De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.
Het is goed aanvaard dat ruggenmerg gliale respons aanzienlijk bijdragen tot de ontwikkeling van neuropathische pijn. Enorme informatie betreffende gliale activiteiten op cellulair en moleculair niveau is verkregen door middel van in vitro celkweek systemen. De in vitro-systemen gebruikt, die voornamelijk bestaan uit primaire glia afgeleid van neonatale hersenen corticale weefsel en onsterfelijk cellijnen. Echter kunnen deze systemen niet de kenmerken van ruggenmerg gliale cellen in vivo. Om de rol van ruggenmerg gliacellen in de ontwikkeling van perifere zenuw-verwonding geïnduceerde neuropathische pijn verder te onderzoeken met behulp van een kweeksysteem dat beter de in vivo toestand, heeft ons laboratorium een methode primaire ruggenmerg gemengde gliale culturen van ontwikkelde volwassen muizen. In het kort worden ruggenmerg van volwassen muizen verzameld en verwerkt door middel van papaïne digestie gevolgd door myeline verwijderen met een holenity-gradiënt medium. Enkele cel suspensies worden gekweekt in compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (cDMEM) aangevuld met 2-mercaptoethanol (2-ME) en 35,9 oC Deze kweekomstandigheden werden specifiek geoptimaliseerd voor de groei van gemengde gliale cellen. Onder deze omstandigheden zijn de cellen klaar voor gebruik voor experimenten tussen 12 – 14 d (cellen meestal logfase gedurende deze tijd) na de oprichting van de kweek (D 0) en kunnen in kweekcondities gehouden tot D 21. het kweeksysteem kan worden gebruikt om de reacties van ruggenmerg gliacellen na stimulatie met diverse stoffen en agentia te onderzoeken. Naast neuropathische pijn, kan dit systeem worden gebruikt om gliale reacties in andere ziekten die pathologische veranderingen op spinale gliacellen omvatten bestuderen.
Chronische pijn is een ernstig gezondheidsprobleem dat ongeveer 100 miljoen volwassenen in de Verenigde Staten beïnvloedt, met een geschatte jaarlijkse kosten van maximaal $ 635.000.000.000 1. Groeiend bewijs heeft een belangrijke bijdrage op spinale gliacellen in de ontwikkeling van neuropathische pijn, een van de meest verwoestende vormen van chronische pijn 2 aangegeven. Een goede in vitro kweeksysteem aanzienlijk zou helpen hun onderzoek naar de rol van gliacellen op cellulair en moleculair niveau.
Momenteel is de in vitro gliale kweeksystemen gebruikt door onderzoekers behoren hoofdzakelijk gliale cellen afkomstig van corticale weefsels van neonatale muis of rat hersenen en gliale geïmmortaliseerde cellijnen afgeleid van neonatale muis of rat primaire gliale cellen. Neonatale cellen bevatten grote aantallen van ongedifferentieerde cellen die verder kunnen worden onderverdeeld in gliacellen (voornamelijk astrocyten en microglia), waardoor eenbundant cellen voor experimentele gebruik 3. Echter, onze vorige studie aangetoond dat neonatale hersenen gliacellen significant anders reageren van volwassen ruggenmerg gliacellen van lipopolysaccharide (LPS) stimulatie. Bijvoorbeeld interleukine (IL) -4 weergegeven versterkte remmende effecten op LPS-geïnduceerde stikstofoxide (NO) in volwassen rat ruggenmerg glia vergeleken hersenschade glia 4. De profielen van chemokine productie na stimulatie door een neuropeptide, calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP), zijn ontegenzeggelijk verschillend tussen neonatale muizenhersenen glia (werkwijzen beschreven Ref. 5) en volwassen muis ruggenmerg glia (figuur 1). Permanente cellijnen zijn gemakkelijk te gebruiken en te onderhouden en kan een groot aantal cellen in een korte tijdsperiode. In het algemeen geïmmortaliseerde cellijnen worden gegenereerd ofwel met een virus gemedieerde immortalisatie systeem (zoals de veel gebruikte microgliale cellijn BV2) 6, 7 of na the identificatie van spontane transformatie (zoals astrocyten cellijn C8-D1A en microgliale cellijn C8-B4) 8, 9 Cellijnen zijn uitstekend in het bestuderen van de moleculaire eigenschappen van astrocyten en microglia afzonderlijk.; Echter, de resultaten van cellijnen resultaten vereisen altijd verdere validatie in primaire cellen of in vivo omstandigheden. Ook moet worden opgemerkt dat er geen melding van een gliale cellijn die is afgeleid van een knaagdier ruggenmerg glia geweest.
Om te onderzoeken de rol van ruggenmerg gliale cellen bij de ontwikkeling van neuropathische pijn, een teeltsysteem dat is afgeleid van de volwassen muis ruggenmerg is ontwikkeld door aanpassing van een eerder gerapporteerde methode gebruikt om volwassen rat gemengde gliale culturen 4 genereren 5 . De muis ruggenmerg gliale cultuur werd verder verfijnd onlangs 10 en is in meer detail beschreven in dit artikel. Volwassen ruggenmerg gemengd glialculturen ceen stand worden gebracht met een muis van geselecteerde stammen die passen bij de behoeften van de specifieke studie, en cellen kunnen in kweek worden gehandhaafd tot 21 d initiatie van de kweek te plaatsen. Deze methode kan worden gebruikt in studies neuropathische pijn, evenals bij onderzoeken van verschillende neurologische ziekten die pathologische veranderingen in het ruggenmerg, zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS), humaan immunodeficiëntie virus (HIV) geassocieerde sensorische neuropathie en multiple betrekken sclerose (MS).
Het is cruciaal om alle stappen-met inbegrip van de media veranderen schema-op een consistente manier om reproduceerbare resultaten tussen de experimenten te verkrijgen uit te voeren. De volgende stappen zijn bijzonder kritisch bij het verkrijgen van een uitstekende kwaliteit voor volwassenen gemengde glia.
De enzymatische afbraak is een belangrijk aspect van dit protocol. Het is cruciaal dat het weefsel stukken zijn goed verteerd om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Echter, over-…
The authors have nothing to disclose.
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |