Summary
여기서는 호스트 exosomal의 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 분석하기 위해, 세포 배양 (SILAC)의 아미노산이 안정 동위 원소에 의한 표지의 기술을 이용하여 정량적 프로테오믹스 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 쉽게 다른 스트레스 또는 감염 조건 하에서 세포에 적용 할 수있다.
Introduction
바이러스 감염을 포함한 많은 인간의 질병은 종종 및 영향을받는 세포 주위에 발생하는 독특한 세포 과정과 연결되어 있습니다. 단백질은 종종 이러한 과정을 중재 궁극적 이펙터 세포로서 작용. 단백질의 분석은 종종 영향을 세포의 지역 환경에 관한 귀중한 정보를 제공하고 질병 발병의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 있습니다. 다양한 단백질 분석 기법 중 프로테오믹스 특히 큰 약속을 보유하고있다. 강력한 대규모 도구로서 특히 프로테오믹스 기능과 단백질의 상호 작용의 영역에서 세포 과정의 체계적인 이해를 제공 할 수있다. 특정 단백질을 분석하여 조사 부위에서 연구자들은 세포 성분, 특히 단백질의 발현을 모니터링 할 수 있도록 분류 기술의 개발을 간단하게한다. 많은 프로테옴 분석은 세포에서 수행되었지만프로테옴 규모, 세포 내 구획에 단백체 특성화 1 특히 유익한 것으로 판명했다. 이는 HIV-1 감염의 연구에서 잘들 수있다.
엑소 좀 셀 타입 2, 3, 광범위한 분비 30-100 nm의 막 소포 간 통신 및 분자 수송의 중요한 구성 요소이다. 이들은 이전에 HIV-1 신진 공정 4, 5에 중요한 역할을하는 발견되었다. 기능 해부와 단백체 분석을 결합함으로써, 우리는 HIV-1에 감염된 세포에서 방출 엑소 좀은 세포 사멸 및 증식 (6)을 포함하여 수용 세포를 이웃에 휴대 속성에 영향을 미칠 독특하고 정량적으로 다른 단백질 서명과 항구 규제 분자로 구성되어 있음을 발견했다. 방법이 프로토콜에 설명되어즉 SILAC HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀 7 기반 단백체 특성 (세포 배양에서 아미노산에 의해 안정 동위 원소 라벨). 비슷한 접근 방식은 더 나은 특정 구획 또는이자의 일부에 실험 스트레스를 조절하고 설명 된 절차에 필요한 사항을 변경하여 발병하는 동안 다른 세포 내 구획을 이해하고 적용 할 수 있습니다.
정량 프로테오믹스 방법의 최근 발전을 감안할 때, 특정 실험을 위해 가장 효율적인 방법을 선택 할 때 선택할 많은있다. 이 중 화학 기반 iTRAQ (상대 및 절대 정량 동중 태그) (8) 및 라벨없는 MRM (다중 반응 모니터링) (9) 기술이다. 두 방법 모두 강력한 도구이며 특정 설정을위한 좋은 선택입니다. 일반적인 실험실은 주로 세포 라인 작업을 위해, 그러나,이 두 가지 방법이 relativel이Y 높은 비용은 더 많은 시간이 걸리는 SILAC 기반 방법에 비해. SILAC 세포질 단백질로 배양 배지로부터 아미노산의 비 방사성 동위 형태를 포함 대사 라벨링 기반 기술이다. 일반적으로 SILAC 실험 예를 들어 두 개의 세포 집단, 감염 및 감염되지 않은 시작합니다. 전체 라벨이 달성 될 때까지 각각 차등의 특정 동위 원소 환경에서 레이블이 붙어 있습니다. 이러한 세포의 표지 엑소 좀이어서 단백질 추출을 실시한다. 일단 분류 exosomal 단백질 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분광법 (10)를 사용하여 분석된다 추출 하였다. 마지막으로, 질량 분석 결과와 유의 표지 단백질은 통계를 실시하고 정보학 엄격한 생화학 검증뿐만 아니라 분석한다. 이전 조사 보고서 세포주는 일반적되는 것과 SILAC / 엑소 절차, 일차 전지보다 세포주에 더 적합한 것으로 제안효율적인 동위 원소 라벨에 대한 활성 증식 상태,
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Protocol
1. 세포 배양 및 HIV-1 감염
참고 : 실험을 시작하기 전에,이 MTT 분석 (12)를 통해 트리 판 블루 염색 (11)를 통해 세포의 생존과 증식을 확인하는 것이 좋습니다. 또한 새롭게 준비 SILAC 매체를 사용하는 것이 중요합니다. 다양한 세포주가 활발하게 증식 단계에 있으며, HIV-1 감염, 또는 원하는 시험 조건에 민감한만큼 사용될 수있다. 이 프로토콜에서, 예로서, H9 세포주를 사용한다.
- 각 세포 배양 플라스크에 종자 2 × 106 H9 세포. 10 % 투석 된 소 태아 혈청 (FBS), 100 ㎎ / ℓ (13) C (6) L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ 13 15 C 6 N 4 L 아르기닌을 함유하는 RPMI 1640 배지 10ml에 표시된 하나의 그룹으로 성장한다. 투석 FBS 10 %, 100 ㎎ / ℓ의 L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ L- 아르기닌과 함께 10 mL의 표지되지 않은 RPMI 1640 배지에서 다른 그룹 성장.
- 큰 아미노산으로 표지 된 배지에서 세포의 단백질이 실질적으로 완전히 분류되는 점을 6 분열 (> 99 %)에 대한 세포 성장. 신선한 매체를 추가 또는 정기적으로 미디어를 변경 (모든 1~3일 세포의 종류에 따라. H9 세포의 경우, 중간 3 일마다 변경). 라벨의 끝에서보다 세포의 성장을 수용하기 위해 배양 부피 (예를 들어 ~ 30 ㎖)을 증가시킨다.
주 : 트립 판 블루 염색법 및 세포 계수를 통해 실험의 시작 시간을 두배 정확한 셀을 결정한다. - HIV-1 NL4-3 48 시간 동안 표준 HIV-1 감염 프로토콜 13을 사용으로 표시된 세포를 감염. 0.3 주변 감염의 다중성 (MOI)로 바이러스의 적절한 양의 세포를 인큐베이션. 에이즈-1 P24 항원 ELISA 키트를 사용하여 배양 상층 액의 P24 정량에 의해 HIV-1 감염을 확인합니다. 세포의 성공적인 감염을 확인하기 위해 면역 형광 분석 (14)을 수행합니다. KEEp는 HIV-1 감염없이 레이블이없는 배지에서 레이블이없는 세포를 성장.
- 감염의 끝 (2.1 단계)에서 두 그룹의 상층 액을 수확.
2. 엑소 좀 격리
주 : 초 원심 분리의 일련의 단계를 통해, 배양 상청액 분획으로부터 exosomal 15 농축된다. 적어도 100,000 × g으로의 속도에 도달 할 수있는 초 원심 분리기 로터와 4 ° C에서 다음의 모든 단계를 수행합니다.
- 세포를 피하고, 50 ML 원뿔 튜브의 문화의 상층 액을 수집합니다. 잔여 세포를 제거하기 위해 300 × g으로 10 분 동안이를 원심 분리기.
- 새로운 50 ML 원뿔 튜브의 상층 액을 수집하고 죽은 세포를 제거하는 2,000 XG에 10 분을 원심 분리기. 초 원심을 견딜 수있는 상업 회 호환 튜브에 상층 액을 결과로 전송.
- 초원 심 분리기 튜브의 균형을해야합니다. 제거 10,000 × g으로 30 분 동안 튜브를 원심세포 파편.
- 100,000 x g에서 70 분 동안 초 원심 분리기 튜브의 상층 액을 원심 분리기를 수집합니다. 상층 액을 버린다.
- 신선한 PBS 5ml에 엑소 좀 풍부한 펠릿 재현 탁. 100,000 x g에서 70 분 동안 다시 신선한 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송합니다.
- 취소 상층 액. 엑소 좀을 장기 저장하려면, -80 ° C에서 PBS와 저장소의 50 μL에 펠렛을 재현 탁. 아래 그림과 같이 다른 방법으로, 단백질 추출에 직접 진행합니다.
3. 단백질 추출 및 준비
- 추가 프로테아제 억제제 칵테일 100 ~ 200 ㎕를 RIPA 용해 및 추출 버퍼에 격리 exosomal 알약을 녹여. 버퍼을 pH 7.6에서 25 mM 트리스 - 하이드로 클로라이드, 150mM 염화나트륨, 1 % NP-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS (도데 실 황산나트륨)로 구성된다. 프로테아제 저해제 칵테일은 아프로 티닌, bestatin, L 같은 프로테아제 억제제의 다양한 포함해야eupeptin는 및 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 펩 스타틴, 즉 프로테아제의 전체 범위를 억제 할 수있다.
- 13,000 XG (4 ° C)에서 10 분 동안 용해 된 솔루션을 원심 분리기, 새로운 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 삭제 상층 액을 전송합니다.
- bicinchoninic 산 (BCA) 또는 브래드 포드 분석법 (16)을 이용하여 엑소 좀의 각 샘플의 단백질 농도를 정량화.
- 레이블과 레이블이없는 샘플에서 단백질의 동일한 양 (2 μg의)를 혼합하고 120mA에서 4-20 % SDS-PAGE 겔에 동일한 혼합물을 실행 / 200 V 분 30.
- 쿠마시 블루 염색 된 겔 (17)을 탈색 하였다.
- 면도날을 사용하여 겔로부터 샘플 레인 잘랐다. 그런 다음 10 ~ 15과 동일한 조각으로 겔 차선을 잘라. 10 ~ 15 튜브의 총 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 각 조각을 넣어.
- 50 % 아세토 니트릴, 소용돌이 25 mM의 NH 4 HCO 3 큐브를 체험하고, 상층 액을 버린다. 두 번 반복합니다. 마른진공 농축기 (18, 19)에 큐브.
- 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 소용돌이, 그리고 원심 분리기 간단히 큐브를 재수. 1 시간 동안 56 ° C에서 품어. 폐기 뜨는.
- 55 MM의 요오도 아세트 아미드, 소용돌이, 스핀에서 젤 큐브를 담가. 45 분 동안 어둠 속에서 실온에서 인큐베이션. 폐기 뜨는.
- 25 mM의 NH 4 HCO 3, 소용돌이, 스핀 큐브를 체험하고, 상층 액을 버린다.
- 50 % 아세토 니트릴, 소용돌이, 스핀에서 25 mM의 NH 4 HCO 3 조각을 담가. 3.9와 3.10를 반복합니다.
- 진공 농축기에서 큐브를 건조. 25 mM의 NH 4 HCO 3에서 25 ㎕의 서열 등급 수정 트립신을 추가, 30 분 동안 4 ° C에서 배양하고, 초과 솔루션을 폐기합니다. 트립신없이 25 mM의 NH 4 HCO 3 큐브를 담그고, 하룻밤에 37 ° C를 품어.
- 간단히 아래로 큐브를 회전 및 추가 생성 된 펩타이드를 전송새로운 튜브에 중부 표준시. 30 분, 스핀를 들어, 큐브에 50 % 아세토 니트릴 소용돌이를 5 % 포름산의 30 μl를 추가합니다. 추출물에 뜨는을 결합합니다. 이하의 5 μL을 진공 농축기와 펩티드 추출물을 건조.
- LC-MS / MS 분석을 위해 질량 분석기 핵심 기능 샘플을 제출한다. 오픈 소스 소프트웨어에서 생성 할 수있는 MS 분석 데이터는 전형적으로 기탁 식별 된 각각의 단백질 번호 표지 / 비 표지 된 펩티드 및 식별 된 고유의 수를 포함한다.
4. 웨스턴 블로 팅 확인
참고 : 웨스턴 블롯은 질량 분석 결과를 확인하는 것이 좋습니다.
- 표준 웨스턴 블로 팅 프로토콜에 따라로드되는 각 그룹에서 단백질의 동일한 금액을 보장합니다. MS에 의해 식별 관심의 단백질에 대한 항체 (예를 들어 넥신 A5, 젖산 탈수소 효소의 B 체인)를 사용합니다. 농도계의 analysi와 함께 웨스턴 블로 팅 검출,의, MS 단백질 식별 및 정량이 올바른지 재확인 할 수 있습니다.
5. 단백체 데이터 분석
참고 : 각 MS 복제에 대한 중요한 단백질 후보의 데이터 품질 평가, 데이터 전처리, 계산 및 결정은 개별적으로 수행됩니다. 상기 분석이 완료되면, 복제에서 분석 된 데이터를 비교하고, (21) 20 (6) 합성.
- MS 데이터의 품질을 평가한다.
- 우선, SILAC-MS 스프레드 시트 프로그램 / 정량 단백질 표지 된 비 표지 변환 LOG2.
- 과학적 그래프 통계 소프트웨어 그룹의 비율이 40-100 빈들에 비하고 히스토그램을 생성하기 위해 빈 당 비의 수를 플롯. 히스토그램의 정규 분포는 MS 데이터 (6)의 좋은 품질을 나타냅니다. 모든 MS가 복제에 대해이 단계를 수행합니다.
- MS는 펩티드의 비 신뢰성 및 정확성을 높이기 위해 2 개 미만 정량화 펩타이드가 단백질을 제거하는 것을 고려.
- 크게 상향 및 하향 조절 단백질 후보를 결정하기 위해, 의미 (22)을 임계 값 계산하기 위해 다음 단계를 사용하십시오.
- 과학적 그래프 통계 소프트웨어, 도수 분포 데이터를 비선형 회귀 또는 곡선 맞춤을 생성한다. 이 단계는 컷오프 값을 계산하는데 사용될 수있는 값을 산출한다. 99 % 신뢰 한계에 대해 1.96, 95 % 신뢰 한계에 대한 σ 또는 2.56 σ ± 평균과 한계 값을 계산합니다.
참고 : 컷오프를 계산의 구체적인 세부 사항은 Emmott 등의 알에서 찾을 수 있습니다. 22. - 중 중간 아래 (크게 과발현) 중간 위보다 1.96 (또는 2.56) 표준 편차 이하보다 1.96 (또는 2.56) 표준 편차 (누구의 비율 인 단백질 후보를 선택크게 아래의 발현).
- 과학적 그래프 통계 소프트웨어, 도수 분포 데이터를 비선형 회귀 또는 곡선 맞춤을 생성한다. 이 단계는 컷오프 값을 계산하는데 사용될 수있는 값을 산출한다. 99 % 신뢰 한계에 대해 1.96, 95 % 신뢰 한계에 대한 σ 또는 2.56 σ ± 평균과 한계 값을 계산합니다.
- 일관성을 달성하기 위해 상기 식별 된 중요한 후보의 복제를 비교한다. 그들은이 최종 선택 단계를 통과하기 위해 다음과 같은 기준을 충족하는지 확인하십시오 후보가 일관되게 모든 복제에서 확인되어야한다 그리고 후보의 복제가 규제 자신의 방향으로 일관성이 있어야합니다 (규제 상향 또는 하향 조정 바람직 후보의 3 복제 중 적어도 2 중이어야 함).
- 그 복제의 데이터를 병합하여 상기 언급 된 기준을 충족 후보 데이터 확정.
6. 생물 정보학 확인 및 특성
참고 : 기존의 게놈 및 생물 정보학 정보는 거의 모든 단백질에 대한 풍부한 정보를 제공합니다. 정보에 대한 데이터 마이닝 및 생물 정보학 분석은 중요한 후보자의 재산과 기능에 대한 통찰력의 큰 거래를 확보에 도움이 될 수 있습니다. 이 proce을SS는 적절한 하류 습식 실험실 실험을 설계하는 것이 필요하다.
- 자신의 GenBank 액 번호 또는 UniProt ID를, 현재의 엑소 좀 데이터베이스에 대해 후보자를 검색 (Exocarta 23 Evpedia 24)를 사용하여 후보 단백질 이전 엑소에서 발견되어 있는지 확인합니다. 이 단계는 후보 엑소 좀에 참으로 신뢰의 레이어를 추가합니다.
- 액세스 http://www.exocarta.org/는 "조회"입력하거나 유전자 또는 단백질 이름 / 가입 번호를 클릭합니다. 요약 페이지가 나타납니다와 엑소의 증거는 존재하는 경우 제공, 표시됩니다.
- 에이즈-1과 인간 단백질 상호 작용 데이터베이스 (25)에 대한 후보를 검색 할 수 있습니다. 대안 적으로, 후보 단백질의 상호 작용 및 테스트 조건에 대한 정보를 제공 할 수있는 특정 데이터베이스를 검색.
- www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV에서 데이터베이스에 액세스상호 작용. '단백질 도메인 이름'항목에서 후보자의 이름 또는 가입 번호를 입력하고 검색을 클릭합니다. 검색 결과는 HIV-1 단백질 후보들 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하고, 진정으로 HIV-1이 연관 될 수있는 후보들의 제안 할 수있다.
- 오기 GenBank 등록 번호 또는 (예컨대 FunRich 기능적 보충 분석 도구 (26)) GO 분석 소프트웨어로 후보 UniProt ID 및 소프트웨어를 실행.
- http://www.funrich.org/에서 소프트웨어를 다운로드합니다. 설치 후, 농축 분석에서, 클릭 "데이터 세트 추가"소프트웨어를 열고, 단백질 / 유전자의 목록을 업로드 할 수 있습니다. 다음으로, GO 분석을 시각화 할 수있는 차트 유형을 선택합니다.
참고 : GO 분석 결과는 파이 차트의 형태로 가시화 될 것이다. 이 단계는 (생물학적 프로세스 (BP), 세포 구성 요소의 분야에서 후보자와 관련된 글로벌 통찰력을 얻을 C를 도움이C), 분자 기능 (MF).
- http://www.funrich.org/에서 소프트웨어를 다운로드합니다. 설치 후, 농축 분석에서, 클릭 "데이터 세트 추가"소프트웨어를 열고, 단백질 / 유전자의 목록을 업로드 할 수 있습니다. 다음으로, GO 분석을 시각화 할 수있는 차트 유형을 선택합니다.
- 액세스 데이비드는 http://david.ncifcrf.gov/ 27, 자사의 웹 사이트에 "기능 주석 도구"를 클릭합니다. , 예를 들면 "UniProt ID"로 유전자의 "식별자"를 선택, 후보 목록을 입력 "유전자 목록"및 검색을 선택합니다. 농축 GO 조건, P-값 및 다른 매개 변수는 "Gene_Ontology"카테고리에서 "주석 요약 결과"페이지를 클릭하여 확인할 수 있습니다.
- 다른 단백질과 후보자의 잠재적 인 상호 작용을 조사하기 위해, 잠재적 인 단백질 - 단백질 상호 작용이 가능한 생화학 적 경로를 명료하게 공개적으로 액세스 할 수 STRING 데이터베이스 (28)를 사용합니다.
주 : 분석 기능성 주석 (제 6.3-6.4)를 이동도 최신 STRING 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다.- http://string-db.org/에서 데이터베이스에 액세스 할 수 있습니다. 지정된 S에 입력 단백질 ID 또는 시퀀스earch 상자와 분석에 대한 올바른 종을 선택합니다. "검색"을 클릭합니다. 결과는 모두 직접 (물리적) 및 간접 (기능) 협회에 대한 정보를 제공합니다. exosomal 후보에 대한 상위 10 알려진 경기가 표시됩니다 상당한 후보 선택을 위해 고려되어야한다.
주 : 후보와 관련된 많은 정보는 위의 단계를 사용하여 분석 될 수있다. 가장 중요한 후보 하류 분자 및 생화학 적 분석을 위해 선택 될 수있다.
- http://string-db.org/에서 데이터베이스에 액세스 할 수 있습니다. 지정된 S에 입력 단백질 ID 또는 시퀀스earch 상자와 분석에 대한 올바른 종을 선택합니다. "검색"을 클릭합니다. 결과는 모두 직접 (물리적) 및 간접 (기능) 협회에 대한 정보를 제공합니다. exosomal 후보에 대한 상위 10 알려진 경기가 표시됩니다 상당한 후보 선택을 위해 고려되어야한다.
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Representative Results
도 1a는 SILAC 라벨링 방법 (21)을 개략적으로 나타내는 흐름도이다. 엑소 좀을 정제하기 위해, 샘플은 원심 분리를 통해 스핀 다운되어야한다. 도 1b는 직렬 초 원심 분리하여 엑소 좀 21 정화 단계를 도시한다. 정제하면 절차에 설명 된 바와 같이, 엑소 좀 실험 단백체 분석 될 수 있습니다.
도 2a는 단백체 데이터 (21)로부터 상당한 단백질 후보를 결정하기위한 흐름도이다. 선택한 후보는 다음 하류 프로테오믹스 분석에 사용됩니다. 도 2b는 SILAC 히스토그램의 예 (이 숫자는 리튬 등의 변형되었다. 6) 일반적인 단백질 정량 결과를 나타내는 비율을 표시하고, 표 1이고이러한 SILAC 비율 히스토그램 상당한 후보 6 기준치를 결정하는 N 예. 6.3 절에 설명 된 단계에 따라 크게 상향 또는 하향 조절 단백질을 결정하는 컷오프 값을 계산 하였다. 낮은 컷오프 값 이하의 H / L 비율과 단백질로 크게 규제 다운 생각하는 동안이 대표 데이터 세트에서, 상부 컷오프 값보다 무거운 / 라이트 (H / L) 비율과 단백질 등 크게 규제 업 간주되었다 . 크게 규제 후보 단백질은 추가 조사를 실시 할 것입니다.
그림 3을 표시 선택한 중요한 후보에 대한 전반적인 생물 정보학 분석 및 데이터 마이닝 절차. 표 2는이 탭 후보자에 대한 정보를 (수집하기 위해 6 엑소 좀과 HIV-1 / 호스트 상호 작용 데이터베이스를 활용하는 데이터 마이닝 예입니다제작은 리튬 등의 알에서 수정되었습니다. 6). 현재 엑소 좀과 HIV-1 / 호스트 상호 작용 데이터베이스를 광산으로, 열네 후보 중 열세는 엑소 좀과 연관 밝혀졌다. 다섯 열네 아웃 후보들은 HIV-1과 상호 작용하는 것으로 알려져 있었다. 이들 중, 네 후보 (HSPA4, 열충격 70 kDa 단백질 4] NUTF2 핵 수송 인자 2; PTGES3, 프로스타글란딘 E 신타 3] LDHB, L- 락 테이트 탈수소 효소 B 쇄)은 엑소 및 HIV-1 모두와 연결하는 것으로 하였다. HSPA4, NUTF2, PTGES3 및 LDHB 중 만 LDHB은 (무거운 표시)에서 발현 감염된 부분에서 일관했다. 일련의 분석을 통해, 우리는 더 많은 연구를 실시 할 수있는 가장 중요한 후보가 될 LDHB를 선택했습니다. 다운 스트림 프로테오믹스 분석은 그림에 표시 4. 그림 4a는 유전자 온톨로지 (GO) 분석의 간단한 단계를 보여줍니다된다 도 4b는 수행 DAVI의 단계를 나열D 분석; 도 4c는 STRING을 사용하여 네트워크 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 도 5A, 5B 및 5C는 BP, CC 및 MF 14 개 단백질의 집합의 DAVID 분석이다; 그림 5D는 LDHB의 상위 10 상호 작용 파트너를 보여줍니다; 도 5E는 LDHB 파트너의 상호 작용의 대부분은 또한 엑소 및 HIV-1과 연관되어 있음을 보여준다. 초기 DAVID 분석 결과는 많은 후보자가 세포 사멸 관련있는 가능성 단백질 결합에 참여할 것을 제안했다. 또한 STRING 분석 LDHB 파트너도 기능과 위치 적 엑소 좀과 HIV-1과 관련된 결합 함을 확인 하였다. 이러한 모든 결과는 잠재적 인 다운 스트림 조사에 대한 유용한 정보를 제공합니다.
그림 1 : SILAC 라벨링 및 차등 초 원심 분리를 이용하여 엑소 좀 정화.(A) 세포의 두 그룹은 개별적으로 성장하고 있습니다. 한 그룹은 완전한 라벨링 여섯 분열 표지 배지에서 성장시킨다. 다른 군은 동일한 기간 동안 정상적인 표지 된 배지에서 성장시킨다. 표지 된 세포가없는 상태에서 다음에, 표지화 된 세포는 HIV-1 감염된다. 마지막으로, 두 그룹에서 엑소 좀 병렬로 격리됩니다. 각 단계에서의 원심 분리에 사용되는 (B) 샘플 (상층 액 또는 펠렛)을 시험관에 나타내었다. 분획 테스트 튜브의 우측에 기록되어 폐기된다. 속도와 각 원심의 길이도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 단백체 데이터 세트 (들)을 검증하고 의미있는 직업을 결정하는 단계TEIN 후보. 단백체 세트 (S)에서 중요한 단백질 후보를 결정 (A)의 흐름도. 이 네 단계는 중요한 후보자의 신뢰할 수있는 선택을 보장합니다. 우선, SILAC 비율 히스토그램 데이터의 품질을 평가하기 위해 도시된다. 정확도를 낮출 수있는 다음, 덜 이상적인 후보가 제거됩니다. 세 번째 단계에서, 통계적 방법은 잠재적 인 단백질 후보에 대한 중요성 임계 값을 설정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 중요한 후보자의 복제 데이터는 일관성을 분석하고 결국 병합됩니다. (B) SILAC 비율의 대표적인 히스토그램. 히스토그램은 비 = 1 (LOG2 = 0) 추세선을 따라 대칭 분포를 밝혔다. LOG2 변환 비율은 비 빈들로 그룹화하고, y 축은 빈당 검출 비율의 상대적 개수를 도시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 중요한 후보에 대한 전반적인 생물 정보학 분석 및 데이터 마이닝 절차. 절차는 exosomal 및 HIV-1 / 호스트 데이터 마이닝, 유전자 온톨로지 특성, DAVID 분석 및 네트워크 예측을 포함하고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 유전자 온톨로지 특성, 농축을 수행하는 단계, 및 경로 분석. (A) 유전자 온톨로지 (GO) 특성화를 수행하는 단계. 응용 프로그램을 사용하여 GO 분석을 수행하는 기능과 중요한 후보자의 세포 내 현지화 단계의 통찰력을 얻으려면ropriate 소프트웨어 (26)이 도시되어있다. (B)는 GO 용어 보충 분석을 수행하는 단계. 중요한 후보자의 농축 정보를 얻으려면, DAVID 분석을 수행하는 간단한 단계가 표시됩니다. (C)과의 상호 작용 경로 분석을 수행하는 단계. 가능한 경로를 규명 및 도시 STRING에 의해 상호 작용 또는 네트워크 분석을 수행하는 기능 파트너 단계를 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 대표 데이비드와 STRING 분석 결과. DAVID 분석에 의해 십사 후보의 (A) BP 농축 결과. 세포 사멸 관련 프로세스가 크게 강화된다. (B) CC의 enrichmen DAVID 분석에 의해 십사 후보의 t 결과. 많은 단백질은 세포 내 기원을 가지고있다. DAVID 분석에 의해 십사 후보의 (C) BP 농축 결과. 후보자의 대부분은 결합 단백질에 참여한다. (D) 정상 10는 STRING에 의해 식별 LDHB의 파트너를 상호 작용. (E) LDHB 파트너의 대부분은 상기 엑소 / HIV-1 LDHB의 역할을 지원 엑소 및 HIV-1과 연관된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 중요한 단백질 섭동에 대한 컷오프 값의 대표 계산.
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표 2 : HIV-1 SILAC 후보와 자신의 exosomal 현지화 및 상호 작용 사이의 연관.
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Discussion
이 논문에 기재된 절차에서는 호스트 exosomal 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 조사하기 SILAC 기술의 적용을 설명했다. 처음에 감염되지 않은 및 HIV-1에 감염된 세포는 차동 동위 원소 표지입니다. 차등 표지 엑소 좀은 단백질 추출을 수행하기 전에 정제된다. 다음에, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석은 exosomal 프로테옴을 분석하기 위해 사용된다. 마지막으로, 생성 된 질량 분석 데이터 및 잠재적 후보 단백질 통계적 정보학을 실시 하류 생화학 해부하기 전에 해석한다.
프로토콜에 걸쳐 중요한 단계는 최적의 결과를 달성하기 위해 따라야 할 필요가있다. 프로토콜의 초기 단계에서, SILAC 라벨링은 세포 유형 및 라벨 매체에 의해 영향을받을 수있다. 건강 높은 증식 세포는 높은 표지 효율을 얻기 위해 사용한다. 비판적, 라벨 medium 갓 투석 소 태아 혈청 (FBS)이 아닌 일반 FBS를 사용하여 제조한다. 투석 된 FBS는 아미노산 및 펩티드의 고갈은 SILAC 라벨링 방해하므로 덜하다. 그러나, 투석 혈청 일부 세포주, 특히 일차 전지에 적합하지 않을 수 있다는 것을 유의해야한다. 투석 된 FBS와 배지에서 정상적인 성장이 SILAC 전략을 채택하기 전에 확인한다. 또한, (13 C 6 L- 라이신 (13) C (6) 15 N 4 L 아르기닌) 대신에 단독으로 13 C 6 L 리신을 사용하는 두 "무거운"동위 원소 표지를 사용하여 질량 분석 정량화 펩티드의 수를 증가시킬 수있다 분석. 성공적인 후속 프로테옴 분석에 필요한 세포의 최소 수는, 질량 분석, 각 셀의 질량 및 프로테옴 같은 감도 (전체 프로테옴 또는 번역 후 변형 표적 단백질 많은 요인에 따라). 우리의 연구 결과를 바탕으로, 우리는 질량 분석에 필요한 세포의 적절한 수를 추정 초기 금액으로 천만 세포를 권장합니다.
세포 배양 상청액에서 엑소 분리는 다음과 같은 여과 공정을 추가함으로써 개선 될 수있다. 세포 현탁액의 경우, 10 분 동안 200 × g으로 원심 분리시의 초기 단계는 0.22 μm의 필터 (29), (30)를 통하여 여과 한 다음 상층 액 중에 현탁 세포를 제거하기 위해 수행된다. 부착 된 세포의 상등액을 배양 물로부터 직접 회수 할 수 있고, 동일한 방식으로 여과 하였다. 여과는 작은 분자 및 펩타이드와 같은 오염 물질에서 엑소 좀을 분리하기위한 중요한 공정이다. 엑소 좀이어서 고전 초 원심 분리 방법을 사용하거나, 시판 엑소 분리 시약 키트를 사용하여 상등액으로부터 분리 될 수있다. 엑소 좀의 순도 nanoparti 확인할 수있다CLE 추적 분석 또는 전자 현미경 (31).
HIV-1 비리가 엑소 좀에 크기가 일반적으로 비슷하기 때문에, 그들은 HIV-1에 감염된 샘플에서 정제 엑소 좀을 오염시킬 수 있습니다. 프로테오믹스 화면에서, 잠재적 바이러스 오염은 인간 단백질 데이타베이스의 검색을 제한하여 여과 할 수있다. 이러한 iodixanol 밀도 구배 및 면역 격리와 같은 확립 된 방법을 사용하여 더 분리 기술들은 33 엑소 좀 32 HIV-1 비리 온을 분리 할 수있다.
다음으로, 우리는 MS의 결과를 격리 엑소 좀로부터 획득되면 잠재적으로 중요한 후보를 식별하기 위해 신뢰할 수있는 데이터 분석을 위해 몇 가지 제안에 대해 설명합니다. 분석의 초기 단계에서, SILAC 비 히스토그램은 정규 분포를 따르는 것이다. 데이터 분포가 특정 방향으로 왜곡되면, 독자는 일을 결정해야전자 분석을 진행하기 전에 발생합니다. 예를 들어, 레이블과 레이블이없는 샘플을 같은 비율로 혼합되지 않았을 수 있습니다. 또한, 일부 펩타이드는 무거운 / 라이트 SILAC 비율 값이 없을 수도 있고, 잠재적 인 단백질의 후보로부터 제거되어야한다. 후보가 선택되면, 소프트웨어 및 데이터베이스는 시험 조건, 가능한 경로와 엑소 농축, 상호 작용을 확인하기 위해 사용될 수있다. 후보 단백질과 시험 조건 사이의 상호 작용은 생물 정보학 분석하기 전에 특정 데이터베이스를 통해 채굴해야합니다. 생물 정보학 특성화를 들어, 유전자 온톨로지 주석 다양한 소프트웨어 및 데이터베이스를 사용하여 식별 할 수있다,
여기에 사용 된 SILAC 기술은 호스트 exosomal 프로테옴 분석에 대한 체계적이고 간단한 방법을 제공합니다. 대부분의 생물 의학 연구소는 최소한의 추가 장비 및 추가 비용과 절차를 채택 할 수있을 것이다. SILAC 기술은, 그러나, 주로 해제되고세포주를 사용하여 연구에 서명했다. 이와 같이, 다른 방법들은 상이한 생물학적 시료를 연구하는데 이용 될 필요가있다. 예를 들어, 라벨없는 MRM (다중 반응 모니터링) 방법은 임상 샘플 9, 34 단백질 및 펩티드의 표적 정량에 사용될 수있다. 여러 연구에서 단백질 함량을 결정하는 경우 동안 SILAC 기술은 또한 2 개 이상의 샘플을 조사하는데 사용될 수있다. 화학 표시 방법 iTRAQ 방법이 훨씬 더 높은 다중화를 허용하고 여러 샘플에 대한 더 적합한 것 또는 TMT 기반 (탠덤 질량 태그) (상대 및 절대 정량 동중 태그).
여기에 설명 된 절차는 HIV-1 감염 세포에서 엑소 좀의 프로테옴 특성에 한정되지 않는다. 변형으로, 이러한 세균 감염, 바이러스 감염 및 RAD 같은 시험 및 응력 광범위한 조건 하에서 엑소 좀을 분석하도록 구성 될 수있다iation. 또한 다른 세포 내 구획을 연구하는데 적합하다.
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Acknowledgments
이 작품은 BR의 수명 / 술 / 브라운 CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 및 K24HD080539에 ARRA 보충에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 수명 파일럿 연구 기금 (# 701 5857),로드 아일랜드 재단 의학 연구 그랜트 (# 20133969)와 ML에 NIH 코 브레 URI / RIH 파일럿 연구 그랜트 (P20GM104317)에 의해 지원되었다. 우리는 원고와 그림 준비에 도움 제임스 오스트레일리아 산 아카시아와 VY 젠장 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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