protéines qui ont moins de deux peptides quantifiés.
- Pour déterminer les candidats de protéines significativement haut et bas réglementé, utilisez les étapes suivantes pour calculer l' importance des seuils 22.
- Dans graphique scientifique et logiciel statistique, générer une régression non linéaire ou ajustement de courbe des données de distribution de fréquences. Cette étape donne des valeurs qui peuvent être utilisées pour calculer les valeurs de coupure. Calculer les valeurs de coupure que médiane ± 1,96 σ pour les limites de confiance à 95% ou 2,56 σ pour les limites de confiance de 99%.
NOTE: Les détails spécifiques de calcul des seuils peuvent être trouvés à Emmott et al. 22. - Sélectionnez les candidats de protéines dont les ratios sont soit supérieur à 1,96 (ou 2,56) écarts types au-dessus de la médiane (nettement sur-exprimé) ou inférieure à 1,96 (ou 2,56) écarts types en dessous de la médiane (significativement sous-exprimé).
- Dans graphique scientifique et logiciel statistique, générer une régression non linéaire ou ajustement de courbe des données de distribution de fréquences. Cette étape donne des valeurs qui peuvent être utilisées pour calculer les valeurs de coupure. Calculer les valeurs de coupure que médiane ± 1,96 σ pour les limites de confiance à 95% ou 2,56 σ pour les limites de confiance de 99%.
- Comparez les répétitions des candidats importants identifiés ci-dessus pour assurer la cohérence. Veiller à ce qu'ils répondent aux critères suivants pour passer cette étape finale de sélection: les candidats doivent être systématiquement identifiés dans toutes les répétitions; et répétitions d'un candidat doivent être cohérentes dans leur direction de la réglementation (de préférence, au moins 2 de 3 répétitions d'un candidat devrait être soit régulée à la hausse ou à la baisse réglementée).
- Finaliser données pour les candidats qui répondent aux critères mentionnés ci-dessus en fusionnant les données de leurs répétitions.
6. Bioinformatics Vérification et caractérisation
REMARQUE: l'information génomique et bioinformatique existant offre une mine d'informations pour presque toutes les protéines. L'exploration de données et l'analyse bioinformatique de cette information peuvent aider à gagner beaucoup de perspicacité dans la propriété et les fonctions des candidats importants. Cette procéss est généralement nécessaire de concevoir des expériences de laboratoire humide en aval appropriés.
- En utilisant leurs numéros GenBank d'adhésion ou les ID UniProt, rechercher les candidats contre les bases de données exosomes actuelles (Exocarta 23, Evpedia 24) pour vérifier que les protéines candidates ont déjà été trouvés dans exosomes. Cette étape ajoute une couche de confiance que les candidats sont en effet en exosomes.
- Accès http://www.exocarta.org/, cliquez sur "Rechercher" et l'entrée soit le gène ou la protéine nom / numéro d'adhésion. Une page de résumé apparaît et la preuve en exosomes sera montré, à condition, s'il y a lieu.
- Rechercher les candidats contre le VIH-1 et la protéine humaine Interaction Database 25. Vous pouvez également rechercher les bases de données spécifiques qui peuvent fournir des informations sur l'interaction des protéines candidates et la condition de test.
- Accédez à la base de données www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions. Lors de l'entrée «protéine du nom de domaine ', entrez les noms des candidats ou des numéros d'accès, puis cliquez sur rechercher. Les résultats de recherche peuvent donner un aperçu des interactions entre le VIH-1 et les candidats de protéines, et de proposer des candidats qui pourraient être vraiment le VIH-1 associé.
- Importation GenBank numéros d'adhésion ou UniProt ID des candidats dans le logiciel d'analyse GO (comme FunRich, enrichissement fonctionnel outil d'analyse 26) et exécuter le logiciel.
- Téléchargez le logiciel à http://www.funrich.org/. Après l'installation, ouvrez le logiciel, en cours d'analyse d'enrichissement, cliquez sur "Ajouter Data Set", et télécharger la liste des protéines / gènes. Ensuite, sélectionnez le type de graphique pour visualiser l'analyse de GO.
NOTE: GO résultats de l'analyse seront visualisées sous forme de diagrammes circulaires. Cette étape nous aide à mieux comprendre globale associée avec les candidats dans les domaines du processus biologique (BP), le composant cellulaire (CC), et fonction moléculaire (MF).
- Téléchargez le logiciel à http://www.funrich.org/. Après l'installation, ouvrez le logiciel, en cours d'analyse d'enrichissement, cliquez sur "Ajouter Data Set", et télécharger la liste des protéines / gènes. Ensuite, sélectionnez le type de graphique pour visualiser l'analyse de GO.
- Accès DAVID au http://david.ncifcrf.gov/ 27, cliquez sur le "outil d' annotation fonctionnelle" sur son site Internet. Entrez la liste des candidats, sélectionnez le "Identifier" du gène tel que le "UniProt ID", sélectionnez "Liste Gene" et la recherche. Les termes enrichis GO, p-valeurs, et d'autres paramètres peuvent être trouvés en cliquant sur la page "Annotation Sommaire des résultats" dans la catégorie "Gene_Ontology".
- Pour étudier les interactions potentielles des candidats avec d' autres protéines, utiliser ouvertement accessible la base de données STRING 28 pour élucider les interactions protéine-protéine potentiels et possibles voies biochimiques.
NOTE: GO Analyse et Annotation fonctionnelle (section 6,3-6,4) peut également être effectuée en utilisant le dernier logiciel de STRING.- Accédez à la base de données http://string-db.org/. Entrez l'ID de protéine ou séquence dans les s désignéscase echerche et sélectionner les espèces correctes pour l'analyse. Cliquez sur "Rechercher". Les résultats donneront des informations sur les deux associations directes (physiques) et indirects (fonctionnels). Les dix premiers matchs connus pour le candidat de exosomal seront affichés et doivent être pris en considération pour la sélection des candidats importants.
NOTE: Une grande partie des informations associées aux candidats peut être analysé en utilisant les étapes ci-dessus. Les candidats les plus importants peuvent être choisis pour une analyse moléculaire et biochimique en aval.
- Accédez à la base de données http://string-db.org/. Entrez l'ID de protéine ou séquence dans les s désignéscase echerche et sélectionner les espèces correctes pour l'analyse. Cliquez sur "Rechercher". Les résultats donneront des informations sur les deux associations directes (physiques) et indirects (fonctionnels). Les dix premiers matchs connus pour le candidat de exosomal seront affichés et doivent être pris en considération pour la sélection des candidats importants.
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Representative Results
La figure 1A est un organigramme décrivant la procédure d'étiquetage SILAC 21. Afin de purifier les exosomes, les échantillons doivent être décélérée par centrifugeuse. Figure 1B montre les étapes de purification d'exosomes par ultracentrifugation série 21. Une fois purifiés, les exosomes sont soumis à des analyses protéomiques expérimental tel que décrit dans la procédure.
La figure 2A est un organigramme pour la détermination des candidats de protéines importantes à partir de données protéomiques 21. Les candidats sélectionnés sont ensuite utilisés pour aval analyse protéomique. La figure 2B est un exemple d'histogramme SILAC affichant des rapports représentatifs des résultats typiques de protéines de quantification (Cette figure a été modifié par Li et al . 6), et le tableau 1 estn exemple de la détermination des valeurs de coupure pour les candidats significatifs 6 de ces ratios de SILAC histogrammes. En suivant les étapes décrites à la section 6.3, les valeurs limites pour la détermination des protéines de manière significative le haut ou vers le bas réglementés ont été calculés. Dans cet ensemble de données représentatives, les protéines avec un lourd / léger (H / L) ratio supérieur à la valeur de coupure supérieure ont été considérés comme significativement régulée à la hausse, tandis que les protéines avec un rapport H / L en dessous de la valeur limite inférieure ont été considérés comme significativement régulée vers le bas . Significativement protéines candidates réglementées seraient soumis à une enquête plus approfondie.
La figure 3 montre les analyses bioinformatiques et extraction de données des procédures générales pour les candidats importants sélectionnés. Le tableau 2 est un exemple d'extraction de données qui utilise des bases de données d'interaction exosomes et le VIH-1 / hôte 6 pour recueillir des informations sur les candidats (Cet ongletle a été modifié par Li et al. 6). Par l' exploitation minière exosomes actuelle et les bases de données d'interaction VIH-1 / hôte, treize des quatorze candidats ont été trouvés à associer à exosomes. Cinq sur les quatorze candidats sont également connus pour interagir avec le VIH-1. Parmi eux, quatre candidats (HSPA4, choc thermique de 70 kDa protéine 4; NUTF2, facteur de transport nucléaire 2; PTGES3, prostaglandine E synthase 3; LDHB, chaîne déshydrogénase B L-lactate) ont été trouvés à associer à la fois exosomes et le VIH-1. Parmi HSPA4, NUTF2, PTGES3 et LDHB, seulement LDHB était constamment sous-exprimé dans la fraction infectée (lourde étiqueté). Grâce à une série d'analyses, nous avons choisi LDHB être le candidat le plus important, qui pourrait être soumis à une étude plus approfondie. Les analyses protéomiques en aval sont affichées sur la figure 4. La figure 4A montre une brève étapes de l' ontologie de gène (GO) d'analyse; La figure 4B répertorie les étapes de DAVI exécuterAnalyse D; Figure 4C montre comment effectuer une analyse de réseau en utilisant STRING. Les figures 5A, 5B et 5C sont l' analyse DAVID d'un ensemble de quatorze protéines dans BP, CC et MF; Figure 5D montre les dix premiers partenaires d' interaction de LDHB; La figure 5E montre que la majorité des partenaires d' interaction de LDHB sont également associés à des exosomes et du VIH-1. Les premiers résultats d'analyse DAVID ont suggéré que de nombreux candidats sont liés à l'apoptose et susceptibles de participer à la protéine de liaison. Une analyse plus approfondie STRING a confirmé que la liaison LDHB partenaires sont fonctionnellement liés à locationally et exosomes et le VIH-1. Tous ces résultats donnent des informations précieuses pour les enquêtes en aval potentiels.
Figure 1: étiquetage SILAC et la purification de exosomes utilisant ultracentrifugation différentielle.(A) Deux groupes de cellules sont cultivées séparément. Un groupe est cultivé dans un milieu marqué six doublements pour l'étiquetage complet. L'autre groupe est cultivé dans le milieu non marqué normal pour la même période. Ensuite, les cellules marquées sont infectées par le VIH-1, tandis que les cellules non marquées ne sont pas. Enfin, exosomes des deux groupes sont isolés en parallèle. (B) des échantillons (surnageant ou pastilles) utilisés dans la centrifugation à chaque étape sont indiqués dans les tubes à essai. Fractions à être mis au rebut sont notés sur le côté droit des tubes à essai. La vitesse et la longueur de chaque centrifugation sont également représentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Étapes à suivre pour valider ensemble de données (s) protéomique et la détermination pro significativecandidats Tein. (A) Organigramme de détermination des candidats de protéines importantes du jeu de données (s) protéomique. Ces quatre étapes assurent la sélection fiable des candidats importants. Tout d'abord, un rapport d'histogramme de SILAC est tracée pour évaluer la qualité des données. Suivant les candidats, moins idéales qui pourraient réduire la précision sont supprimés. Dans la troisième étape, les méthodes statistiques sont utilisées pour définir des seuils de signification pour les candidats protéiques potentiels. Enfin, les données répliquées des candidats importants sont analysés pour déterminer l'uniformité et sont fusionnées par la suite. (B) de l' histogramme représentant des ratios de SILAC. L'histogramme a révélé une répartition symétrique le long rapport = 1 (log2 = 0) la ligne de tendance. Les rapports de log2 transformé sont regroupés dans des bacs de rapport, et l'axe des y montre le nombre relatif de rapports détectés par bin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: les procédures d'extraction d'analyse et de données bioinformatiques globales pour les candidats importants. Les procédures contiennent l'exploration de données exosomales et le VIH-1 / hôte, Gene Ontology caractérisation, analyse DAVID et la prédiction de réseau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Étapes à suivre pour effectuer la caractérisation génétique ontologie, l' enrichissement et la voie des analyses. (A) Étapes à suivre pour effectuer l' ontologie génétique (GO) la caractérisation. Pour mieux comprendre les fonctions et les localisations subcellulaires des candidats importants, les étapes à effectuer une analyse de GO en utilisant l'applicationun logiciel de ropriate 26 sont illustrés. (B) les étapes à effectuer GO Terme analyse de l' enrichissement. Pour obtenir des informations d'enrichissement des candidats importants, de brèves étapes à effectuer une analyse DAVID sont présentés. (C) Étapes à suivre pour effectuer l' interaction et l' analyse des voies. Pour élucider les voies possibles et trouver des partenaires fonctionnels, des mesures pour effectuer une interaction ou d'analyse de réseau en STRING sont représentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Représentant DAVID et les résultats d'analyse de STRING. Les résultats d'enrichissement (A) BP des quatorze candidats par analyse DAVID. processus liés cellulaire de la mort sont considérablement enrichis. (B) CC enrichmen t résultats des quatorze candidats par analyse DAVID. De nombreuses protéines ont une origine intracellulaire. Les résultats d'enrichissement (C) BP des quatorze candidats par analyse DAVID. La plupart des candidats participent à la protéine de liaison. (D) Les dix partenaires d' interaction de LDHB identifiés par STRING. (E) La majorité des partenaires de LDHB sont également associés à des exosomes et le VIH-1, qui supporte en outre le rôle des exosomes dans LDHB / VIH-1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: calcul représentant des valeurs de coupure pour importante perturbation de la protéine.
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Tableau 2: Les associations entre les candidats SILAC et leurs localisations exosomales et les interactions avec le VIH-1.
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Discussion
Dans les procédures décrites dans le présent document, nous avons démontré l'application de la technique de SILAC pour étudier l'effet du VIH-1 infection sur le protéome exosomal hôte. Initialement, les cellules infectées et non infectées du VIH-1 sont différentiellement marquée par un isotope. Les exosomes marquées de façon différentielle sont ensuite purifiés avant d'effectuer l'extraction des protéines. Ensuite, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem est utilisée pour analyser le protéome exosomal. Enfin, les données de spectrométrie de masse résultant et protéines candidats potentiels sont soumis à des statistiques et analyses bioinformatiques avant dissections biochimiques en aval.
Les étapes critiques à travers le protocole doivent être suivies pour obtenir des résultats optimisés. Dans les premières étapes du protocole, l'étiquetage des SILAC pourrait être affectée par le type de cellule et le milieu de marquage. Les cellules saines et hautement prolifératives devraient être utilisés pour obtenir une grande efficacité de l'étiquetage. Critique, l'étiquetage moyen doit être fraîchement préparée en utilisant du sérum dialysé fœtal bovin (FBS) plutôt que régulière FBS. FBS dialyse est appauvrie en acides aminés et des peptides, et est donc moins susceptible d'interférer avec l'étiquetage SILAC. Il convient cependant de noter que le sérum dialysé peut ne pas convenir pour certaines lignées cellulaires, en particulier des cellules primaires. La croissance normale dans le milieu avec FBS dialysés doit être confirmée avant d'employer la stratégie de SILAC. En outre, en utilisant le double "lourd" marquage isotopique (13 C 6 L-lysine et 13 C 6 15 N 4 L-arginine) au lieu d'utiliser 13 C 6 L-lysine seul, peut augmenter le nombre de peptides quantifiés dans la spectrométrie de masse une analyse. Le nombre minimal de cellules nécessaires pour le succès de l'analyse du protéome ultérieur dépend de nombreux facteurs, par exemple la sensibilité du spectromètre de masse, la masse de chaque cellule, et protéome (protéines modifiées protéome tout ou post-traductionnelles ciblé). Sur la base de nos résultats, nous recommandons dix millions de cellules comme un montant initial pour estimer le nombre approprié de cellules nécessaires à la spectrométrie de masse.
l'isolement exosomes à partir de surnageants de culture cellulaire peut être améliorée par l'ajout d'une étape de filtration de la manière suivante. La suspension de cellules, une étape de centrifugation initiale à 200 x g pendant 10 min est effectuée pour éliminer les cellules en suspension dans le surnageant, puis par filtration à travers un filtre de 0,22 um 29, 30. Pour les cellules adhérentes, le surnageant peut être recueilli directement à partir de la culture et on le filtre de la même manière. La filtration est une étape critique pour la séparation des exosomes à partir de matières contaminantes, telles que des petites molécules et des peptides. Les exosomes peuvent ensuite être isolés à partir du surnageant en utilisant le procédé d'ultracentrifugation classique, ou en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce d'isolement exosomes kits. La pureté de la exosomes peut être vérifiée par nanoparticle analyse de suivi ou la microscopie électronique 31.
Depuis que le VIH-1 virions sont généralement de taille similaire à exosomes, ils peuvent contaminer les exosomes purifiés à partir du VIH-1 échantillons infectés. Dans les écrans protéomiques, les contaminants viraux potentiels peuvent être filtrés en limitant la recherche uniquement aux protéines humaines de base de données. D' autres techniques d'isolement en utilisant les méthodes établies , telles que les gradients de densité iodixanol et l' isolement d'immunoaffinité peuvent aussi être utilisés pour séparer les virions VIH-1 à partir des exosomes 32, 33.
Ensuite, nous discutons quelques suggestions pour assurer une analyse fiable des données pour identifier les candidats potentiellement importants une fois que les résultats obtenus à partir de MS sont exosomes isolés. Dans la première étape de l'analyse, le rapport histogramme SILAC devrait suivre une distribution normale. Si la distribution des données est biaisée dans une direction particulière, le lecteur devrait déterminer ee causer avant de procéder à l'analyse. Par exemple, les échantillons marqués et non marqués peuvent ne pas avoir mélangés dans des proportions égales. En outre, certains peptides peuvent ne pas avoir des valeurs de rapport de SILAC lourds / légers, et doivent être éliminés des candidats protéiques potentiels. Après sélection des candidats, les logiciels et les bases de données peuvent être utilisées pour vérifier l'enrichissement d'exosomes, les interactions avec les conditions d'essai, et les voies possibles. Les interactions entre les protéines candidates et les conditions d'essai doivent être exploitées par le biais des bases de données spécifiques avant l'analyse bioinformatique. Pour bioinformatique caractérisations, les annotations de l' ontologie des gènes peuvent être identifiés en utilisant différents logiciels et bases de données,
La technique de SILAC employée ici propose une approche systématique et directe à l'analyse exosomal hôte protéome. La plupart des laboratoires biomédicaux seraient en mesure d'adopter les procédures avec un équipement supplémentaire minime et des frais supplémentaires. La technique de SILAC, cependant, est principalement désigné pour les études utilisant des lignées cellulaires. En tant que tel, peut-être besoin d'être employé pour étudier les différents échantillons biologiques d'autres méthodes. Par exemple, le procédé sans étiquette MRM (suivi de réactions multiples) peut être utilisée pour la quantification ciblée des protéines et des peptides dans des échantillons cliniques 9, 34. Alors que dans le cas de la détermination de la teneur en protéines provenant de plusieurs études, la technique de SILAC peut également être utilisé pour étudier deux ou plusieurs échantillons. La méthode de marquage chimique iTRAQ (Les étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) ou à base de TMT (tandem marqueur de masse) méthodes permettent le multiplexage beaucoup plus élevé et seraient mieux adaptés à de multiples échantillons.
La procédure décrite ici ne se limite pas à la caractérisation protéome des exosomes à partir du VIH-1 des cellules infectées. Avec des modifications, il peut être adapté pour analyser les exosomes dans une large gamme de conditions d'essai et de stress telles que l'infection bactérienne, une infection virale, et le radianiation. Il est également adapté à l'étude d'autres compartiments subcellulaires.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un supplément ARRA à la Lifespan / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 et K24HD080539 à BR. Ce travail a également été soutenue par le Fonds Lifespan Pilot Research (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20133969) et NIH COBRE URI / RIH pilote de subventions de recherche (P20GM104317) à ML. Nous remercions James Myall et Vy Dang pour l'aide à la préparation des manuscrits et de la figure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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