Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة

Published: March 3, 2017 doi: 10.3791/54799
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 3
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

Summary

هنا، نحن تصف طريقة البروتينات الكمي باستخدام تقنية مستقرة وصفها النظائر عن طريق الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية (SILAC) لتحليل آثار عدوى HIV-1 على proteomes exosomal المضيف. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى الخلايا تحت مختلف الإجهاد أو الإصابة الظروف.

Introduction

العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك العدوى الفيروسية، غالبا ما ترتبط مع العمليات الخلوية المميزة التي تحدث في وحول الخلايا المتضررة. والبروتينات، وغالبا ما يتصرف مثل مؤثرات الخلوية في نهاية المطاف، توسط هذه العمليات. تحليل البروتينات في كثير من الأحيان يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن بالنسبة للبيئة المحلية من الخلايا المتضررة وتساعدنا على فهم آلية الكامنة وراء المرض والتسبب. بين مختلف تقنيات تحليل البروتين والبروتينات واعدة للغاية بشكل خاص. كما قوية، أداة واسعة النطاق، يمكن أن البروتينات توفير فهم النظامية من العمليات الخلوية، وخاصة في مجال الوظيفة وتفاعل البروتينات. تحليل بروتينات معينة يتم بساطة من خلال تطوير تقنيات وضع العلامات، والتي تسمح للمحققين لمراقبة تعبير عن المكونات الخلوية، وخاصة البروتينات، في موقع التحقيق. وعلى الرغم من تنفيذ العديد من التحليلات البروتين في الخلويوقد ثبت على نطاق وبروتيوم، الأوصاف البروتين في المقصورات التحت خلوية أن تكون مفيدة بشكل خاص 1. ويتمثل هذا جيدا في دراسات عدوى HIV-1.

Exosomes، 30-100 حويصلات غشاء نانومتر التي يفرزها مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 2، 3، مكونات حاسمة في التواصل بين الخلايا والنقل الجزيئي. تم اكتشافها سابقا للعب أدوار مهمة في HIV-1 في مهدها عملية 4، 5. من خلال الجمع بين تحليل البروتين مع تشريح وظيفي، وجدنا أن exosomes صدر من HIV-1 الخلايا المصابة وتتكون من توقيع البروتين والجزيئات ميناء تنظيمية فريدة ومختلفة من الناحية الكمية التي تؤثر الخصائص الخلوية على الخلايا الاستقبالية، بما في ذلك الخلايا الخلوية وانتشار 6 المجاورة. ووصف الأساليب في هذا البروتوكول،وهي SILAC (نظير مستقر وصفها من قبل الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية) 7 استنادا توصيف البروتين من exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على فهم أفضل المقصورات التحت خلوية أخرى خلال التسبب عن طريق ضبط الضغط التجريبي إلى المقصورة أو جزء من الفائدة محددة وإجراء التغييرات اللازمة للإجراءات وصفها.

وبالنظر إلى التطورات الأخيرة في طرق البروتين الكمي، وهناك الكثير للاختيار من بينها عند اختيار الأسلوب الأكثر فعالية لإجراء تجربة معينة. ومن بين هذه iTRAQ القائمة على المواد الكيميائية (العلامات إسوي الضغط لتقدير النسبي والمطلق) (8) وMRM خالية من التسمية (مراقبة رد فعل متعددة) 9 التقنيات. كلتا الطريقتين هي أدوات قوية وهي خيارات جيدة لإعدادات محددة. لمختبر نموذجي يعمل أساسا مع خطوط الخلايا، ومع ذلك، وهذه الأساليب لهما relativelذ ارتفاع التكاليف وأكثر بالمقارنة مع طريقة تقوم SILAC تستغرق وقتا طويلا. SILAC هو التمثيل الغذائي القائم العلامات التقنية التي تتضمن أشكال النظائر امشع من الأحماض الأمينية من وسائل الإعلام الثقافة في البروتينات الخلوية. عادة، والتجارب SILAC تبدأ مع اثنين من سكان الخلية، على سبيل المثال، المصابة وغير المصابة. كل وصفت بشكل مختلف في بيئة النظائر محددة إلى حين التوصل إلى وضع علامات كاملة. ثم يتعرض للexosomes وصفت هذه الخلايا لاستخراج البروتين. مرة واحدة المستخرج، ويتم تحليل البروتينات exosomal المسمى باستخدام السائل اللوني جنبا إلى جنب الكتلة الطيفي 10. وأخيرا، يتعرض نتائج مطياف الكتلة والبروتينات وصفت بشكل كبير في الإحصائية والمعلوماتية الحيوية ويحلل وكذلك التحقق الكيمياء الحيوية صارم. وتشير تقاريرنا التحقيق السابقة أن الإجراءات SILAC / exosome أكثر ملاءمة للخطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وخطوط الخلايا وعادة ما تكون فيالدولة المتكاثرة نشطة لكفاءة وضع العلامات النظائر،

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة وHIV-1 العدوى

ملاحظة: قبل البدء في التجارب، فمن المستحسن أن تحقق بقاء الخلايا من خلال تلطيخ التريبان الأزرق 11 وانتشارها من خلال فحص MTT 12. ومن الأهمية بمكان استخدام أعدت حديثا المتوسطة SILAC أيضا. خطوط الخلايا المختلفة يمكن استخدامها، طالما أنها في مرحلة التكاثري بنشاط، وعرضة للHIV-1 العدوى، أو حالة اختبار الاختيار. في هذا البروتوكول، استخدم خط الخلية H9 كما في المثال.

  1. البذور 2 × 10 6 خلايا H9 في كل قارورة ثقافة الخلية. تنمو مجموعة واحدة في 10 مل المسمى المتوسط 1640 RPMI تحتوي على 10٪ مدال مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 ملغم / لتر 13 C 6 L-ليسين و 100 ملغم / لتر 13 C 6 15 ن 4 L-أرجينين. تنمو مجموعة أخرى في 10 مل الخالي من الملصقات المتوسط ​​1640 RPMI، مع 10٪ مدال FBS، و 100 ملغم / لتر L-ليسين و 100 ملغم / لتر أرجينين.
  2. تنمو الخلايا لمدة ستة الأضعاف وعند هذه النقطة هي عمليا صفت بروتينات الخلايا في المتوسط ​​المسمى تماما (> 99٪) مع الأحماض الأمينية الثقيلة. إضافة وسائط جديدة أو تغيير وسائل الاعلام بشكل منتظم (كل 1-3 أيام اعتمادا على نوع من الخلايا للحصول على خلايا H9، تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام). في نهاية الوسم، وزيادة حجم الثقافة (على سبيل المثال ~ 30 مل) لاستيعاب نمو المزيد من الخلايا.
    ملاحظة: تحديد الخلية بالضبط مضاعفة الوقت في بداية التجربة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق وعد الخلايا.
  3. تصيب الخلايا المسمى مع HIV-1 NL4-3 باستخدام معيار HIV-1 العدوى بروتوكول 13 لمدة 48 ساعة. احتضان الخلايا مع الكميات المناسبة من فيروس مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) في جميع أنحاء 0.3. تحقق عدوى HIV-1 عن طريق القياس الكمي P24 من supernatants الثقافة باستخدام HIV-1 P24 مستضد عدة ELISA. إجراء الفحص المناعي 14 لتأكيد الإصابة الناجح للخلايا. كيص تنمو الخلايا غير المسماة في المتوسط ​​الخالي من الملصقات دون عدوى HIV-1.
  4. حصاد supernatants من كلا الفريقين في نهاية العدوى (الخطوة 2.1).

2. Exosome عزل

ملاحظة: من خلال سلسلة من الخطوات تنبيذ فائق، يتم إثراء كسور exosomal من supernatants الثقافة (15). تنفيذ كافة الخطوات التالية في 4 درجات مئوية، مع الدوار نابذة فائقة السرعة التي يمكن أن تصل إلى سرعة لا يقل عن 100،000 ز س.

  1. جمع supernatants من الثقافات في 50 أنابيب مخروطية مل، وتجنب الخلايا. أجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 10 دقيقة في 300 x ج لإزالة الخلايا المتبقية.
  2. جمع supernatants في الجديدة 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 10 دقيقة في 2000 x ج لإزالة الخلايا الميتة. نقل supernatants لأنابيب الدوار متوافق التجارية التي تكون قادرة على الصمود تنبيذ فائق الناتجة عن ذلك.
  3. مما لا شك فيه لتحقيق التوازن في أنابيب نابذة فائقة السرعة. أنابيب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 10000 x ج لإزالةالحطام الخلية.
  4. جمع supernatants في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 70 دقيقة في 100000 ز س. تجاهل supernatants.
  5. Resuspend والكريات exosome الغنية في 5 مل من برنامج تلفزيوني جديد. نقل الحلول لأنابيب نابذة جديدة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 70 دقيقة في 100000 ز س.
  6. supernatants تجاهل. لتخزين exosomes على المدى الطويل، و resuspend الكريات في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتخزينها في -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، انتقل مباشرة إلى استخراج البروتين كما هو موضح أدناه.

3. البروتين استخراج وإعداد

  1. حل الكريات exosomal معزولة في 100-200 ميكرولتر المعهد الملكي تحلل واستخراج عازلة مع الكوكتيلات مثبط البروتياز المضافة. يتكون المخزن المؤقت من 25 ملي تريس، هيدروكلوريد، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ NP-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 0.1٪ SDS (الصوديوم دوديسيل كبريتات)، في درجة الحموضة 7.6. يجب أن تحتوي على زجاجات مثبط البروتياز مجموعة متنوعة من مثبطات الأنزيم البروتيني، مثل أبروتينين، bestatin، لeupeptin، pepstatin ألف وEDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل)، التي يمكن أن تمنع مجموعة كاملة من البروتياز.
  2. أجهزة الطرد المركزي الحلول المنحل لمدة 10 دقيقة في 13000 x ج (4 درجة مئوية)، ونقل supernatants مسح لأنابيب microcentrifuge 1.5 مل جديدة.
  3. قياس تركيز البروتين من كل عينة من exosomes باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) أو برادفورد فحص 16.
  4. مزيج مبلغ مساو من البروتينات (2 ميكروغرام) من عينات وصفت وغير المسماة وتشغيل مزيج متساو على 4-20٪ هلام SDS-PAGE في 120 مللي أمبير / 200 فولت لمدة 30 دقيقة.
  5. هلام وصمة عار مع Coomassie الأزرق تليها destaining 17.
  6. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع ممر عينة من هلام. ثم قطع الخط جل في 10-15 قطع متساوية. وضع كل قطعة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الطازجة لما مجموعه 10-15 الأنابيب.
  7. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3 في 50٪ الأسيتونتريل، الدوامة، وتجاهل supernatants. كرر مرتين. جافمكعبات في مكثف فراغ 18، 19.
  8. ترطيب مكعبات مع 10 ملي dithiothreitol (DTT)، دوامة، لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. طاف تجاهل.
  9. تزج مكعبات هلام في 55 ملي iodoacetamide، دوامة، وتدور. يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 45 دقيقة. طاف تجاهل.
  10. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3، دوامة، وتدور، وتجاهل طاف.
  11. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3 في 50٪ الأسيتونتريل، دوامة، وتدور. كرر 3.9 و 3.10.
  12. تجفيف مكعبات في مكثف فراغ. إضافة 25 ميكرولتر التسلسل الصف التربسين المعدلة في 25 ملي NH 4 HCO 3، في احتضان 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل الحل الزائد. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3 بدون التربسين، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
  13. باختصار تدور المكعبات أسفل ونقل الببتيد الناتجة إضافيةط م إلى أنبوب جديد. إضافة 30 ميكرولتر من حمض الفورميك 5٪ في 50٪ الأسيتونتريل إلى مكعبات، دوامة لمدة 30 دقيقة، وتدور. الجمع بين طاف مع استخراج. تجفيف مقتطفات الببتيد مع مكثف فراغ إلى أقل من 5 ميكرولتر.
  14. إرسال العينات إلى مرفق الأساسية مطياف الكتلة لتحليل LC-MS / MS. ويشمل تحليل البيانات MS، والتي يمكن أن تتولد من البرمجيات مفتوحة المصدر، وعادة عددا انضمام كل من البروتين التي تم تحديدها، وصفت / نسب غير المسماة وعدد من الببتيدات فريدة من نوعها التي تم تحديدها.

4. ويسترن التنشيف التأكيد

ملاحظة: النشاف الغربي من المستحسن للتحقق من النتائج مطياف الكتلة.

  1. اتبع بروتوكولات النشاف الغربي القياسية والتأكد من أن كميات متساوية من البروتين من كل مجموعة يتم تحميلها. استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات من الفائدة (على سبيل المثال A5 annexin، اللاكتات نازعة سلسلة B) التي تم تحديدها من قبل MS. الكشف عن النشاف الغربية، جنبا إلى جنب مع تحليل سياسي كثافةالصورة، يمكن التأكيد على أن MS تحديد البروتين وتقدير صحيحة.

5. تحليل البيانات [بروتيوميك

ملاحظة: تقييم جودة البيانات، المعالجة البيانات، وحساب وتحديد المرشحين كبير البروتين تتم بشكل منفصل لكل MS تكرار. وبمجرد الانتهاء من التحليلات أعلاه، تتم مقارنة البيانات التي تم تحليلها من مكررات والجمع بين 6 و 20 و 21.

  1. تقييم جودة البيانات MS.
    1. أولا، log2 تحويل SILAC-MS المسمى / نسب غير المسماة البروتينات كميا في برنامج جدول بيانات.
    2. في الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية، مجموعة نسب إلى 40-100 صناديق نسبة ومؤامرة على عدد من النسب في بن لتوليد الرسم البياني. والتوزيع الطبيعي من الرسم البياني يشير إلى نوعية جيدة من البيانات MS 6. القيام بهذه الخطوة ليكرر كل MS.
  2. لزيادة الثقة والدقة في نسب الببتيد MS، والنظر في إزالة البروتينات التي لديها أقل من عقدين من الببتيدات كميا.
  3. لتحديد المرشحين البروتين أعلى المصب بشكل كبير وأسفل التنظيم، اتبع الخطوات التالية لحساب أهمية عتبات 22.
    1. في الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية، توليد الانحدار غير الخطي أو منحنى يصلح لتوزيع البيانات تردد. هذه الخطوة ينتج القيم التي يمكن استخدامها لحساب القيم قطع. حساب القيم قطع كما المتوسط ​​± 1.96 σ 95٪ حدود الثقة أو 2.56 σ 99٪ حدود الثقة.
      ملاحظة: تفاصيل محددة لاحتساب انقطاع ويمكن الاطلاع على إيموت وآخرون. 22.
    2. اختيار المرشحين البروتين الذي نسب إما أكبر من 1.96 (أو 2.56) الانحرافات المعيارية فوق المتوسط ​​(إلى حد كبير على مدى أعرب) أو أقل من 1.96 (أو 2.56) الانحرافات المعيارية أقل من المتوسط ​​(نقص كبير في سردتها).
  4. مقارنة مكررات من المرشحين كبيرا المحددة أعلاه لتحقيق الاتساق. تأكد من أنها تلبي المعايير التالية لتمرير هذه الخطوة الاختيار النهائي: يجب أن يتم تحديد المرشحين باستمرار في جميع مكررات. ومكررات مرشح يجب أن تكون متسقة في اتجاهها التنظيم (يفضل أن لا يقل عن 2 من 3 مكررات المرشح يجب أن يكون إما بزيادة التنظيم أو لأسفل التنظيم).
  5. وضع اللمسات الأخيرة بيانات للمرشحين الذين يستوفون المعايير المذكورة أعلاه عن طريق دمج البيانات مكررات بهم ".

6. المعلوماتية الحيوية والتحقق وتوصيف

ملاحظة: العروض المقدمة المعلومات الجينومية وبيوينفورمتيك ثروة من المعلومات عن بروتين تقريبا. استخراج البيانات وتحليل المعلومات البيولوجية على تلك المعلومات يمكن أن تساعد في الحصول على قدر كبير من التبصر في الممتلكات وظائف للمرشحين كبير. هذه اإلجراءاتSS عادة ما تكون ضرورية لتصميم التجارب الرطب مختبر المصب المناسبة.

  1. باستخدام أعدادهم بنك الجينات الانضمام أو معرفات يونيبروت، بحث المرشحين ضد قواعد البيانات exosome الحالية (Exocarta 23، Evpedia 24) للتحقق من أن البروتينات مرشح تم العثور سابقا في exosome. هذه الخطوة يضيف طبقة من الثقة أن المرشحين هي في الواقع في exosomes.
    1. http://www.exocarta.org/ الوصول، انقر فوق "استعلام" وإدخال إما الجين أو البروتين عدد اسم / الانضمام. صفحة ملخص ستظهر وسيتم عرض الأدلة في exosome، بشرط إذا كان هناك أي.
  2. بحث المرشحين ضد HIV-1 والبروتين البشري التفاعل قاعدة البيانات 25. بدلا من ذلك، ابحث في قواعد البيانات المحددة التي يمكن أن توفر معلومات حول تفاعل البروتينات مرشح وحالة الاختبار.
    1. الوصول إلى قاعدة بيانات في www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVالتفاعلات. على الدخول "اسم النطاق البروتين، أدخل أسماء المرشحين أو أرقام الانضمام، وانقر البحث. يمكن للنتائج البحث توفر نظرة ثاقبة للتفاعلات بين المرشحين بروتين HIV-1 و، واقتراح أي من المرشحين قد يكون حقا HIV-1 المرتبطة بها.
  3. استيراد بنك الجينات أرقام الانضمام أو يونيبروت معرفات للمرشحين في برامج التحليل GO (مثل FunRich، والإثراء الوظيفي أداة تحليل 26) وتشغيل البرنامج.
    1. تحميل البرنامج في http://www.funrich.org/. بعد التثبيت، افتح البرنامج، تحت تحليل التخصيب، انقر فوق "إضافة مجموعة البيانات"، وتحميل قائمة من البروتين / الجينات. بعد ذلك، حدد نوع التخطيط لتصور تحليل GO.
      سيتم إظهارها GO تحليل النتائج في شكل الرسوم البيانية الدائرية: ملاحظة. هذه الخطوة تساعدنا على اكتساب المعرفة العالمية المرتبطة المرشحين في مجالات عملية بيولوجية (BP)، المكون الخلوية (CC)، والبيولوجيا الجزيئية وظيفة (MF).
  4. وصول ديفيد في http://david.ncifcrf.gov/ 27، انقر فوق "أداة الشرح وظيفية" على موقعها على الانترنت. أدخل قائمة المرشحين، حدد "معرف" من الجينات مثل "معرف يونيبروت"، حدد "قائمة جين" والبحث. شروط المخصب GO، القيم ص، وغيرها من المعالم يمكن العثور عليها عن طريق النقر على "الشرح ملخص نتائج" صفحة تحت فئة "Gene_Ontology".
  5. للتحقيق في التفاعلات المحتملة للمرشحين مع بروتينات أخرى، استخدم الوصول إليها علنا قاعدة بيانات STRING 28 إلى توضيح البروتين البروتين التفاعلات المحتملة والمسارات البيوكيميائية الممكنة.
    ملاحظة: أبدأ تحليل وشرح وظيفية (القسم 6،3-6،4) يمكن أيضا أن يقوم باستخدام أحدث البرامج STRING.
    1. الوصول إلى قاعدة بيانات في http://string-db.org/. إدخال معرف البروتين أو تسلسل في الصورة المعينةمربع earch واختيار الأنواع الصحيحة للتحليل. انقر على "بحث". فإن النتائج تعطي معلومات عن كل الجمعيات المباشرة (المادية) وغير المباشرة (وظيفية). سيتم عرض أفضل عشر مباريات المعروف للمرشح exosomal وينبغي النظر فيها لاختيار مرشح كبيرة.
      ملاحظة: هناك قدر كبير من المعلومات المرتبطة المرشحين يمكن تحليلها باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه. يمكن اختيار المرشحين الأبرز لمزيد من التحليل الجزيئي والكيمياء الحيوية المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1A هو مخطط يحدد SILAC وضع العلامات الإجراء 21. من أجل تنقية exosomes، لا بد من نسج عينات أسفل عن طريق الطرد المركزي. ويبين الشكل 1B خطوات تنقية exosome بواسطة تنبيذ فائق التسلسلي 21. مرة واحدة تنقيته، وexosomes تخضع لتحليل البروتين التجريبي على النحو المبين في الإجراء.

الشكل 2A هو مخطط لتحديد المرشحين كبير البروتين من البيانات البروتين 21. ثم يتم استخدام المرشحين المختارين لتحليل البروتينات المصب. الشكل 2B مثال SILAC الرسم البياني يعرض نسب تمثيلية النتائج البروتين الكمي النموذجية (تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون. 6)، والجدول رقم 1 هون مثال على تحديد القيم قطع للمرشحين كبير 6 من هذه رسوم بيانية نسبة SILAC. عن طريق اتباع الخطوات الموضحة في القسم 6.3، تم حساب القيم قطع لتحديد البروتينات الصاعدة بشكل كبير أو تنظيم أسفل. في هذه البينات التمثيلي، واعتبرت البروتينات مع الثقيلة / ضوء (H / L) نسبة أعلى من قيمة قطع العليا كما بشكل ملحوظ التنظيم، في حين اعتبرت البروتينات مع H نسبة / L أقل من قيمة قطع أقل كما انخفاضا كبيرا في التنظيم . كثيرا سيتعرض البروتينات مرشح التنظيم لاجراء مزيد من التحقيقات.

الشكل (3) يعرض تحليل المعلوماتية الحيوية واستخراج البيانات الإجراءات الشاملة للمرشحين كبير المحدد. الجدول 2 مثال استخراج البيانات التي تستخدم exosome وHIV-1 / المضيف قواعد البيانات التفاعل 6 لجمع المعلومات عن المرشحين (وهذا التبويبتم تعديل جنيه من لي وآخرون. 6). عن طريق التعدين exosome الحالية وقواعد البيانات التفاعل HIV-1 / المضيفة، تم العثور على ثلاثة عشر من المرشحين الأربعة عشر لربط مع exosomes. كانت معروفة خمسة من أصل أربعة عشر مرشحا أيضا للتفاعل مع HIV-1. من بينها، أربعة مرشحين (HSPA4، الصدمة الحرارية 70 كيلو دالتون بروتين 4؛ LDHB،-L اللاكتات سلسلة نازعة ب NUTF2، عامل النقل النووي 2 ؛؛ PTGES3، البروستاغلاندين E سينسيز 3) وجدت لربط مع كل من exosome وHIV-1. بين HSPA4، NUTF2، PTGES3 وLDHB، كان LDHB فقط باستمرار تحت وأعرب في جزء المصاب (المسمى الثقيلة). من خلال سلسلة من التحليلات، اخترنا LDHB أن يكون المرشح الأبرز، والتي يمكن أن تخضع لمزيد من الدراسة. يتم عرض التحليلات البروتينات المصب في الشكل يظهر 4. الشكل 4A خطوات قصيرة من الأنطولوجيا الجينات (GO) التحليل؛ يسرد الشكل 4B خطوات DAVI أداءتحليل دال؛ ويبين الشكل 4C كيفية إجراء تحليل الشبكة باستخدام سلسلة. أرقام 5A، 5B، و5C وتحليل DAVID مجموعة من أربعة عشر البروتينات في شركة بريتيش بتروليوم، CC وMF. ويبين الشكل 5D العشرة الأوائل شركاء التفاعل من LDHB. ويبين الشكل 5E أن غالبية الشركاء التفاعل من LDHB ترتبط أيضا مع exosome وHIV-1. واقترح الأولية نتائج تحليل DAVID أن العديد من المرشحين من الخلايا ذات الصلة، ومن المرجح مشاركة في بروتين ملزمة. وأكد مزيد من التحليل السلسلة التي LDHB ملزمة الشركاء أيضا وظيفيا وlocationally المتعلقة exosome وHIV-1. كل هذه النتائج تعطي معلومات قيمة عن التحقيقات المصب المحتملة.

شكل 1
الشكل 1: وضع العلامات SILAC وتنقية exosome باستخدام تنبيذ فائق التفاضلية.(A) تزرع مجموعتين من الخلايا على حدة. ويزرع مجموعة واحدة في المتوسط ​​المسمى لمدة ستة الأضعاف لوضع العلامات كاملة. ويزرع المجموعة الأخرى في الوسط الخالي من الملصقات الطبيعي لنفس الفترة. المقبل، وإصابة الخلايا المسمى مع HIV-1، في حين أن الخلايا غير المسماة ليست كذلك. وأخيرا، يتم عزل exosomes من كلا الفريقين في نفس الوقت. يشار إلى (ب) عينات (supernatants أو الكريات) المستخدمة في الطرد المركزي في كل خطوة في أنابيب الاختبار. الكسور التي يمكن الاستغناء عنها لاحظت على الجانب الأيمن من أنابيب الاختبار. وترد أيضا سرعة وطول كل الطرد المركزي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: خطوات إلى التحقق من صحة بيانات البروتين (ق) وتحديد الموالية كبيرالمرشحين البروتين. (أ) مخطط انسيابي لتحديد المرشحين كبير البروتين من بيانات البروتين (ق). هذه الخطوات الأربع تضمن اختيار موثوقة من المرشحين كبيرا. أولا، يتم رسم على SILAC نسبة الرسم البياني لتقييم جودة البيانات. تتم إزالة المقبل، والمرشحين أقل المثالي الذي يمكن أن تقلل من دقة. في الخطوة الثالثة، يتم استخدام الأساليب الإحصائية لتحديد عتبات أهمية بالنسبة للمرشحين المحتملين البروتين. وأخيرا، يتم تحليل البيانات تكرار المرشحين كبيرا من أجل التناسق، واندمجت في نهاية المطاف. (ب) الرسم البياني الممثل نسب SILAC. وكشف الرسم البياني توزع متناظر على طول نسبة = 1 (log2 = 0) خط الاتجاه. يتم تجميع نسب log2 تحويلها إلى صناديق النسبة، ويظهر محور y العدد النسبي للنسب الكشف في سلة المهملات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: تحليل والبيانات المعلوماتية الحيوية عموما الإجراءات التعدين للمرشحين كبير. إجراءات تحتوي التعدين exosomal وHIV-1 / المضيف البيانات وتوصيف جين علم الوجود، وتحليل ديفيد والتنبؤ الشبكة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
يحلل خطوات لأداء الجينات الأنطولوجيا توصيف، والإثراء، ومسار: الرقم 4. (A) خطوات لأداء الأنطولوجيا الجينات (GO) التوصيف. لاكتساب المعرفة وظائف وتعريب التحت خلوية من المرشحين كبير، خطوات لإجراء تحليل GO باستخدام التطبيقويوضح البرنامج ropriate 26. (ب) الخطوات لإجراء تحليل لتخصيب GO الأجل. للحصول على معلومات التخصيب من المرشحين كبير، وتظهر خطوات قصيرة لإجراء تحليل ديفيد. (C) خطوات لأداء التفاعل وتحليل المسارات. لتوضيح المسارات الممكنة وإيجاد شركاء وظيفية، والخطوات اللازمة لأداء التفاعل أو تحليل الشبكة STRING ترد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الممثل ديفيد وتحليل النتائج STRING. النتائج تخصيب (A) BP من أربعة عشر مرشحا عن طريق تحليل ديفيد. يتم إثراء كبير العمليات المتعلقة موت الخلايا. (ب) enrichmen CC النتائج طن من أربعة عشر مرشحا عن طريق تحليل ديفيد. العديد من البروتينات لديهم أصل الخلايا. النتائج تخصيب (C) BP من أربعة عشر مرشحا عن طريق تحليل ديفيد. معظم المرشحين بالمشاركة في بروتين ملزمة. (D) أعلى عشرة شركاء LDHB التي حددها STRING التفاعل. (E) وترتبط غالبية الشركاء LDHB أيضا مع exosome وHIV-1، الذي يدعم كذلك أدوار LDHB في exosome / HIV-1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: حساب ممثل القيم قطع لاضطراب كبير البروتين.

e2.jpg "/>
الجدول 2: الترابط بين المرشحين SILAC وتعريب exosomal وتفاعلهم مع HIV-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الإجراءات الموضحة في هذه الورقة، أثبتنا تطبيق تقنية SILAC لدراسة تأثير الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 1 على بروتيوم exosomal المضيف. في البداية، الخلايا المصابة غير المصابة وHIV-1 هي تفاضلي المسمى النظير. ثم يتم تنقيته من exosomes المسمى تفاضلي قبل تنفيذ استخراج البروتين. بعد ذلك، يتم توظيف السائل اللوني، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة لتحليل بروتيوم exosomal. وأخيرا، يتعرض ينتج عن ذلك من بيانات مطياف الكتلة والبروتينات المرشحة المحتملة لالإحصائية والمعلوماتية الحيوية يحلل قبل تشريح البيوكيميائية المصب.

لا بد من اتباعها لتحقيق النتائج الأمثل الخطوات الحاسمة في جميع أنحاء البروتوكول. في المراحل الأولى من البروتوكول، ووضع العلامات SILAC يمكن أن تتأثر نوع من الخلايا ووضع العلامات المتوسطة. وينبغي أن تستخدم الخلايا السليمة والتكاثري للغاية للحصول على كفاءة عالية الوسم. الأهم من ذلك، وصفها مedium ينبغي إعداد حديثا باستخدام مدال مصل الجنين البقري (FBS) بدلا من FBS منتظم. يتم استنفاد مدال FBS من الأحماض الأمينية والببتيدات وهو، بالتالي، أقل عرضة للتدخل في وضع العلامات SILAC. ومع ذلك، ينبغي الإشارة إلى أن المصل مدال قد لا تكون مناسبة لبعض خطوط الخلايا، وخاصة الخلايا الأولية. وينبغي تأكيد النمو الطبيعي في المتوسط ​​مع FBS مدال قبل توظيف استراتيجية SILAC. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام مزدوج "الثقيل" النظائر وضع العلامات (13 C 6 L-ليسين و 13 C 6 15 ن 4 L-أرجينين) بدلا من استخدام 13 C 6 L-يسين منفردة، يمكن أن تزيد من عدد من الببتيدات كميا في قياس الطيف الكتلي تحليل. الحد الأدنى لعدد الخلايا اللازمة لنجاح تحليل بروتيوم اللاحق يعتمد على عوامل كثيرة، مثل حساسية مطياف الكتلة، كتلة كل خلية، وبروتيوم استهدفت (بروتيوم كله أو بعد متعدية بروتينات معدلة). وبناء على النتائج التي توصلنا إليها، ونحن نوصي عشرة ملايين الخلايا كما مبلغا أوليا في تقدير العدد المناسب من الخلايا اللازمة لقياس الطيف الكتلي.

Exosome بمعزل عن supernatants ثقافة الخلية يمكن تحسينها بإضافة خطوة الترشيح على النحو التالي. للتعليق من الخلايا، ويتم خطوة الطرد المركزي الأولية في 200 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة خلايا معلقة في طاف، ثم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون 29 و 30. لخلايا ملتصقة، طاف يمكن جمعها مباشرة من الثقافة وتصفيتها في نفس الطريق. الترشيح هو خطوة حاسمة لفصل exosomes من المواد الملوثة، مثل الجزيئات الصغيرة والببتيدات. ويمكن بعد ذلك exosomes تكون معزولة من طاف باستخدام طريقة تنبيذ فائق الكلاسيكية، أو باستخدام المتاحة تجاريا الكواشف العزلة exosome مجموعات. نقاء exosome يمكن التحقق من nanopartiتحليل تتبع شركة كلي أو المجهر الإلكتروني (31).

منذ HIV-1 virions تتشابه عادة في حجم exosomes، فإنها قد تلوث exosomes تنقيته من HIV-1 العينات المصابة. في شاشات البروتين، والملوثات فيروسية محتملة يمكن أن تخرج عن طريق الحد من البحث في قاعدة البيانات فقط على البروتينات البشرية. ويمكن أيضا تقنيات العزل مزيد باستخدام المنهجيات المقررة مثل التدرجات كثافة iodixanol والعزلة immunoaffinity أن تستخدم لفصل HIV-1 virions من exosomes 32 و 33.

المقبل، ونحن مناقشة بعض الاقتراحات لضمان تحليل بيانات موثوقة لتحديد المرشحين المحتمل كبير مرة واحدة يتم الحصول على نتائج MS من exosomes معزولة. في الخطوة الأولى من التحليل، يجب أن نسبة الرسم البياني SILAC تتبع التوزيع الطبيعي. إذا كان منحرفا توزيع البيانات في اتجاه معين، سوف تحتاج إلى قارئ لتحديد الالبريد يسبب قبل الشروع في تحليل. على سبيل المثال، وعينات وصفت وغير المسماة قد لا يكون مختلطة بنسب متساوية. أيضا، قد لا يكون بعض الببتيدات الثقيل / ضوء القيم نسبة SILAC، وينبغي القضاء من المرشحين المحتملين البروتين. بعد أن يتم اختيار المرشحين، والبرمجيات وقواعد البيانات يمكن استخدامها للتحقق من تخصيب exosome، التفاعل مع ظروف الاختبار، والممرات الممكنة. يجب أن تكون ملغومة التفاعلات بين البروتينات مرشح وحالة اختبار من خلال قواعد بيانات محددة قبل تحليل المعلوماتية الحيوية. لالمعلوماتية الحيوية الأوصاف، ويمكن تحديد الشروح الأنطولوجيا الجينات باستخدام البرمجيات وقواعد البيانات المختلفة،

تقنية SILAC يعملون هنا تقدم مقاربة منهجية واضحة لتحليل exosomal المضيف بروتيوم. ان معظم المختبرات الطبية تكون قادرة على اعتماد إجراءات الحصول على معدات إضافية الحد الأدنى وتكلفة إضافية. تقنية SILAC، ومع ذلك، دي في المقام الأولوقع لدراسات تستخدم خطوط الخلايا. على هذا النحو، قد تحتاج إلى استخدامها لدراسة العينات البيولوجية المختلفة أساليب أخرى. على سبيل المثال، (مراقبة رد فعل متعددة) طريقة التسمية خالية MRM يمكن أن تستخدم لتقدير المستهدفة من البروتينات والببتيدات في عينات سريرية 9، 34. بينما في حالة تحديد محتوى البروتين من دراسات متعددة، ويمكن أيضا تقنية SILAC استخدامها لتحقيق اثنين أو أكثر من العينات. طريقة وضع العلامات الكيميائية iTRAQ (العلامات إسوي الضغط لتقدير النسبي والمطلق) أو على أساس TMT (جنبا إلى جنب العلامة الجماعية) وسائل تسمح أعلى بكثير المتنوعة، وسوف تكون مناسبة، أفضل لعينات متعددة.

الإجراء الموضح هنا لا يقتصر على توصيف البروتين من exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة. مع بعض التعديلات، ويمكن تكييفه لتحليل exosomes تحت مجموعة واسعة من التجارب والإجهاد ظروف مثل عدوى بكتيرية، والعدوى الفيروسية، ورادينتقم. بل هو أيضا مناسبة لدراسة المقصورات التحت خلوية أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الملحق الأذربيجانية إلى عمر / تافتس / براون CFAR، P30AI042853-13S1، المعاهد الوطنية للصحة P20GM103421، P01AA019072، R01HD072693، وK24HD080539 إلى BR. وأيد هذا العمل أيضا من قبل صندوق عمر الطيار البحوث (# 701- 5857)، رود ايلاند مؤسسة أبحاث الطبية غرانت (# 20133969)، والمعاهد الوطنية للصحة كوبر أوري / RIH الطيار منحة بحثية (P20GM104317) لML. نشكر جيمس Myall وVY دانغ للمساعدة في إعداد المخطوط والشكل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1 NL4-3 NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Tags

عدوى، العدد 121، Exosomes، خارج الخلية مركبات HIV-1، البروتيوميات، الطيف الكتلي، SILAC، المعلوماتية الحيوية
SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, … More

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter