Summary
Qui, descriviamo un metodo di proteomica quantitativa utilizzando la tecnica di etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per analizzare gli effetti di HIV-1 su proteomi exosomal host. Questo protocollo può essere facilmente adattato alle cellule in diverse condizioni di stress o infezione.
Introduction
Molte malattie umane, tra cui le infezioni virali, sono spesso associate a processi cellulari distintivi che si svolgono dentro e intorno alle cellule colpite. Le proteine, spesso in qualità di effettori cellulari finale, mediare questi processi. L'analisi delle proteine, spesso in grado di fornire informazioni preziose per l'ambiente locale di cellule colpite e ci aiutano a comprendere il meccanismo alla base della patogenesi della malattia. Tra le varie tecniche di analisi delle proteine, la proteomica tiene particolarmente grande promessa. Come un potente strumento, su larga scala, proteomica possono fornire una comprensione sistemica di processi cellulari, in particolare nella zona della funzione e l'interazione di proteine. Analizzando proteine specifiche è resa più semplice grazie allo sviluppo di tecniche di marcatura, che consentono investigatori per monitorare l'espressione di componenti cellulari, in particolare proteine, nel sito di indagine. Anche se molte analisi proteomica sono stati effettuati a livello cellularescala proteoma, caratterizzazioni proteomica su compartimenti subcellulari hanno dimostrato di essere particolarmente informativo 1. Questo è esemplificato bene negli studi di HIV-1.
Esosomi, 30-100 vescicole di membrana nm secreti da una vasta gamma di tipi di cellule 2, 3, sono componenti critici di comunicazione intercellulare e di trasporto molecolare. Essi sono stati scoperti in precedenza a svolgere ruoli importanti nella HIV-1 in erba processo di 4, 5. Grazie alla combinazione di analisi proteomica con dissezione funzionale, abbiamo scoperto che esosomi rilasciati da HIV-1 le cellule infettate sono composti da un unico e quantitativamente diversi firma proteine e molecole regolatrici del porto che hanno un impatto proprietà cellulari su cellule vicine ricettive, tra cui l'apoptosi cellulare e la proliferazione 6. I metodi sono descritti in questo protocollo,vale a dire SILAC (etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura) 7 sulla caratterizzazione proteomica di esosomi da HIV-1 le cellule infette. Approcci simili possono essere applicati per comprendere meglio altri compartimenti subcellulari durante patogenesi regolando stress sperimentale al compartimento o frazione di specifico interesse e di apportare modifiche necessarie alle procedure descritte.
Dato il recente sviluppo di metodi di proteomica quantitativa, ci sono molti tra cui scegliere quando si seleziona il metodo più efficiente per un particolare esperimento. Tra questi ci sono il iTRAQ chimico-based (tag isobariche per la quantificazione relativa e assoluta) 8 e il libero etichetta MRM (monitoraggio reazione multipla) 9 tecniche. Entrambi i metodi sono strumenti potenti e sono buone scelte per le impostazioni specifiche. Per un laboratorio tipico lavorando principalmente con linee cellulari, tuttavia, questi due metodi hanno relatively costi più elevati e sono più tempo rispetto al metodo basato SILAC. SILAC è una tecnica di marcatura metabolica based che integra forme isotopiche non radioattivi di aminoacidi dal terreno di coltura in proteine cellulari. In genere, gli esperimenti SILAC cominciano con due popolazioni di cellule, per esempio, infetti e non infetti. Ciascuno è differenzialmente etichettati nel suo ambiente isotopico specifico fino al raggiungimento della etichettatura. I exosomes etichettati di queste cellule vengono poi sottoposti ad estrazione delle proteine. Una volta estratti, le proteine exosomal marcate vengono analizzati utilizzando cromatografia liquida tandem massa spettroscopia 10. Infine, i risultati di spettrometria di massa e proteine significativamente marcate sono sottoposti a statistica e bioinformatica analisi e verifica rigorosa biochimico. I nostri rapporti investigativi precedenti suggeriscono che le procedure SILAC / exosome sono più appropriati per linee cellulari di cellule primarie, come linee cellulari sono di solito in unstato proliferante attivo per l'etichettatura isotopica efficiente,
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Protocol
1. Colture cellulari e HIV-1
NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, si consiglia di verificare la vitalità delle cellule attraverso Trypan Blue colorazione 11 e la loro proliferazione attraverso un saggio di MTT 12. E 'inoltre fondamentale utilizzare media SILAC appena preparata. Varie linee cellulari possono essere usati, purché siano in fase attiva proliferativa, e sono suscettibili di HIV-1, o la condizione di test di scelta. In questo protocollo, usare la linea cellulare H9 come l'esempio.
- Seed 2 x 10 6 cellule H9 in ciascun pallone di coltura cellulare. Grow un gruppo in 10 ml etichettati terreno RPMI 1640 contenente 10% siero bovino fetale dializzato (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lisina e 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginina. Grow l'altro gruppo in 10 ml senza etichetta terreno RPMI 1640 con 10% FBS dializzato, 100 mg / L di L-lisina e 100 mg / L di L-arginina.
- Far crescere le cellule per sei raddoppi a quel punto le proteine delle cellule nel mezzo etichettato sono praticamente completamente etichettati (> 99%) con aminoacidi pesanti. Aggiungere mezzi freschi o cambiare supporto regolarmente (ogni 1-3 giorni a seconda del tipo di cellula. Per cellule H9, cambiare media ogni 3 giorni). Alla fine di etichettatura, aumentare il volume di coltura (per es ~ 30 ml) per accogliere la crescita di nuove cellule.
NOTA: Determinare cella esatto tempo di raddoppio all'inizio dell'esperimento tramite colorazione Trypan blu e conteggio delle cellule. - Infettare le cellule marcate con HIV-1 NL4-3 utilizzando standard di HIV-1 infezione protocollo 13 per 48 ore. Incubare le cellule con quantità appropriate di virus con una molteplicità di infezione (MOI) circa 0,3. Controllare HIV-1 da p24 quantificazione dei sovranatanti di coltura utilizzando un kit di p24 HIV-1 ELISA. Eseguire un test di immunofluorescenza 14 per confermare l'infezione con successo delle cellule. Keep crescere le cellule non etichettati in media senza etichetta, senza HIV-1.
- Raccogliere i supernatanti di entrambi i gruppi alla fine di infezione (passo 2.1).
2. Isolamento Exosome
NOTA: Attraverso una serie di passaggi ultracentrifugazione, frazioni exosomal da sovranatanti sono arricchiti 15. Eseguire le seguenti operazioni a 4 ° C, con un rotore Ultracentrifuge che può raggiungere una velocità di almeno 100.000 x g.
- Raccogliere i surnatanti delle colture in 50 ml provette coniche, evitando le cellule. li centrifugare per 10 minuti a 300 xg per rimuovere le cellule rimanenti.
- Raccogliere il surnatante in nuovi 50 ml provette coniche e centrifugare per 10 minuti a 2.000 xg per rimuovere le cellule morte. Trasferimento risultante supernatanti a tubi rotori compatibile commerciali che sono in grado di resistere ultracentrifugazione.
- Assicurati di bilanciare i tubi ultracentrifuga. Centrifugare le provette per 30 min a 10.000 xg per rimuoveredetriti cellulari.
- Raccogliere i surnatanti in tubi ultracentrifuga e centrifugare per 70 min a 100.000 x g. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet ricco di exosome in 5 ml di PBS fresco. Trasferire le soluzioni a tubi ultracentrifuga freschi e centrifugare ancora per 70 min a 100.000 x g.
- surnatanti scartare. Per memorizzare i exosomes a lungo termine, risospendere il pellet in 50 ml di PBS e conservare a -80 ° C. In alternativa, procedere direttamente alla estrazione di proteine come illustrato di seguito.
