Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Abstract

Het is goed aanvaard dat ruggenmerg gliale respons aanzienlijk bijdragen tot de ontwikkeling van neuropathische pijn. Enorme informatie betreffende gliale activiteiten op cellulair en moleculair niveau is verkregen door middel van in vitro celkweek systemen. De in vitro-systemen gebruikt, die voornamelijk bestaan uit primaire glia afgeleid van neonatale hersenen corticale weefsel en onsterfelijk cellijnen. Echter kunnen deze systemen niet de kenmerken van ruggenmerg gliale cellen in vivo. Om de rol van ruggenmerg gliacellen in de ontwikkeling van perifere zenuw-verwonding geïnduceerde neuropathische pijn verder te onderzoeken met behulp van een kweeksysteem dat beter de in vivo toestand, heeft ons laboratorium een methode primaire ruggenmerg gemengde gliale culturen van ontwikkelde volwassen muizen. In het kort worden ruggenmerg van volwassen muizen verzameld en verwerkt door middel van papaïne digestie gevolgd door myeline verwijderen met een holenity-gradiënt medium. Enkele cel suspensies worden gekweekt in compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (cDMEM) aangevuld met 2-mercaptoethanol (2-ME) en 35,9 oC Deze kweekomstandigheden werden specifiek geoptimaliseerd voor de groei van gemengde gliale cellen. Onder deze omstandigheden zijn de cellen klaar voor gebruik voor experimenten tussen 12 - 14 d (cellen meestal logfase gedurende deze tijd) na de oprichting van de kweek (D 0) en kunnen in kweekcondities gehouden tot D 21. het kweeksysteem kan worden gebruikt om de reacties van ruggenmerg gliacellen na stimulatie met diverse stoffen en agentia te onderzoeken. Naast neuropathische pijn, kan dit systeem worden gebruikt om gliale reacties in andere ziekten die pathologische veranderingen op spinale gliacellen omvatten bestuderen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chronische pijn is een ernstig gezondheidsprobleem dat ongeveer 100 miljoen volwassenen in de Verenigde Staten beïnvloedt, met een geschatte jaarlijkse kosten van maximaal $ 635.000.000.000 1. Groeiend bewijs heeft een belangrijke bijdrage op spinale gliacellen in de ontwikkeling van neuropathische pijn, een van de meest verwoestende vormen van chronische pijn 2 aangegeven. Een goede in vitro kweeksysteem aanzienlijk zou helpen hun onderzoek naar de rol van gliacellen op cellulair en moleculair niveau.

Momenteel is de in vitro gliale kweeksystemen gebruikt door onderzoekers behoren hoofdzakelijk gliale cellen afkomstig van corticale weefsels van neonatale muis of rat hersenen en gliale geïmmortaliseerde cellijnen afgeleid van neonatale muis of rat primaire gliale cellen. Neonatale cellen bevatten grote aantallen van ongedifferentieerde cellen die verder kunnen worden onderverdeeld in gliacellen (voornamelijk astrocyten en microglia), waardoor eenbundant cellen voor experimentele gebruik 3. Echter, onze vorige studie aangetoond dat neonatale hersenen gliacellen significant anders reageren van volwassen ruggenmerg gliacellen van lipopolysaccharide (LPS) stimulatie. Bijvoorbeeld interleukine (IL) -4 weergegeven versterkte remmende effecten op LPS-geïnduceerde stikstofoxide (NO) in volwassen rat ruggenmerg glia vergeleken hersenschade glia 4. De profielen van chemokine productie na stimulatie door een neuropeptide, calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP), zijn ontegenzeggelijk verschillend tussen neonatale muizenhersenen glia (werkwijzen beschreven Ref. 5) en volwassen muis ruggenmerg glia (figuur 1). Permanente cellijnen zijn gemakkelijk te gebruiken en te onderhouden en kan een groot aantal cellen in een korte tijdsperiode. In het algemeen geïmmortaliseerde cellijnen worden gegenereerd ofwel met een virus gemedieerde immortalisatie systeem (zoals de veel gebruikte microgliale cellijn BV2) 6, 7 of na the identificatie van spontane transformatie (zoals astrocyten cellijn C8-D1A en microgliale cellijn C8-B4) 8, 9 Cellijnen zijn uitstekend in het bestuderen van de moleculaire eigenschappen van astrocyten en microglia afzonderlijk.; Echter, de resultaten van cellijnen resultaten vereisen altijd verdere validatie in primaire cellen of in vivo omstandigheden. Ook moet worden opgemerkt dat er geen melding van een gliale cellijn die is afgeleid van een knaagdier ruggenmerg glia geweest.

Om te onderzoeken de rol van ruggenmerg gliale cellen bij de ontwikkeling van neuropathische pijn, een teeltsysteem dat is afgeleid van de volwassen muis ruggenmerg is ontwikkeld door aanpassing van een eerder gerapporteerde methode gebruikt om volwassen rat gemengde gliale culturen 4 genereren 5 . De muis ruggenmerg gliale cultuur werd verder verfijnd onlangs 10 en is in meer detail beschreven in dit artikel. Volwassen ruggenmerg gemengd glialculturen ceen stand worden gebracht met een muis van geselecteerde stammen die passen bij de behoeften van de specifieke studie, en cellen kunnen in kweek worden gehandhaafd tot 21 d initiatie van de kweek te plaatsen. Deze methode kan worden gebruikt in studies neuropathische pijn, evenals bij onderzoeken van verschillende neurologische ziekten die pathologische veranderingen in het ruggenmerg, zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS), humaan immunodeficiëntie virus (HIV) geassocieerde sensorische neuropathie en multiple betrekken sclerose (MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het volgende protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van New England. Het volgende protocol is voor het bereiden van glialculturen van 4 volwassen muis ruggenmerg.

1. Voorbereiding van de Solutions in een cultuur van de Kap onder aseptische omstandigheden

  1. Bereid kweekmedia: compleet Dulbecco's modificatie van Eagle's medium (cDMEM) DMEM (met 4,5 g / l glucose), 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine , 250 ng / mL Amfotericine B, en 50 uM 2-mercaptoethanol (2-ME, zie 1.1.1). Mix en filter steriliseren alle andere componenten en voeg vervolgens FBS. Bewaar het kweekmedium bij 4 o C.
    1. Bereid 50 mM 2-ME / fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voorraadoplossing: voeg 100 gl geconcentreerde 2-ME (14,3 M) in 28,6 ml 1x PBS en filter steriliseren (de oplossing is worden opgeslagen bij 4 ° C aantal maanden). Use 1 ml 2-ME voorraad oplossing voor elke 1.000 ml van de cultuur media.
  2. Bereiding van de dichtheidsgradiënt media
    1. Bereid een voorraad isotone dichtheidsgradiënt media-oplossing (bijvoorbeeld 100% Percoll) vanaf 1 deel 10x reguliere steriele PBS en 9 delen steriele voorraad dichtheidsgradiënt media (bijvoorbeeld Percoll).
    2. Verdun de 100% dichtheidsgradiënt media (in 1.2.1) met regelmatige 1x steriele PBS tot een 20% dichtheidsgradiënt media (bijvoorbeeld 10 ml 100% dichtheidsgradiënt media met 40 ml 1x PBS) te maken en het op 4 o C. Breng de 20% dichtheidsgradiënt media op kamertemperatuur (KT) alvorens haar celkweek.
  3. Bereiding van oplossingen van het papaïne dissociatie systeem
    LET OP: De papaïne dissociatie systeem kan worden geïdentificeerd in het Materials tabel. Andere soortgelijke dissociatie kits (inclusief de aanwezigen in-house) kan ook worden gebruikt. alle componenten;NTS moeten steriel zijn.
    1. Voeg 32 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) aan de ovomucoïde remmermengsel (poeder).
    2. Voeg 5 ml EBSS om een ​​papaïne flacon (poeder). Plaats de papaïne flacon in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten of totdat de papaïne opgelost.
    3. Voeg 500 ul van EBSS een DNase flacon (poeder). Meng voorzichtig.
    4. Voeg 250 ul van de oplossing DNase (hierboven) om de papaïne flacon.
    5. Bereken de totale hoeveelheid van de hierboven papaïne / DNase mengsel nodig (ongeveer 800 pl papaïne / DNase mengsel per muis ruggenmerg) en de benodigde mengsel over in een 50 ml buis weefsel digestie (stap 3,2). Bewaar de overgebleven in de oorspronkelijke flesje bij 4 ° C gedurende ten minste twee weken.
    6. Houd alle onderdelen van de kits op ijs totdat het nodig is.
  4. Bereid ruggenmerg verzamelbuizen: een steriele 15 ml buis met 5 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS, van het papaïne dissociatie systeem,0, voor het verzamelen van het ruggenmerg) en een steriele 15 ml buis met 1x PBS (voor het opvullen van de 5 ml spuit, zie stap 2.4). Bovendien, bereiden een steriele petrischaal (35 mm of 60 mm) met 5 ml HBSS en bewaar het in de cultuur kap.

