Summary
A continuación, describimos un método de proteómica cuantitativa mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para analizar los efectos de la infección por VIH-1 en proteomas exosomal anfitrión. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a las células bajo diferentes condiciones de estrés o infección.
Introduction
Muchas enfermedades humanas, incluyendo las infecciones virales, a menudo se asocian con procesos celulares distintivas que tienen lugar en y alrededor de las células afectadas. Proteínas, actuando a menudo como los efectores celulares en última instancia, a mediar en estos procesos. El análisis de las proteínas a menudo puede proporcionar información muy valiosa sobre el medio ambiente local de las células afectadas y nos ayudan a comprender el mecanismo subyacente de la patogénesis de la enfermedad. Entre las diversas técnicas de análisis de proteínas, proteómica es válido especialmente una gran promesa. Como una herramienta de gran alcance, a gran escala, la proteómica pueden proporcionar una comprensión sistémica de procesos celulares, particularmente en el área de la función y la interacción de las proteínas. El análisis de las proteínas específicas se hace más simple mediante el desarrollo de técnicas de etiquetado, que permiten a los investigadores para controlar la expresión de los componentes celulares, particularmente proteínas, en el sitio de investigación. Aunque muchos análisis proteómicos se han realizado en el celularescala proteoma, caracterizaciones proteómicos en compartimentos subcelulares han demostrado ser particularmente informativa 1. Esto se ejemplifica también en los estudios de la infección por VIH-1.
Los exosomas, 30-100 nm vesículas de membrana secretadas por una amplia gama de tipos de células 2, 3, son componentes críticos de la comunicación intercelular y el transporte molecular. Fueron descubiertos previamente a jugar un papel importante en el proceso de gemación del VIH-1 4, 5. Mediante la combinación de análisis proteómico con disección funcional, se encontró que los exosomas liberados de las células infectadas por VIH-1 se componen de una firma de proteínas y moléculas reguladoras puerto únicos y cuantitativamente diferentes que afectan a las propiedades celulares en células receptivas, incluyendo la apoptosis y la proliferación celular 6 vecina. Los métodos se describen en este protocolo,a saber SILAC (etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular) 7 basado caracterización proteómico de exosomas de células infectadas por VIH-1. Enfoques similares se pueden aplicar para entender mejor otros compartimentos subcelulares durante la patogénesis mediante el ajuste de la tensión experimental para el compartimento o fracción de interés específico y hacer los cambios necesarios a los procedimientos descritos.
Dado el reciente desarrollo de métodos cuantitativos proteómicos, hay muchos para elegir a la hora de seleccionar el método más eficiente para un experimento particular. Entre ellas se encuentran la iTRAQ basada en productos químicos (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) 8 y el MRM libre de etiquetas (monitorización de reacción múltiple) 9 técnicas. Ambos métodos son herramientas potentes y son buenas opciones para la configuración específica. Para un laboratorio típico de trabajo principalmente con líneas celulares, sin embargo, estos dos métodos tienen relatively mayores costos y son más tiempo en comparación con el método basado SILAC. SILAC es una técnica de etiquetado en base metabólica que incorpora formas isotópicas no radiactivas de aminoácidos de los medios de cultivo en las proteínas celulares. Típicamente, los experimentos SILAC comienzan con dos poblaciones de células, por ejemplo, infectadas y no infectadas. Cada uno está marcado diferencialmente en su entorno isotópica específica hasta que se logre el etiquetado completo. Los exosomas marcados de estas células se someten entonces a la extracción de proteínas. Una vez extraídas, las proteínas exosomal marcadas se analizaron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem 10. Finalmente, los resultados de espectrometría de masas y las proteínas marcadas de manera significativa son sometidos a estadística y análisis de la bioinformática, así como la comprobación bioquímica riguroso. Nuestros informes de investigación anteriores sugieren que los procedimientos de SILAC / exosoma son más apropiados para las líneas de células que las células primarias, ya que las líneas celulares son por lo general en unaestado de proliferación activa para el etiquetado isotópico eficiente,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivo celular y la infección por VIH-1
NOTA: Antes de comenzar los experimentos, se recomienda comprobar la viabilidad de las células mediante la tinción de azul de tripano 11 y su proliferación a través de un ensayo de MTT 12. También es fundamental utilizar medio SILAC recién preparado. Varias líneas celulares se pueden utilizar, siempre y cuando se encuentren en una fase activa de proliferación, y son susceptibles a la infección por VIH-1, o la condición de prueba de elección. En este protocolo, utilizar la línea celular H9 como el ejemplo.
- Semilla 2 x 10 6 células H9 en cada frasco de cultivo celular. Crecer un grupo en 10 ml etiquetados RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal dializado (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lisina y 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginina. Crecer el otro grupo no marcado en 10 ml de medio RPMI 1640, con 10% de FBS dializado, 100 mg / L de L-lisina y 100 mg / L de L-arginina.
- Cultivar las células durante seis duplicaciones momento en el que las proteínas de las células en el medio marcado se prácticamente completamente etiquetados (> 99%) con los aminoácidos pesados. Añadir medio fresco o cambiar los medios de comunicación regularmente (cada 1-3 días, dependiendo del tipo de célula. Para células H9, cambio de medio cada 3 días). Al final del etiquetado, aumentar el volumen de cultivo (por ejemplo, ~ 30 ml) para acomodar el crecimiento de más células.
NOTA: Determinar celular exacto tiempo de duplicación en el inicio del experimento a través de la tinción con azul de tripano y el recuento de células. - Infectar a las células marcadas con el VIH-1 NL4-3 utilizando el estándar del VIH-1 protocolo de infección 13 durante 48 horas. Se incuban las células con cantidades apropiadas de virus con una multiplicidad de infección (MOI) alrededor de 0,3. Compruebe infección por VIH-1 mediante la cuantificación p24 de los sobrenadantes de cultivo utilizando un antígeno p24 kit ELISA VIH-1. Realizar un ensayo de inmunofluorescencia 14 para confirmar la infección exitosa de células. Keep cultivo de las células no marcadas en medio sin marcar y sin infección por VIH-1.
- Recoger los sobrenadantes de ambos grupos al final de la infección (paso 2.1).
2. Aislamiento exosoma
NOTA: A través de una serie de pasos de ultracentrifugación, fracciones exosomal de sobrenadantes de cultivo se enriquecen 15. Realizar todos los pasos siguientes a 4 ° C, con un rotor de ultracentrífuga que pueden alcanzar una velocidad de al menos 100.000 x g.
- Recoger los sobrenadantes de los cultivos en tubos cónicos de 50 ml, evitando las células. Centrifugar durante 10 min a 300 xg para eliminar las células restantes.
- Recoger los sobrenadantes en nuevos tubos de 50 ml cónicos y centrifugar durante 10 min a 2.000 xg para eliminar las células muertas. Transferencia resultante sobrenadantes a tubos de tipo comercial con capacidad para un rotor que son capaces de soportar ultracentrifugación.
- Asegúrese de equilibrar los tubos de ultracentrífuga. Centrifugar los tubos durante 30 min a 10.000 xg para eliminarrestos celulares.
- Recoger los sobrenadantes en tubos de ultracentrífuga y centrifugar durante 70 minutos a 100.000 x g. Descartar el sobrenadante.
- Resuspender los pellets de exosoma ricos en 5 ml de PBS fresco. La transferencia de las soluciones a tubos de ultracentrífuga frescas y centrifugar de nuevo durante 70 minutos a 100.000 x g.
- sobrenadantes de descarte. Para almacenar los exosomas a largo plazo, volver a suspender los pellets en 50 l de PBS y se almacena a -80 ° C. Como alternativa, proceder directamente a la extracción de proteínas como se muestra a continuación.
3. La proteína de extracción y preparación
- Disolver gránulos exosomal aislados en 100-200 l RIPA lisis y extracción de memoria intermedia con un cóctel inhibidor de la proteasa añadido. El tampón se compone de 25 mM Tris-hidrocloruro, cloruro de sodio 150 mM, desoxicolato de sodio al 1% NP-40, 1% y 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sodio), a pH 7,6. Los cócteles inhibidores de proteasa deben contener una variedad de inhibidores de la proteasa, tales como aprotinina, bestatina, leupeptin, pepstatina A y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), que puede inhibir una amplia gama de proteasas.
- Centrifugar las soluciones disueltas durante 10 minutos a 13.000 xg (4 ° C), y transferir los sobrenadantes despejadas a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Cuantificar la concentración de proteínas de cada muestra de exosomas usando ácido bicinconınico (BCA) o ensayo de Bradford 16.
- Mezclar una cantidad igual de proteínas (2 g) a partir de muestras marcadas y no marcadas y ejecutar la mezcla a partes iguales en un gel de SDS-PAGE al 4-20% a 120 mA / 200 V durante 30 min.
- Gel de mancha con azul de Coomassie seguido de decoloración 17.
- El uso de una cuchilla de afeitar, cortar el carril de la muestra a partir del gel. A continuación, cortar el carril de gel en 10-15 piezas iguales. Poner cada pieza en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para un total de 10-15 tubos.
- Sumergir los cubos en 25 mM NH 4 HCO 3 en 50% de acetonitrilo, vórtice, y desechar los sobrenadantes. Repetir dos veces. Secocubos en un concentrador de vacío 18, 19.
- Rehidratar cubos con ditiotreitol 10 mM (DTT) y agitar y centrifugar brevemente. Incubar a 56 ° C durante 1 hr. sobrenadante de descarte.
- Sumergir cubos de gel en 55 mM yodoacetamida, vórtice, y el giro. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 min. sobrenadante de descarte.
- Sumergir los cubos en 25 mM NH 4 HCO 3, vórtice, giro, y desechar el sobrenadante.
- Sumergir los cubos en 25 mM NH 4 HCO 3 en 50% de acetonitrilo, vórtice, y el giro. Repita 3.9 y 3.10.
- Secar los cubos en un concentrador de vacío. Añadir tripsina modificada 25 l la secuencia grado en 25 mM NH 4 HCO 3, se incuba a 4 ° C durante 30 minutos, y desechar el exceso de solución. Sumergir los cubos en 25 mM NH 4 HCO 3 sin tripsina, y se incuba durante la noche a 37 ° C.
- En resumen girar los cubos de abajo y transferir el péptido resultante supletoriact a un nuevo tubo. Añadir 30 l de ácido fórmico 5% en 50% de acetonitrilo a los cubos, de vórtice durante 30 min, y centrifugado. Combinar el sobrenadante con el extracto. Se secan los extractos peptídicos con un concentrador de vacío a menos de 5 l.
- Enviar muestras para facilidad de la base de espectrometría de masas para el análisis LC-MS / MS. El análisis de datos de MS, que puede ser generada por el software de código abierto, por lo general incluye un número de acceso para cada proteína identificada, marcadas proporciones / sin etiqueta y el número único de péptidos identificados.
4. Western Blotting Verificación
NOTA: Western Blot se recomienda para verificar los resultados de espectrometría de masas.
- Seguir los protocolos estándar de transferencia de Western y asegurar que cantidades iguales de proteína de cada grupo están cargados. Utilizar anticuerpos contra las proteínas de interés (por ejemplo anexina A5, la cadena B de lactato deshidrogenasa) identificados por la EM. detección de transferencia de Western, junto con analysi densitometrías, se reafirman que la EM identificación y cuantificación de proteínas son correctos.
5. Análisis de los datos proteómicos
NOTA: La evaluación de la calidad de los datos, el tratamiento previo de datos, cálculo y determinación de proteínas candidatos importantes se realizan por separado para cada MS replican. Una vez que se hayan completado los análisis anteriores, los datos analizados a partir de réplicas se comparan y combinan 6, 20, 21.
- Evaluar la calidad de los datos de EM.
- En primer lugar, log2 transformar la SILAC-MS etiquetado / sin etiqueta proporciones de proteínas cuantificadas en un programa de hoja de cálculo.
- En la representación de la Ciencia y el software estadístico, el grupo de los ratios en relación de 40-100 contenedores y trazar el número de coeficientes por bandeja para generar un histograma. Una distribución normal de histograma indica la buena calidad de los datos MS 6. Hacer este paso para todos los Estados miembros se replica.
- Para aumentar la confianza y la exactitud de las proporciones de péptidos MS, considerar la eliminación de las proteínas que tienen menos de dos péptidos cuantificados.
- Para determinar los candidatos de proteína significativamente arriba y hacia abajo regulada, utilice los siguientes pasos para calcular la significación de los umbrales 22.
- En gráfica científica y software estadístico, generar una regresión no lineal o curva de ajuste a los datos de distribución de frecuencia. Este paso produce valores que se pueden utilizar para calcular los valores de corte. Calcular los valores de corte como mediana ± 1,96 σ para los límites de confianza del 95% o 2,56 σ para los límites de confianza del 99%.
NOTA: Los detalles específicos del cálculo de los puntos de corte se pueden encontrar en Emmott et al. 22. - Seleccionar a los candidatos de proteínas cuyas proporciones son o superior a 1,96 (o 2,56) desviaciones estándar por encima de la mediana (significativamente sobreexpresado) o inferior a 1,96 (o 2,56) desviaciones estándar por debajo de la mediana (significativamente bajo-expresado).
- En gráfica científica y software estadístico, generar una regresión no lineal o curva de ajuste a los datos de distribución de frecuencia. Este paso produce valores que se pueden utilizar para calcular los valores de corte. Calcular los valores de corte como mediana ± 1,96 σ para los límites de confianza del 95% o 2,56 σ para los límites de confianza del 99%.
- Comparación de las réplicas de los candidatos significativos identificados anteriormente para lograr la consistencia. Asegúrese de que se cumplan los siguientes criterios para pasar esta etapa de selección final: los candidatos deben ser identificadas consistentemente en todas las repeticiones; y réplicas de un candidato deben ser consistentes en su dirección de regulación (preferiblemente, al menos 2 de cada 3 repeticiones de un candidato debe ser o bien hasta reguladas o hacia abajo-regulado).
- Finalizar los datos de los candidatos que cumplan con los criterios antes mencionados mediante la fusión de los datos de sus réplicas.
6. Verificación de Bioinformática y Caracterización
NOTA: La información existente genómica y la bioinformática ofrece una gran cantidad de información para casi todas las proteínas. La minería de datos y análisis de la bioinformática en esa información puede ayudar en la obtención de una gran cantidad de información sobre la propiedad y las funciones de los candidatos importantes. este process es generalmente necesario diseñar experimentos de laboratorio húmedo aguas abajo adecuadas.
- Usando sus números de acceso de GenBank y los ID de UniProt, buscar en los candidatos contra las bases de datos actuales (exosome Exocarta 23, Evpedia 24) para verificar que las proteínas candidatas se han encontrado previamente en exosomas. Este paso agrega una capa de confianza en que los candidatos son de hecho en exosomas.
- http://www.exocarta.org/ de acceso, haga clic en "Consulta" y de entrada ya sea el gen o proteína de nombre / número de la adhesión. Una página de resumen aparecerá y se mostrará la evidencia en exosomas, siempre si hay alguna.
- Buscar en los candidatos contra el VIH-1 y la base de datos de interacción proteína humana 25. Otra posibilidad es buscar las bases de datos específicas que pueden proporcionar información sobre la interacción de las proteínas candidatas y la condición de prueba.
- Acceder a la base de datos en www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteracciones. En la entrada «nombre de dominio de la proteína ', introduzca los nombres de los candidatos o los números de acceso y haga clic en búsqueda. Los resultados de la búsqueda pueden dar una idea de las interacciones entre las proteínas candidatos del VIH-1 y, y sugerir cuál de los candidatos podría ser realmente el VIH-1 asociado.
- Importación GenBank números de acceso u UniProt identificadores de los candidatos en el software de análisis de IR (como FunRich, herramienta de análisis funcional de enriquecimiento 26) y ejecutar el software.
- Descargar el software en http://www.funrich.org/. Después de la instalación, abra el software, bajo enriquecimiento de análisis, haga clic en "Agregar conjunto de datos", y cargar la lista de proteínas / genes. A continuación, seleccione el tipo de gráfico para visualizar el análisis de GO.
NOTA: GO resultados del análisis serán visualizados en forma de gráficos circulares. Este paso nos ayuda a ganar la penetración global asociado con los candidatos en las áreas de procesos biológicos (BP), componente celular (CC), y la función molecular (MF).
- Descargar el software en http://www.funrich.org/. Después de la instalación, abra el software, bajo enriquecimiento de análisis, haga clic en "Agregar conjunto de datos", y cargar la lista de proteínas / genes. A continuación, seleccione el tipo de gráfico para visualizar el análisis de GO.
- DAVID acceso a http://david.ncifcrf.gov/ 27, haga clic en la "Herramienta de anotación funcional" en su sitio web. Introduzca la lista de candidatos, seleccionar el "identificador" del gen, tales como el "UniProt ID", seleccione "lista de genes" y la búsqueda. Los términos enriquecido GO, los valores de p, y otros parámetros se pueden encontrar haciendo clic en la página "Resumen de los Resultados de anotación" en la categoría "Gene_Ontology".
- Para investigar las posibles interacciones de los candidatos con otras proteínas, utilizar la base de datos de libre acceso STRING 28 para dilucidar posibles interacciones proteína-proteína y las posibles vías bioquímicas.
NOTA: GO Análisis y anotación funcional (Sección 6.3 a 6.4) también se puede realizar utilizando el software más reciente cadena.- Acceder a la base de datos en http://string-db.org/. Especifique la ID de proteína o secuencia en los s designadosCaja de bús y seleccionar la especie correcta para su análisis. Haga clic en "Buscar". Los resultados darán información sobre ambas asociaciones directas (físicas) e indirectos (funcionales). Los diez primeros partidos conocidos para el candidato exosomal se mostrarán y deben ser considerados para la selección significativa candidato.
NOTA: Una gran cantidad de información asociada a los candidatos puede ser analizada mediante los pasos anteriores. Los candidatos más significativos pueden ser elegidos para su posterior análisis molecular y bioquímico posterior.
- Acceder a la base de datos en http://string-db.org/. Especifique la ID de proteína o secuencia en los s designadosCaja de bús y seleccionar la especie correcta para su análisis. Haga clic en "Buscar". Los resultados darán información sobre ambas asociaciones directas (físicas) e indirectos (funcionales). Los diez primeros partidos conocidos para el candidato exosomal se mostrarán y deben ser considerados para la selección significativa candidato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1A es un diagrama de flujo esbozar el procedimiento de etiquetado SILAC 21. Con el fin de purificar los exosomas, las muestras deben ser centrifugadas a través de la centrífuga. La Figura 1B muestra las etapas de purificación por ultracentrifugación exosome de serie 21. Una vez purificados, los exosomas son objeto de un análisis proteómico experimental como se indica en el procedimiento.
La Figura 2A es un diagrama de flujo para la determinación de proteínas candidatos significativas de datos proteómicos 21. Los candidatos seleccionados se utilizan para el análisis de proteómica aguas abajo. La figura 2B es un ejemplo de histograma SILAC se presentan proporciones representativas de los resultados típicos de cuantificación de proteínas (Esta figura se ha modificado de Li et al. 6), y en la Tabla 1 es unan ejemplo de la determinación de los valores de corte para los candidatos importantes 6 de estos histogramas relación de SILAC. Siguiendo los pasos descritos en la sección 6.3, se calcularon los valores de corte para la determinación de proteínas significativamente positiva o negativamente regulados. En este conjunto de datos representativos, las proteínas con un pesado / ligero (H / L) Relación por encima del valor de corte superior se consideraron como significativamente hasta reguladas, mientras que las proteínas con una relación H / L por debajo del valor de corte inferior se consideraron como significativamente reducido regulado . Significativamente candidatos proteínas reguladas serían sometidos a una investigación adicional.
La Figura 3 muestra los procedimientos generales de análisis de la bioinformática y la minería de datos para los candidatos seleccionados significativos. Tabla 2 es un ejemplo de minería de datos que utiliza bases de datos de interacción de exosoma y el VIH-1/6 de acogida para reunir información sobre los candidatos (Esta pestañaLe ha sido modificado a partir de Li et al. 6). Por la minería exosome actual y las bases de datos de interacción del VIH-1 / anfitrionas, trece de los catorce candidatos se encontraron a asociarse con exosomas. Cinco de los catorce candidatos también se sabe que interactúan con el VIH-1. Entre ellos, cuatro candidatos (hspa4, de choque térmico 70 kDa proteína 4; LDHB, cadena deshidrogenasa B-L lactato NUTF2, transporte nuclear factor 2;; PTGES3, la prostaglandina E sintasa 3) se encontraron para asociar tanto con exosoma y el VIH-1. Entre hspa4, NUTF2, PTGES3 y LDHB, solamente LDHB fue consistentemente bajo-expresados en la fracción infectada (pesado etiquetado). A través de una serie de análisis, se seleccionaron LDHB ser el candidato más significativa, lo que podría ser sometido a un estudio adicional. Los análisis de proteómica aguas abajo se muestran en la Figura 4. La Figura 4A muestra breves pasos de la ontología de genes (GO) el análisis; La figura 4B muestra los pasos de la realización de DAVILa determinación de D; La figura 4C muestra cómo realizar el análisis de red utilizando una cuerda. Las figuras 5A, 5B y 5C son el análisis de DAVID de un conjunto de catorce proteínas en BP, CC y MF; La figura 5D muestra los diez mejores socios que interactúan de LDHB; Figura 5E muestra que la mayoría de los socios que interactúan de LDHB también se asocian con exosoma y el VIH-1. Los resultados iniciales de análisis DAVID sugirieron que muchos candidatos están relacionados con la apoptosis y es probable que participan en la unión a proteínas. Un análisis más detallado STRING confirmó que LDHB parejas de unión también están funcionalmente y locationally relacionadas con exosoma y el VIH-1. Todos estos resultados proporcionan información valiosa para posibles investigaciones posteriores.
Figura 1: SILAC etiquetado y la purificación de exosomas usando ultracentrifugación diferencial.(A) Dos grupos de células se cultivan por separado. Uno de los grupos se cultiva en un medio marcado por seis doblajes para el etiquetado completo. El otro grupo se cultiva en el medio sin marcar normal para el mismo período. A continuación, las células marcadas se infectan con VIH-1, mientras que las células no marcadas no lo son. Por último, los exosomas de ambos grupos están aislados en paralelo. (B) Las muestras (sobrenadantes o pellets) utilizadas en la centrifugación a cada paso se indican en los tubos de ensayo. Las fracciones que sean descartados se anotan en el lado derecho de tubos de ensayo. También se muestran la velocidad y la longitud de cada centrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos para la validación de datos (s) proteómica y la determinación de pro significativacandidatos tein. (A) Diagrama de flujo de la determinación de proteínas candidatos importantes del conjunto de datos (s) proteómico. Estos cuatro pasos aseguran una selección fiable de candidatos importantes. En primer lugar, una relación de histograma SILAC se traza para evaluar la calidad de los datos. A continuación, los candidatos menos ideales que podrían reducir la precisión se eliminan. En la tercera etapa, se utilizan métodos estadísticos para establecer los umbrales de significación para los candidatos potenciales de proteína. Finalmente, los datos replicados de los candidatos importantes se analizan para la consistencia y se fusionan con el tiempo. (B) histograma Representante de relaciones de SILAC. El histograma reveló distribución simétrica a lo largo ratio = 1 (log2 = 0) la línea de tendencia. Las relaciones de log2 transformado se agrupan en contenedores de relación, y el eje y muestra el número relativo de relaciones detectadas por bin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: procedimientos de minería bioinformática general de análisis de datos y para los candidatos importantes. Los procedimientos incluyen la minería de datos exosomal y el VIH-1 / anfitrionas, la caracterización genética de Ontología, el análisis y la predicción DAVID red. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los pasos para realizar la caracterización de la ontología de genes, el enriquecimiento y la vía de análisis. (A) Pasos para realizar la caracterización de genes ontología (GO). Para obtener una perspectiva de las funciones y localizaciones subcelulares de los candidatos importantes, pasos para realizar el análisis de GO utilizando aplicacionessoftware ropriate 26 se ilustran. (B) Las medidas para la realización de análisis de enriquecimiento GO plazo. Para obtener información enriquecimiento de los candidatos importantes, se muestran breves pasos para realizar el análisis de DAVID. (C) Pasos para realizar la interacción y el análisis de la vía. Para dilucidar las posibles vías y encontrar parejas funcionales, pasos para realizar la interacción o el análisis de redes de STRING se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Representante David y los resultados del análisis de cadena. Resultados de enriquecimiento (A) de la PA de los catorce candidatos por análisis de DAVID. procesos relacionados con la muerte de las células se enriquecen de manera significativa. (B) enrichmen CC t resultados de los catorce candidatos por análisis de DAVID. Muchas proteínas tienen un origen intracelular. Resultados de enriquecimiento (C) de la PA de los catorce candidatos por análisis de DAVID. La mayoría de los candidatos participan en la proteína de unión. (D) Los diez socios de LDHB identificado por CADENA interactuar. (E) La mayoría de los socios LDHB también se asocian con exosoma y el VIH-1, que apoya aún más las funciones de LDHB en exosoma / VIH-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Cálculo del Representante de los valores de corte para la perturbación significativa de proteínas.
e2.jpg "/>
Tabla 2: Las asociaciones entre los candidatos SILAC y sus localizaciones exosomal e interacciones con el VIH-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En los procedimientos descritos en este documento, hemos demostrado la aplicación de la técnica SILAC para investigar el efecto de la infección por VIH-1 en el proteoma exosomal anfitrión. Inicialmente, las células infectadas no infectados y el VIH-1 son diferencialmente marcado con isótopo. Los exosomas diferencialmente marcadas se purificaron entonces antes de realizar la extracción de proteínas. A continuación, se emplea cromatografía de líquido tándem espectrometría de masas para analizar el proteoma exosomal. Finalmente, los datos de espectrometría de masa resultante y proteínas candidatos potenciales son sometidos a estadística y análisis de la bioinformática antes de disecciones bioquímicos aguas abajo.
Los pasos críticos en todo el protocolo se deben seguir para obtener resultados optimizados. En las etapas iniciales del protocolo, el etiquetado SILAC podría verse afectada por el tipo de célula y el medio de etiquetado. Las células sanas y altamente proliferativas deben utilizarse para obtener una alta eficacia de marcado. Críticamente, el etiquetado medio y se deberá preparar utilizando suero bovino fetal dializado (FBS) en lugar de FBS regular. FBS dializado se agota de aminoácidos y péptidos, y es, por lo tanto, menos probable que interfiera con el etiquetado SILAC. Debe, sin embargo, se observó que el suero dializado puede no ser adecuado para algunas líneas de células, especialmente células primarias. El crecimiento normal en el medio con FBS dializado debe confirmarse antes de emplear la estrategia de SILAC. Además, utilizando el etiquetado de isótopos doble "pesada" (13 C 6 L-lisina y 13 C 6 15 N 4 L-arginina) en lugar de utilizar 13 C 6 L-lisina por separado, puede aumentar el número de péptidos cuantificados en el espectrometría de masas análisis. El número mínimo de células necesarias para el éxito del análisis del proteoma posterior depende de muchos factores, tales la sensibilidad del espectrómetro de masas, la masa de cada célula, y el proteoma dirigido (proteoma total o después de la traducción proteínas modificadas). En base a los resultados, se recomienda diez millones de células en forma de una cantidad inicial en la estimación del número apropiado de células necesarias para la espectrometría de masas.
aislamiento exosoma a partir de sobrenadantes de cultivo de células se puede mejorar mediante la adición de una etapa de filtración de la siguiente manera. Para la suspensión de células, una etapa de centrifugación inicial a 200 xg durante 10 min se realiza para extraer células suspendidas en el sobrenadante, seguido por filtración a través de un filtro 29, 30 0,22 micras. Para células adherentes, el sobrenadante puede ser recogido directamente a partir del cultivo y se filtró de la misma manera. La filtración es un paso crítico para la separación de exosomas de materiales contaminantes, tales como moléculas pequeñas y péptidos. Los exosomas se pueden aislar a partir del sobrenadante mediante el método de ultracentrifugación clásica, o el uso de kits comercialmente disponibles reactivos de aislamiento de exosoma. La pureza de la exosoma puede ser verificada mediante nanopartiEl análisis de seguimiento CLE o microscopía electrónica 31.
Dado que el VIH-1 viriones son típicamente de tamaño similar a los exosomas, que pueden contaminar exosomas purificados a partir de muestras infectadas con VIH-1. En las pantallas de proteómica, posibles contaminantes virales pueden ser filtradas mediante la limitación de la búsqueda de base de datos sólo para las proteínas humanas. Otras técnicas de aislamiento utilizando metodologías establecidas tales como gradientes de densidad de iodixanol y el aislamiento por inmunoafinidad también se pueden utilizar para separar el VIH-1 viriones de exosomas 32, 33.
A continuación, se discuten algunas sugerencias para asegurar un análisis fiable de datos para identificar candidatos potencialmente significativos una vez que los resultados de la EM se obtienen de los exosomas aisladas. En el paso inicial del análisis, la relación de histograma SILAC debe seguir una distribución normal. Si la distribución de datos está sesgado en una dirección particular, el lector tendrá que determinar THe causar antes de proceder a su análisis. Por ejemplo, las muestras marcadas y no marcadas pueden no haber mezclado en proporciones iguales. También, algunos péptidos no pueden tener valores de la relación SILAC pesada / ligera, y debe ser eliminado de los potenciales candidatos de proteínas. Después se seleccionan los candidatos, software y bases de datos se pueden emplear para verificar el enriquecimiento exosome, las interacciones con las condiciones de prueba, y las posibles vías. Las interacciones entre las proteínas candidatas y las condiciones de ensayo deben ser extraídos a través de bases de datos específicas antes del análisis bioinformática. Para bioinformática caracterizaciones, las anotaciones de ontología de genes pueden ser identificados utilizando distintos programas informáticos y bases de datos,
La técnica empleada aquí SILAC ofrece un enfoque sistemático y sencillo para el análisis del proteoma exosomal anfitrión. La mayoría de los laboratorios biomédicos serían capaces de adoptar los procedimientos con equipo adicional mínimo y el costo extra. La técnica SILAC, sin embargo, es DE principalmentefirmado por los estudios que utilizan líneas celulares. Como tal, otros métodos pueden necesitar ser empleado para estudiar diferentes muestras biológicas. Por ejemplo, el método libre de etiqueta MRM (monitorización de reacción múltiple) puede ser utilizado para la cuantificación específica de proteínas y péptidos en muestras clínicas 9, 34. Mientras que en el caso de la determinación de contenido de proteína de múltiples estudios, la técnica SILAC también se puede utilizar para investigar dos o más muestras. El método de marcaje químico iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) o (etiqueta de masas en tándem) con sede en TMT métodos permiten mucho más alta multiplexación y serían adecuados-mejor para múltiples muestras.
El procedimiento descrito aquí no se limita a la caracterización proteómico de exosomas de células infectadas por VIH-1. Con modificaciones, se puede adaptar para analizar exosomas en una amplia gama de condiciones de prueba y de estrés tales como la infección bacteriana, infección viral, y radiation. También es adecuado para el estudio de otros compartimentos subcelulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un suplemento de ARRA a la vida útil / Tufts / Castaño CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, y K24HD080539 a la BR. Este trabajo también fue apoyado por el Fondo de Investigación Piloto Vida útil (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20133969), y los NIH COBRE URI / RIH Investigación Piloto Grant (P20GM104317) a ML. Agradecemos a James Myall y Vy Dang para obtener ayuda con la preparación del manuscrito y la figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