3. Proteine estrazione e preparazione
- Sciogliere isolati pellet exosomal a 100-200 ml RIPA lisi e l'estrazione del buffer con cocktail inibitori della proteasi aggiunto. Il buffer è composta da 25 mM Tris-cloridrato, cloruro di sodio 150 mM, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato, e 0,1% SDS (sodio dodecil solfato), a pH 7,6. I cocktail di inibitori della proteasi dovrebbero contenere una varietà di inibitori delle proteasi, come ad esempio l'aprotinina, Bestatin, leupeptin, pepstatina A e EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), che può inibire una gamma completa di proteasi.
- Centrifugare le soluzioni disciolti per 10 minuti a 13.000 xg (4 ° C), e trasferire il surnatante eliminato per nuovi tubi da 1,5 ml microcentrifuga.
- Quantificare concentrazione di proteine di ogni campione di esosomi con acido bicinconinico (BCA) o saggio Bradford 16.
- Miscelare una quantità uguale di proteine (2 mg) da campioni etichettati e senza etichetta ed eseguire la miscela uguale su un gel SDS-PAGE 4-20% a 120 mA / 200 V per 30 min.
- Gel Stain con Coomassie blu seguito da decolorazione 17.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare la corsia campione dal gel. Poi tagliare la corsia di gel in 10-15 pezzi uguali. Mettere ogni pezzo in un 1,5 ml provetta fresco per un totale di 10-15 tubi.
- Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% acetonitrile, vortice, e scartare surnatanti. Ripetere due volte. Asciuttocubi in un concentratore a vuoto 18, 19.
- Reidratare cubi con 10 mM ditiotreitolo (DTT), vortex e centrifugare brevemente. Incubare a 56 ° C per 1 ora. surnatante degli scarti.
- Immergere cubi di gel a 55 mm Iodoacetamide, vortice, ed effetti. Incubare a temperatura ambiente al buio per 45 min. surnatante degli scarti.
- Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3, vortice, rotazione, e scartare il surnatante.
- Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% acetonitrile, vortice, ed effetti. Ripetere 3.9 e 3.10.
- Asciugare i cubi in un concentratore a vuoto. Aggiungere 25 ml di sequenziamento grado tripsina modificata in 25 mM NH 4 HCO 3, incubare a 4 ° C per 30 minuti, e scartare la soluzione in eccesso. Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3 senza tripsina, e incubare una notte a 37 ° C.
- Brevemente girare cubetti verso il basso e trasferire il peptide risultante in piùct in una nuova provetta. Aggiungere 30 ml di acido formico al 5% in 50% acetonitrile ai cubi, vortex per 30 min, e rotazioni. Unire il surnatante con l'estratto. Essiccare gli estratti peptide con un concentratore a vuoto a meno di 5 microlitri.
- Invia campioni di impianto di base spettrometria di massa per l'analisi LC-MS / MS. L'analisi dei dati di MS, che può essere generato da un software open source, in genere include un numero di registrazione per ogni proteina identificata, etichettati rapporti / senza etichetta e il numero di peptidi unici identificati.
4. Western Blotting di verifica
NOTA: Western blotting si raccomanda di verificare i risultati di spettrometria di massa.
- Seguire i protocolli Western Blotting standard e garantire che le quantità uguali di proteine di ogni gruppo vengono caricati. Usare gli anticorpi contro le proteine di interesse (ad esempio A5 annexin, lattato deidrogenasi a catena B) individuati dalla SM. rilevamento Western blotting, insieme a densitometria analisi des, in grado di ribadire che l'identificazione delle proteine MS e quantificazione siano corretti.
5. Analisi dei dati proteomica
NOTA: la valutazione della qualità dei dati, pre-trattamento dei dati, il calcolo e la determinazione di importanti candidati proteine sono fatte separatamente per ciascuno Stato membro si replicano. Una volta che le analisi di cui sopra sono stati completati, i dati analizzati da repliche vengono confrontati e combinati 6, 20, 21.
- Valutare la qualità dei dati MS.
- In primo luogo, log2 trasformare la SILAC-MS etichettato / rapporti senza etichetta di proteine quantificate in un foglio di calcolo.
- Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, i rapporti di gruppo in 40-100 bidoni rapporto e tracciare il numero di rapporti per scomparto per generare un istogramma. Un normale distribuzione di istogramma indica una buona qualità dei dati MS 6. Fare questo passo per tutta la MS replica.
- Per aumentare la fiducia e l'accuratezza dei rapporti peptide MS, prendere in considerazione la rimozione di proteine che hanno meno di due peptidi quantificati.
- Per determinare i candidati di proteine in modo significativo l'alto e verso il basso-regolato, utilizzare le seguenti operazioni per il calcolo soglie significative 22.
- Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, generare una regressione non lineare o una curva-fit per i dati di distribuzione di frequenza. Questo passo produce valori che possono essere utilizzati per calcolare i valori di cutoff. Calcolare i valori di cut-off come mediana ± 1,96 σ per il 95% limiti di confidenza o 2,56 σ per il 99% limiti di confidenza.
NOTA: I dettagli specifici del calcolo dei tagli può essere trovato alla Emmott et al. 22. - Selezionare i candidati proteina la cui rapporti sono o superiore a 1,96 (o 2,56) deviazioni standard sopra la mediana (significativamente sovra-espresso) o inferiore a 1,96 (o 2,56) deviazioni standard al di sotto della mediana (significativamente sotto-espressi).
- Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, generare una regressione non lineare o una curva-fit per i dati di distribuzione di frequenza. Questo passo produce valori che possono essere utilizzati per calcolare i valori di cutoff. Calcolare i valori di cut-off come mediana ± 1,96 σ per il 95% limiti di confidenza o 2,56 σ per il 99% limiti di confidenza.
- Confrontare le repliche dei candidati rilevanti sopra individuati per garantire la coerenza. Assicurarsi che soddisfano i seguenti criteri di passare questa fase di selezione finale: i candidati devono individuare in modo coerente in tutte le repliche; e repliche di un candidato devono essere coerenti nella loro direzione, del regolamento (preferibilmente almeno 2 su 3 repliche di un candidato dovrebbe essere o up-regolati o down-regolato).
- Finalizzare i dati per i candidati che soddisfano i criteri di cui sopra unendo i dati replicati loro.
6. Bioinformatica verifica e caratterizzazione
NOTA: esistenti informazioni genomiche e bioinformatica offre una ricchezza di informazioni per quasi ogni proteina. Data mining e analisi bioinformatica di tali informazioni possono aiutare ad acquisire una grande quantità di comprensione della proprietà e funzioni dei candidati significativi. questa process è di solito necessario per una corretta progettazione di esperimenti su valle.
- Usando i loro numeri GenBank adesione o gli ID UniProt, la ricerca di candidati contro database exosome correnti (Exocarta 23, Evpedia 24) per verificare che le proteine candidati sono stati precedentemente trovati in exosome. Questo passaggio aggiunge un livello di fiducia che i candidati sono infatti in esosomi.
- http://www.exocarta.org/ accesso, fai clic su "Query" e in ingresso sia il gene o una proteina nome / numero di adesione. Una pagina di riepilogo apparirà e le prove in exosome verrà mostrato, a condizione che se non vi è alcuna.
- Cerca i candidati contro l'HIV-1 e la proteina umana Interazione Database 25. In alternativa, la ricerca di basi di dati specifici che possono fornire informazioni circa l'interazione delle proteine candidati e la condizione di test.
- Accedere al database a www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInterazioni. Sulla voce 'proteina nome di dominio', inserire i nomi dei candidati o dei numeri di adesione, e fare clic su Cerca. I risultati della ricerca possono fornire una conoscenza delle interazioni tra HIV-1 ei candidati della proteina, e suggerire che dei candidati potrebbe essere veramente HIV-1 associata.
- Importa GenBank numero o UniProt gli ID dei candidati in software di analisi GO (come FunRich, strumento di analisi di arricchimento funzionale 26) ed eseguire il software.
- Scaricare il software a http://www.funrich.org/. Dopo l'installazione, aprire il software, in analisi di arricchimento, fare clic su "Aggiungi Data Set", e caricare l'elenco delle proteine / geni. Avanti, selezionare il tipo di grafico per visualizzare l'analisi GO.
NOTA: GO risultati delle analisi saranno visualizzati sotto forma di grafici a torta. Questo passo ci aiuta a ottenere una visione globale associato con i candidati nei settori della Processo biologico (BP), Cellular componente (CC), e funzione molecolare (MF).
- Scaricare il software a http://www.funrich.org/. Dopo l'installazione, aprire il software, in analisi di arricchimento, fare clic su "Aggiungi Data Set", e caricare l'elenco delle proteine / geni. Avanti, selezionare il tipo di grafico per visualizzare l'analisi GO.
- L'accesso a DAVID http://david.ncifcrf.gov/ 27, fare clic su "strumento di annotazione funzionale" sul suo sito web. Inserire la lista dei candidati, selezionare l'opzione "Identifier" del gene, come la "UniProt ID", selezionare "Lista Gene" e di ricerca. I termini arricchiti GO, p-value, e altri parametri possono essere trovate cliccando la pagina "Riepilogo risultati annotazione" sotto la categoria "Gene_Ontology".
- Per studiare potenziali interazioni dei candidati, con altre proteine, usare apertamente accessibile database di STRING 28 per chiarire potenziali interazioni proteina-proteina e le possibili vie biochimiche.
NOTA: GO analisi e annotazione funzionale (Sezione 6,3-6,4) può essere eseguita utilizzando il software più recente STRING.- Accedere al database a http://string-db.org/. Inserire l'ID di proteine o la sequenza nelle s designatiscatola earch e selezionare le specie corretti per l'analisi. Fai clic su "Cerca". I risultati forniranno informazioni su entrambe le associazioni dirette (fisico) e indiretti (funzionale). I primi dieci partite noti per il candidato exosomal verranno visualizzati e devono essere considerati per la selezione significativa candidato.
NOTA: Una grande quantità di informazioni associate con i candidati possono essere analizzati utilizzando la procedura descritta sopra. I candidati più significativi possono essere scelti per ulteriori analisi molecolari e biochimiche valle.
- Accedere al database a http://string-db.org/. Inserire l'ID di proteine o la sequenza nelle s designatiscatola earch e selezionare le specie corretti per l'analisi. Fai clic su "Cerca". I risultati forniranno informazioni su entrambe le associazioni dirette (fisico) e indiretti (funzionale). I primi dieci partite noti per il candidato exosomal verranno visualizzati e devono essere considerati per la selezione significativa candidato.
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Representative Results
La figura 1A è un diagramma di flusso che illustra la procedura di etichettatura SILAC 21. Al fine di purificare gli esosomi, i campioni devono essere centrifugati tramite centrifuga. Figura 1B mostra le fasi di purificazione exosome di ultracentrifugazione di serie 21. Una volta purificate, le esosomi sono oggetto di analisi sperimentale proteomica come indicato nella procedura.
La figura 2A è un diagramma di flusso per determinare significativi candidati proteici di dati proteomica 21. I candidati selezionati vengono poi utilizzati per l'analisi proteomica valle. La figura 2B è un esempio di SILAC istogramma visualizzazione coefficienti rappresentativi dei risultati tipici proteine quantificazione (Questo dato è stato modificato da Li et al. 6), e la Tabella 1 è unn esempio di determinare i valori di cut-off per i candidati significativi 6 da questi istogrammi rapporto SILAC. Seguendo la procedura descritta nel paragrafo 6.3, sono stati calcolati i valori di cutoff per la determinazione delle proteine in modo significativo l'alto o verso il basso-regolamentati. In questo set di dati rappresentativi, proteine con una pesante / leggero (H / L) Rapporto di sopra del valore di taglio superiore sono stati considerati come significativamente up-regolato, mentre le proteine con un rapporto / L H di sotto del valore limite inferiore sono stati considerati come significativamente down-regolato . Significativamente proteine candidate regolamentati sarebbero sottoposti ad ulteriori indagini.
La figura 3 mostra le procedure di analisi bioinformatica e di data mining complessivi per i candidati significativi selezionati. La tabella 2 è un esempio di data mining che utilizza exosome e HIV-1 / ospitano i database di interazione 6 per raccogliere informazioni sui candidati (Questa schedaLe è stato modificato da Li et al. 6). Con l'estrazione exosome attuale e basi di dati di interazione HIV-1 / ospitanti, tredici dei quattordici candidati sono stati trovati da associare esosomi. Cinque su quattordici candidati sono stati anche noti per interagire con HIV-1. Tra questi, quattro candidati (HSPA4, shock termico 70 kDa proteine 4; NUTF2, fattore di trasporto nucleare 2; PTGES3, prostaglandina E sintasi 3; LDHB, catena deidrogenasi B L-lattato) sono stati trovati da associare sia exosome e HIV-1. Tra HSPA4, NUTF2, PTGES3 e LDHB, solo LDHB era costantemente sotto-espressa nella frazione infetto (pesante etichetta). Attraverso una serie di analisi, abbiamo selezionato LDHB essere il candidato più significativo, che potrebbe essere sottoposto a ulteriori studi. Le analisi proteomica a valle vengono visualizzati nella Figura 4. Figura 4A mostra brevi passi dell'ontologia genica (GO) analisi; Figura 4B elenca le fasi di esecuzione di DAVIAnalisi D; La figura 4C mostra come eseguire l'analisi di rete utilizzando STRING. Le figure 5A, 5B, e 5C sono analisi DAVID di un insieme di quattordici proteine in BP, CC e MF; La figura 5D mostra i primi dieci partner che interagiscono di LDHB; Figura 5E mostra che la maggior parte dei partner che interagiscono di LDHB sono anche associati con exosome e HIV-1. I primi risultati di analisi DAVID suggerito che molti candidati sono l'apoptosi legati e probabilmente partecipare a legame con le proteine. Ulteriori analisi hanno confermato che STRING LDHB vincolante partner sono anche funzionalmente e locationally correlate a exosome e HIV-1. Tutti questi risultati forniscono informazioni preziose per potenziali indagini a valle.
Figura 1: etichettatura SILAC e purificazione exosome usando ultracentrifugazione differenziale.(A) Due gruppi di cellule sono coltivate separatamente. Un gruppo è cresciuto in media etichettato per sei raddoppi per l'etichettatura completa. L'altro gruppo è cresciuto nel mezzo senza etichetta normale per lo stesso periodo. Successivamente, le cellule marcate sono infettati con HIV-1, mentre le cellule senza etichetta non lo sono. Infine, exosomes di entrambi i gruppi sono isolati in parallelo. (B) I campioni (surnatanti o pellet) utilizzati nella centrifugazione a ogni passo sono indicate nelle provette. Frazioni da scartare sono riportati sul lato destro di provette. Sono mostrati anche la velocità e la lunghezza di ogni centrifugazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura per la validazione di dati di proteomica (s) e determinando significativi procandidati proteiche. (A) Diagramma di determinare significativi candidati proteici di set di dati proteomica (s). Questi quattro passaggi assicurano selezione affidabile dei candidati significativi. Innanzitutto, un rapporto SILAC istogramma viene tracciato per valutare la qualità dei dati. Avanti, i candidati meno ideali che potrebbero ridurre la precisione sono stati rimossi. Nella terza fase, metodi statistici vengono utilizzate per impostare soglie di rilevanza per i potenziali candidati di proteine. Infine, i dati replicati dei candidati significativi vengono analizzati per la coerenza e si fondono alla fine. (B) istogramma Rappresentante di rapporti SILAC. L'istogramma ha rivelato distribuzione simmetrica lungo ratio = 1 (log2 = 0) linea di tendenza. I rapporti log2 trasformato sono raggruppati in bidoni rapporto, e l'asse y mostra il numero relativo di rapporti rilevati per scomparto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: bioinformatica globale di analisi di dati e di procedure di estrazione per i candidati significativi. Le procedure contengono mineraria exosomal e HIV-1 / ospitanti dati, caratterizzazione Gene Ontology, l'analisi e la previsione DAVID rete. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Procedura per l'esecuzione di Gene Ontology caratterizzazione, l'arricchimento, e via di analisi. (A) Procedura per l'esecuzione di Gene Ontology caratterizzazione (GO). Al fine di conoscere le funzioni e le localizzazioni subcellulari dei candidati significativi, passi per l'esecuzione di analisi GO utilizzando appsoftware ropriate 26 sono illustrati. (B) I passaggi per eseguire GO Term analisi di arricchimento. Per ottenere le informazioni arricchimento dei candidati significative, sono riportati brevi passi per l'esecuzione di analisi DAVID. (C) Procedura per l'esecuzione di interazione e analisi via. Per chiarire i possibili percorsi e trovare partner funzionali, passi per l'esecuzione di interazione o analisi della rete da STRING sono mostrati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentante DAVID ed i risultati delle analisi STRING. (A) BP risultati arricchimento dei quattordici candidati mediante analisi Davide. processi legati morte cellulare sono notevolmente arricchite. (B) enrichmen CC t risultati dei quattordici candidati mediante analisi Davide. Molte proteine hanno un'origine intracellulare. (C) BP risultati arricchimento dei quattordici candidati mediante analisi Davide. La maggior parte dei candidati partecipano proteina legante. (D) I dieci interagire partner di LDHB identificato da STRING. (E) La maggior parte dei partner LDHB sono anche associati con exosome e HIV-1, che supporta ulteriormente i ruoli di LDHB in exosome / HIV-1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Calcolo Rappresentante dei valori di cutoff di notevole perturbazione di proteine.
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Tabella 2: Le associazioni tra i candidati SILAC e le loro localizzazioni exosomal e le interazioni con HIV-1.
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Discussion
Nelle procedure descritte in questo documento, abbiamo dimostrato l'applicazione della tecnica SILAC per studiare l'effetto di HIV-1 sul proteoma exosomal host. Inizialmente, le cellule infette non infettate e HIV-1 sono differenziale marcati con isotopi. I exosomes differenziale etichettati vengono quindi purificati prima di eseguire l'estrazione di proteine. Avanti, cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem è impiegato per analizzare il proteoma exosomal. Infine, i dati risultanti spettrometria di massa e potenziali proteine candidate sono sottoposti a statistiche e bioinformatica analisi prima di dissezioni biochimici a valle.
devono essere seguite per ottenere risultati ottimali passaggi critici durante il protocollo. Nelle fasi iniziali del protocollo, etichettatura SILAC potrebbe essere influenzata dal tipo di cellula e il mezzo di etichettatura. Le cellule sane e altamente proliferative dovrebbero essere utilizzati per ottenere un alto rendimento di etichettatura. Criticamente, l'etichettatura medium deve essere preparata utilizzando siero fetale bovino dializzato (FBS), piuttosto che regolare FBS. Dializzato FBS è impoverito di amminoacidi e peptidi ed è pertanto meno probabile che interferire con l'etichettatura SILAC. Va tuttavia rilevato che il siero dializzato può non essere adatto per alcune linee cellulari, in particolare le cellule primarie. crescita normale nel mezzo con FBS dializzati deve essere confermata prima di impiegare la strategia SILAC. Inoltre, usando il doppio "pesante" marcatura isotopica (13 C 6 L-lisina e 13 C 6 15 N 4 L-arginina) invece di usare 13 C 6 L-lisina singolarmente, può aumentare il numero di peptidi quantificati in spettrometria di massa analisi. Il numero minimo di cellule necessarie per la corretta successiva analisi del proteoma dipende da molti fattori, quali la sensibilità dello spettrometro di massa, la massa di ciascuna cella, e proteoma mirata (intero proteoma o post-traduzionali proteine modificate). Sulla base dei nostri risultati, si consiglia di dieci milioni di cellule come un importo iniziale nella stima del numero appropriato di cellule necessarie per la spettrometria di massa.
isolamento Exosome da supernatanti di coltura cellulare può essere migliorata aggiungendo una fase di filtrazione come segue. Per la sospensione di cellule, una fase di centrifugazione iniziale a 200 xg per 10 min viene fatto per rimuovere cellule sospese nel supernatante, seguita da filtrazione attraverso un filtro di 0,22 micron 29, 30. Per cellule aderenti, il supernatante può essere raccolto direttamente dalla cultura e filtrato nello stesso modo. La filtrazione è un passo fondamentale per la separazione di esosomi da materiali contaminanti, quali piccole molecole e peptidi. I exosomes possono essere isolate dal supernatante utilizzando il metodo ultracentrifugazione classica, o utilizzando reagenti commercialmente disponibili exosome isolamento kit. La purezza del exosome può essere verificata nanopartianalisi di monitoraggio CLE o microscopia elettronica 31.
Dal momento che l'HIV-1 virioni sono in genere di dimensioni simili a esosomi, possono contaminare esosomi purificati da HIV-1 campioni infetti. Nelle schermate di proteomica, potenziali contaminanti virali possono essere filtrati limitando la ricerca del database solo per proteine umane. Altre tecniche di isolamento utilizzando metodologie consolidate come gradienti di densità iodixanolo e isolamento immunoaffinità possono anche essere utilizzati per separare HIV-1 virioni da esosomi 32, 33.
Poi, discuteremo alcuni suggerimenti per assicurare l'analisi dei dati affidabile per identificare i candidati potenzialmente significative una volta che i risultati MS sono ottenuti da esosomi isolati. Nella fase iniziale di analisi, il rapporto istogramma SILAC dovrebbe seguire una distribuzione normale. Se la distribuzione dei dati è asimmetrica in una particolare direzione, il lettore dovrebbe determinare the causare prima di procedere con l'analisi. Ad esempio, i campioni marcati e non marcati possono non essere miscelati in proporzioni uguali. Inoltre, alcuni peptidi non possono avere pesanti / leggeri valori di rapporto SILAC, e dovrebbero essere eliminati dai potenziali candidati di proteine. Dopo candidati sono selezionati, software e database possono essere impiegati per verificare arricchimento exosome, interazioni con condizioni di prova, e possibili percorsi. Le interazioni tra le proteine candidati e condizione di test dovrebbero essere estratti attraverso banche dati specifiche prima dell'analisi bioinformatica. Per bioinformatica caratterizzazioni, le annotazioni gene ontologia possono essere identificati utilizzando vari software e banche dati,
La tecnica impiegata SILAC qui offre un approccio sistematico e semplice da analizzare exosomal ospite proteoma. La maggior parte dei laboratori biomedici sarebbero in grado di adottare le procedure con attrezzature supplementari minime e costi aggiuntivi. La tecnica SILAC, tuttavia, è in primo luogo defirmato per studi che utilizzano linee cellulari. Come tali, possono avere bisogno di essere impiegato per studiare diversi campioni biologici altri metodi. Ad esempio, il metodo di connessione etichetta MRM (multiple reaction monitoring) può essere utilizzato per la quantificazione mirata di proteine e peptidi in campioni clinici 9, 34. Mentre nel caso di determinazione del contenuto di proteine da diversi studi, la tecnica SILAC può anche essere usato per studiare due o più campioni. Il metodo di etichettatura chimica iTRAQ (tag isobariche per la quantificazione relativa e assoluta) o (tag di massa tandem) TMT-based metodi consentono molto più alto multiplexing e sarebbe meglio adatto per campioni multipli.
Il procedimento qui descritto non è limitato alla caratterizzazione proteomica di esosomi da HIV-1 le cellule infettate. Con modifiche, può essere adattato per analizzare esosomi in un'ampia gamma di condizioni di prova e stress come infezione batterica, infezione virale, e radiation. E 'adatto anche per studiare altri compartimenti cellulari.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un supplemento ARRA alla durata della vita / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, e K24HD080539 a BR. Questo lavoro è stato supportato anche da Fondo Durata pilota di ricerca (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20.133.969), e NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) per ML. Ringraziamo James Myall e Vy Dang per un aiuto con la preparazione del manoscritto e la figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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