2. Spinal Cord Collection

OPMERKING: Alle apparatuur moet steriel zijn. Voer de collectie in een aangewezen gebied door de IACUC goedgekeurd.

  1. Vraag de volgende instrumenten voor het oogsten van de muis ruggenmerg: straight scherpe / stompe 18-cm chirurgische schaar, een 12-cm standaard scalpel (# 3 vast), carbon staal steriel scalpel mesjes # 10, een klein dier Decapitator, 12-cm standaard gebogen tang, en een steriele 20G naald bevestigd aan een 5-mL spuit.
  2. Euthanaseren het dier met CO 2 en desinfecteren muis kop en het achtergebied met 70% ethanol (EtOH).
  3. Onthoofden dier met de Decapitator. Maak een middelste longitudinale incisie op de onderrug naar de spierlaag bloot te leggen. Makeneen schone doorsnijding door de gewervelde kolom op heuphoogte (ook snijden door de spierlaag dat de gewervelde kolom covers) met de steriele rechte chirurgische schaar (18 cm).
  4. Leg het dier op een vel van verse wegwerp vegen. Steek de 20 G naald (bevestigd aan een 5 ml injectiespuit gevuld met steriele 1x PBS (stap 1.4)) in de wervelkolom in de richting van de rostrale kant voorzichtig. Houd het dier af te strak en snel druk op de spuit. De hele ruggenmerg moeten komen uit de cervicale einde. Verzamel het ruggenmerg in de ml buis 15 met HBSS.
  5. Herhaal stap 2.4 voor de rest van de muizen. Tussen elk dier, desinfecteer alle gebruikte instrumenten met 70% EtOH.
    LET OP: Meestal kan een enkele 12-well plaat worden vastgesteld voor elke 4 muis ruggenmerg (zie 4.3).

3. Voorbereiding van de Single Cell Suspension

Opmerking: Voer stap 3 en 4 in een cultuur kap om alles steriel te houden.

  1. Breng alle ruggenmerg in de HBSS-bevattende petrischaal (stap 1.4). Snijd elk van de ruggenmerg in de vele mooie, kleine stukjes met een steriele schaar en pincet. Breng het ruggenmerg weefsel om de 50 ml conische buis met de bereide papaïne / DNase enzymmengsel (stap 1.3.5) met steriele pincet of een 10 ml pipet (niet te verhogen HBSS het enzymmengsel, zoals verder zal verdunnen de voorbereide enzymoplossing en kan leiden tot verminderde prestaties van het enzym).
  2. Vortex de buis voorzichtig om te mengen. Incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator / schudinrichting met orbitaal schudden bij 150 rpm.
  3. Vortex de buis steeds krachtig vermaal de enzymoplossing met het weefsel met een 5 ml pipet verder dissociatie bevorderen.
  4. Breng de celsuspensie in een 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Tijdens centrifugeren, meng 2,7 ml EBSS met 300 pi van gereconstitueerd albumine-ovomucoïd inhibitor oplossing (1.3.1) in een steriele buis. Voeg 150 ul van de oplossing DNase (stap 1.3.3).
  6. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet met de oplossing boven bereide (stap 3.5). Vortex goed aan de celpellet breken.
  7. Voeg 3 mL gereconstitueerd albumine-ovomucoïd remmeroplossing (stap 1.4.1) aan de celsuspensie. Centrifugeer cellen bij 70 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant (dat membraanfragmenten bevat).

4. Verdere Verwijdering van myeline van Single Cell Suspension

  1. Voeg 8 ml 20% dichtheidsgradiënt media (bereid in stap 1.2.2) in de buis met het celpellet, wervel voorzichtig om de pellet te verstoren, en centrifugeer de cellen bij 800 g gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder remmen. Verwijder voorzichtig de bovenste laag van puin (meestal myeline) en de bovenstaande, maar houd de korrel.
  2. Om resten van de dichtheidsgradiënt te verwijderen, was de cellen door resuspending de celpellet met 8 ml van een verdunde cDMEM (1 deel cDMEM en 2 delen HBSS). Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 10 min bij 4 ° C Verwijder de supernatant en was de cellen opnieuw met de verdunde cDMEM (boven) op dezelfde wijze. Houd de cellen op ijs tot hen zaaien.
  3. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in kweekmedium (cDMEM geleverd met 2-ME (bereid in stap 1.1)). Voor een 12-well plaat gebruikt 3 ml x 4 (aantal gebruikte muizen) + 2 ml = 14 ml media. Dit zorgt ervoor dat er voldoende celsuspensie voor de gehele plaat (12 wells) en voorziet in extra putten die kunnen worden gebruikt om het gemiddelde aantal cellen per putje en microgliale inhoud van de kweek te bepalen. Als andere vormen van cultuur schepen zullen worden gebruikt, berekent het totale volume van de benodigde voedingsbodems proportioneel.
  4. Voeg 1 ml van de celsuspensie in elk putje van een 12-wells plaat.
  5. Incubeer de cellen bij 35,9 ° C met 5% CO2.
  6. OPMERKING: Op dag 1, de kweek kunnen significante hoeveelheden afval door het residu myeline van het ruggenmerg weefsel bevatten; dus, het veranderen van de media op dag 1 wordt aanbevolen (zie de discussie voor meer informatie). Culturen zijn klaar voor behandeling van D 12 - 14. Cellen meestal 80% confluent bij D 12 en kan bijna 100% confluent bij D 14. Doorgaans op D 12, zijn er ongeveer 100.000 cellen per putje in een 12-well plaat .

figuur 4
Figuur 2:. Vertegenwoordiger beelden van gemengde gliacellen op verschillende tijdstippen na de oprichting van de gemengde glia cultuur Primaire ruggenmerg gemengde glia werden bereid uit volwassen C57BL / 6 muizen. representatieve beeldende voortgang van de gliale cultuur na plating. Op dag 1 worden sommige cellen aan de kweekplaat, maar ze zijn nog grotendeels round. Er zijn ook vele drijvende cellen en significant vuil. Op dag 4, de meerderheid van de cellen aan de kweekplaat. Cellen blijken vertakt met zichtbare processen. Cellen worden verdeeld en sporadisch culturen ongeveer 20-30% confluent op dit moment. Op dag 8, culturen zijn tussen de 50-60% confluent. Sommige delen van de culturen grote flarden van cellen. Andere gebieden van de culturen hebben schaarse groei van cellen. Sommige cellen binnen de patches te nemen op een "vierkant-achtig 'uiterlijk. Op dag 12, culturen zijn op of boven 80% confluent (ongeveer 90% confluent in de hier getoonde afbeelding). Cel in de log-fase van de groei op dit moment en tussen dagen 12-14 is de optimale tijd voor het gebruik van de gliacellen voor experimenten. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

  1. Onderzoek de microgliale inhoud waarbij cellen van de extra putjes (stap 4,3) via standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kleuringsprotocol 11 met de combinatie van anti-muizen-CD45 en anti-CD 11 b muizen monoklonale antilichamen. CD45 + CD11b + cellen worden geïdentificeerd als microglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze methode kan worden gebruikt om gemengde gliale cellen te bereiden uit zowel muizen als ratten. De gemiddelde totale aantal cellen per putje in een 12-well plaat op D 12 na initiatie van de kweek moet betrekkelijk stabiel zijn, ongeveer 100.000 cellen per putje wanneer cellen afkomstig uit muizen ruggenmerg. Gliale cellen verkregen uit deze werkwijze kan worden gebruikt in experimenten die zijn ontworpen om volwassen ruggenmerg gliale responsen na toediening van stoffen en agentia van belang. Figuur 3 geeft een voorbeeld van cytokine en chemokine antwoorden van een kenmerkend experiment waarin volwassen ruggenmerg microglia werden verkregen van volwassen BALB / c muizen werden behandeld met LPS (Salmonella Minnesota Re595) op D 13 na initiatie van de kweek. Supernatanten werden verzameld 24 uur na LPS-behandeling voor de bepaling van cytokine en chemokine niveaus via een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) onder gebruikmaking van commercieel available kits.

Wanneer deze gliale kweeksysteem volwassene voor het eerst werd opgericht, werden de cellen geïncubeerd in een standaard cultuur-omgeving bij 37 o C. Onder deze voorwaarde, de gemiddelde microgliale gehalte varieerde 5-10%. Er werd echter opgemerkt dat ondanks het gebruik van consistente kweektechnieken, culturen zou in sommige gevallen hebben of zeer lage microgliale gehalte (<2%) of betrekkelijk hoog microgliale gehalte (15-20%) 10. Het kan frustrerend zijn om te kweken dat heel weinig microglia hebben wanneer de experimentele resultaten rekenen op de microglia responsen binnen de gemengde cultuur te verkrijgen. Naar aanleiding van de suggestie van Dr. Alejandro MS Mayer (Department of Pharmacology, Chicago College of holistische geneeskunde) 12, werd de methode gewijzigd door het kweken van de gemengde gliacellen bij 35,9 o C. Dit resulteerde in een consistenter en microgliale hogere opbrengst (variërend tussen 10-40% en de resterende meestal around 20%) in de meeste culturen. Deze verbetering wordt getoond in figuur 4 Zoals eerder gemeld, zijn microglia schattingen maakten 5 -. 21% van de CNS glia bevolking in volwassen muizen 13-15. Hoewel beide kweekomstandigheden verschaffen culturen die gelijke hoeveelheden microglia bevatten zoals geschat vivo, de gemodificeerde kweekomstandigheid (35,9 ° C) is geschikt voor experimenten waarin is het essentieel om de reacties van zowel astrocyten en microglia onderzoeken.

Figuur 1
Figuur 1:. Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) geïnduceerde chemokine productie van gemengde gliale cellen gemengde gliale cellen bereid uit neonatale BALB / c muizenhersenen (links) of volwassen BALB / c-muis ruggenmerg (rechts) werden behandeld met verschillende doses van CGRP. Niveaus van verschillende chemokines in kweeksupernatanten werden bepaald via multiplex assay (uitgevoerd door de fabrikant) op optimale tijden (gemiddelde ± SEM, n = 2-6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 3: cytokine en chemokine Reacties van Mouse volwassen ruggenmerg Mixed Glia na LPS stimulatie volwassen ruggenmerg gemengde gliale cellen werden bereid uit BALB / c muizen en gestimuleerd met verschillende doses LPS.. Niveaus van IL-6 (A), tumornecrosefactor (TNF) -alfa (B), interferon-gamma-induceerbare proteïne 10 (IP-10, ook bekend als CXCL10) (C) en monocyt chemoattractant proteïne 1 (MCP 1, ook bekend als CCL2) (D) in kweeksupernatanten werden bepaald via ELISA op 24 uur na LPS-behandeling.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 4:. Microgliale inhoud bij volwassen gemengde gliale culturen gemengde gliale cellen werden gegenereerd uit volwassen C57B6 / L muizen en gekweekt bij ofwel 37 ° C of 35,9 o C. Microgliale inhoud van elke kweek werd geanalyseerd via stroomcytometrie middels APC-anti-muizen-CD45 (kloon 30-F11) en FITC-anti-muis CD11b (kloon M1 / ​​70). Representatieve plots van de flowcytometrische analyses worden getoond. De totale celpopulaties van de kweken werden in percelen A (37 ° C) en C (35,9 ° C), en de microglia populaties (CD45 + CD11b + cellen) werden verder geïsoleerd uit de respectieve totale celpopulaties in B (37o C) en D (35,9 ° C). Flowcytometrische analyse werd uitgevoerd, en alle gegevens werden geanalyseerd zoals eerder beschreven 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het is cruciaal om alle stappen-met inbegrip van de media veranderen schema-op een consistente manier om reproduceerbare resultaten tussen de experimenten te verkrijgen uit te voeren. De volgende stappen zijn bijzonder kritisch bij het verkrijgen van een uitstekende kwaliteit voor volwassenen gemengde glia.

De enzymatische afbraak is een belangrijk aspect van dit protocol. Het is cruciaal dat het weefsel stukken zijn goed verteerd om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. Echter, over-de spijsvertering leiden tot aanzienlijk minder cellen. Elk lab moet piloot tests uit te voeren om de exacte spijsvertering tijd op basis van de aard van de flesjes gebruikt voor incubatie te bepalen, de gemiddelde hoeveelheid weefsel gebruikt elke keer, en de aard van de shaker (roterende versus rondschudapparaat). Bovendien, ongeacht het papaïne dissociatie systeem gekozen, is het essentieel om consequent dezelfde onderdelen van dezelfde bronnen als de occasionele vervanging van onderdelen kan leiden tot aanzienlijke verschillen in de opbrengstvan het totale aantal cellen.

