SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de protéomique quantitative en utilisant la technique de marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) pour analyser les effets du VIH-1 infection sur protéomes exosomales hôte. Ce protocole peut être facilement adapté à des cellules sous différentes contraintes ou infection conditions.

Résumé

La protéomique est l’analyse à grande échelle des protéines. Les techniques protéomiques, telles que la spectroscopie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS), peuvent caractériser des milliers de protéines à la fois. Ces techniques puissantes nous permettent d’avoir une compréhension systémique des changements cellulaires, en particulier lorsque les cellules sont soumises à divers stimuli, tels que des infections, des stress et des conditions de test spécifiques. Même avec les développements récents, l’analyse du protéome exosomal prend du temps et implique souvent des méthodologies complexes. De plus, le grand ensemble de données qui en résulte nécessite souvent une analyse robuste et rationalisée afin que les chercheurs puissent effectuer d’autres études en aval. Ici, nous décrivons un protocole basé sur SILAC pour caractériser le protéome exosomal lorsque les cellules sont infectées par le VIH-1. La méthode est basée sur le marquage isotopique simple, l’isolement des exosomes à partir de cellules marquées différentiellement et l’analyse par spectrométrie de masse. S’ensuit une exploration détaillée des données et une analyse bio-informatique des résultats protéomiques. Les ensembles de données et les candidats qui en résultent sont faciles à comprendre et offrent souvent une mine d’informations utiles pour l’analyse en aval. Ce protocole s’applique à d’autres compartiments subcellulaires et à un large éventail de conditions d’essai.

Introduction

De nombreuses maladies humaines, y compris les infections virales, sont souvent associés à des processus cellulaires distincts qui ont lieu dans et autour des cellules affectées. Les protéines, agissant souvent comme les effecteurs cellulaires ultimes, la médiation de ces processus. L'analyse des protéines peuvent souvent fournir des informations précieuses à l'environnement local des cellules affectées et nous aider à comprendre le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse de la maladie. Parmi les différentes techniques d'analyse des protéines, la protéomique tient particulièrement grande promesse. Comme un outil puissant, à grande échelle, la protéomique ....

Protocole

1. Culture cellulaire et VIH-1 Infection

NOTE: Avant de commencer les expériences, il est recommandé de vérifier la viabilité des cellules par coloration au bleu Trypan ¹¹ et leur prolifération par le biais d' un test MTT ^12. Il est également essentiel d'utiliser milieu SILAC nouvellement préparé. Diverses lignées cellulaires peuvent être utilisés, tant qu'ils sont à un stade de prolifération active et sont sensibles à l'infection par le VIH-1, ou la condition de test de choix. Dans ce protocole, utiliser la lignée cellulaire H9 comme l'exemple.

1. Semences 2 x 10....

Résultats

La figure 1A est un organigramme décrivant la procédure d'étiquetage SILAC ^21. Afin de purifier les exosomes, les échantillons doivent être décélérée par centrifugeuse. Figure 1B montre les étapes de purification d'exosomes par ultracentrifugation série ^21. Une fois purifiés, les exosomes sont soumis à des analyses protéomiques expérimental tel que décrit dans la procédure.

Discussion

Dans les procédures décrites dans le présent document, nous avons démontré l'application de la technique de SILAC pour étudier l'effet du VIH-1 infection sur le protéome exosomal hôte. Initialement, les cellules infectées et non infectées du VIH-1 sont différentiellement marquée par un isotope. Les exosomes marquées de façon différentielle sont ensuite purifiés avant d'effectuer l'extraction des protéines. Ensuite, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem est utilisée pour analyser le pro.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire H9	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT kit de dosage	Thermo Fisher	V13154
Sérum bovin fœtal dialysé (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit &ndash ; RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 pour SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 pour SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA	kit PerkinElmer	NEK050001KT
Centrifugeuse réfrigérée super-rapide	Eppendorf	22628045
Ultracentrifugeuse réfrigérée	Beckman Coulter	363118	Devrait pouvoir atteindre 100 000 x g
50 mL Tubes de centrifugation coniques	Thermo Fisher	14-432-22
Tubes d’ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
tampon RIPA	Thermo Fisher	89900
Cocktails inhibiteurs de protéase	Thermo Fisher	; 78430
ThermoMixeur  ;		Eppendorf
BCA  ;	Thermo Fisher	23250
Spectrophotomètre	Biorad	1702525
SDS PAGE Appareil à gel	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20 % Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel réactif de coloration	Sigma Aldrich	G1041
Séquençage Grade Trypsine	modifiée Promega	V5111
Concentrateur SpeedVac	Thermo Fisher	SPD131DDA
Anticorps contre l’annexine humaine A5	Abcam	ab14196
Anticorps contre la chaîne B de lactate déshydrogénase humaine	Abcam	ab53292
Logiciel graphique et statistique Système	;	Complot Sigma  ;	ou GraphPad prism
Suite logicielle de protéomique quantitative	Institut Max Planck de biochimie	Maxquant  ;
Logiciels et bases de données	Divers fournisseurs		Reportez-vous au texte principal pour plus de détails

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