In dit protocol wordt het myeline verwijderd met een dichtheidsgradiënt medium. Is het essentieel om gebruik te maken dichtheidsgradiënt oplossing bij kamertemperatuur, aangezien de dichtheid van deze oplossingen zijn temperatuurgevoelig. Dichtheidsgradiënt oplossingen worden gewoonlijk bewaard bij 4 oC Indien nodig kan de dichtheidsgradiënt oplossing bij kamertemperatuur gehouden gedurende de nacht vóór de dag van opzetten van de cultuur. Bovendien, na 30 min centrifugeren van cellen in het 20% dichtheidsgradiënt, cellen worden onmiddellijk uit de centrifuge verwijderd te voorkomen dat grote brokstukken verschuiven (bijv stappen van de bovenkant van de oplossing, zie stap 4,1).

Het is belangrijk om vuil te verwijderen op D 1 na initiatie van de kweek. Hoewel cellen zullen overleven en vermenigvuldigen als het kweekmedium wordt veranderd om de 3-4 d, het veranderen van media op D 1 zal een meer "rustig" en "cleaner" cultuur later op te bieden. Dezelaat cellen groeien in een minder verstoorde omgeving en cellen tot 21 d na de initiatie van de kweek gehouden.

Microgliale inhoud voor elk experiment kunnen vóór gebruik van het gemengde glia onderzocht. Zelfs met de meest consistente techniek kan microgliale inhoud nog steeds aanzienlijk verschillen tussen experimenten. Sommige cellulaire effecten zijn afhankelijk microgliale inhoud 4, 10; dus, is het cruciaal om de microglia inhoud van elke set van gevestigde culturen te controleren. Gegevens verkregen uit deze praktijk kan helpen om verschillen tussen experimenten te interpreteren, en om nieuwe verschaffen (soms onverwachte) kennis over de bijdrage van astrocyten versus microglia onder een bepaalde experimentele conditie. Bovendien hebben seizoenschommelingen microgliale inhoud waargenomen. Dit kan een extra factor om te overwegen bij de planning van grote sets van experimenten. Bovendien, terwijl de neuronen meestal niet overleven onder onze cultuur staat,als NeuN (a neuronal- marker) -positieve cellen niet direct in glialculturen waargenomen na immunohistochemische kleuring kan het kweekmedium beperkt aantal oligodendrocyten bevatten (dit niet routinematig gekwantificeerd). Men moet beslissen of deze populatie onderzocht moet worden afhankelijk van de specifieke experimentele omstandigheden.

Zoals met vele experimentele methoden, kan deze werkwijze worden aangepast aan de behoeften van individuele onderzoekers. Het is essentieel pilot experimenten met de specifieke modificaties vóór gebruik ervan routinematig volledig te testen. Voorts zij opgemerkt dat de gemengde glia kan worden gebruikt om microglia verarmd en microglia verrijkte kweken te verkrijgen de behandeling door astrocyt-dominante versus microglia-dominante cellen na specifieke stimulatie bestuderen, zoals eerder beschreven voor neonatale gemengde gliale cellen 3, 4. de opbrengst van microglia-cellen verrijkte beperkt tenzij grote aantallen spinalekoorden worden gebruikt om de kweek te vestigen in het begin. Dit is een beperking van deze methode, vooral als muizen worden gebruikt. Bij ratten ruggenmerg worden gebruikt, kan een individu ruggenmerg (in plaats van 4 muis ruggenmerg) worden gebruikt voor het opzetten een 12-wells plaat. Tot slot doet de microglia inhoud niet significant verschillend tussen muizen en ratten volwassen ruggenmerg glialculturen 4, 5 Beide muizen en ratten volwassen ruggenmerg glialculturen een robuuste reactie op LPS stimulatie op het gebied van cytokine productie te produceren zijn.; kan echter differentiële reacties worden waargenomen wanneer alternatieve stimuli worden gebruikt.

Al met al is dit gliale kweeksysteem volwassen knaagdier biedt een alternatieve methode voor gliale cellen te bestuderen in vitro. De resultaten van deze cultuur systeem beter weergeven wat onder in vivo omstandigheden zouden worden nageleefd vergeleken met de resultaten verkregen uit neonatale culturen of cellijnen. In de huidige werkwijze, gliale cellen collected van volwassen knaagdieren, zoals volwassen glia reageren zeer verschillend stimuli vergelijking met neonatale glia 4 (Figuur 1). De cellen niet significant gemanipuleerd door immortalisatie procedures die worden gebruikt voor het genereren en cellijnen handhaven. Hoewel deze methode werd aanvankelijk ontwikkeld voor gebruik in neuropathische pijn studies kan worden gebruikt om andere neurologische ziekten die pathologische veranderingen in het ruggenmerg, zoals ALS en MS vereist studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter