Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

Utviklingen av nevropatisk smerte innebærer patologiske forandringer av ryggmargs gliaceller. En pålitelig glial kultursystem avledet fra voksen ryggmarg vev og utformet for å studere disse cellene in vitro mangler. Derfor viser vi her hvordan etablere primær blandede gliaceller kulturer fra voksen mus ryggmarg vev.

Abstract

Det har blitt godt akseptert at ryggmargs gliaceller responser bidra vesentlig til utviklingen av nevropatisk smerte. Enorm informasjon om gliaceller aktiviteter på de cellulære og molekylære nivå er oppnådd gjennom in vitro cellekultursystemer. In vitro-systemer benyttes, omfatter hovedsakelig primær gliaceller avledet fra neonatal hjerne kortikal vev og foreviget cellelinjer. Imidlertid kan disse systemene ikke reflekterer egenskapene til ryggmargen gliacellene in vivo. For ytterligere å undersøke rollene til ryggmargen gliaceller i utviklingen av perifer nerveskade-indusert nevropatisk smerte ved hjelp av en kultur system som bedre gjenspeiler in vivo tilstand, har vårt laboratorium utviklet en metode for å etablere primærryggmargs blandede glia kulturer fra voksne mus. Kort fortalt er ryggmargen hentet fra voksne mus og behandlet gjennom papain fordøyelsen etterfulgt av myelin fjerning med hiligheten-gradient medium. Enkeltcellesuspensjoner blir dyrket i fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagle medium (cDMEM) supplert med 2-merkaptoetanol (2-ME) ved 35,9 o C. Disse kulturbetingelser ble optimalisert for vekst av blandede gliaceller. Under disse betingelser, cellene er klar til å brukes for eksperimentering mellom 12 - 14 d (celler er vanligvis i logaritmisk fase i løpet av denne tid) etter etableringen av kulturen (D 0) og kan holdes i kulturbetingelser opp til D-21. denne kulturen systemet kan brukes til å undersøke responsene fra ryggmargen gliaceller ved stimulering med forskjellige substanser og agenter. Dess nevropatisk smerte, kan dette system brukes til å studere glial responser i andre sykdommer som involverer patologiske forandringer av ryggmargs gliaceller.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kronisk smerte er et alvorlig helseproblem som rammer ca 100 millioner voksne i USA, med en estimert årlig kostnad på opp til $ 635 000 000 000 1. Monterings bevis har antydet et betydelig bidrag av ryggmargs gliaceller i utviklingen av nevropatisk smerte, en av de mest ødeleggende typer kronisk smerte 2. En skikkelig in vitro kultur system ville hjelpe betraktelig i ytterligere undersøke rollene gliacellene på cellulære og molekylære nivåer.

For tiden er in vitro gliaceller dyrkingssystemer som brukes av forskere omfatter hovedsakelig gliaceller avledet fra kortikale vev av nyfødte mus eller rottehjerner og udødelig glial cellelinjer avledet fra neonatal mus eller rotte primære gliaceller. Neonatale celler inneholder et betydelig antall udifferensierte celler som kan bli ytterligere differensieres til gliaceller (hovedsakelig astrocytter og mikroglia), for således å tilveiebringe enbundant celler for eksperimentell bruk tre. Imidlertid har vår tidligere studie vist at neonatal hjerne gliacellene svarte signifikant forskjellig fra voksne ryggmargs gliacellene på lipopolysakkarid (LPS) stimulering. For eksempel, interleukin (IL) -4 vises forbedret inhiberende effekt på LPS-indusert nitrogenoksid (NO) produksjon i voksen rotte ryggmarg gliaceller i forhold til neonatale hjerne gliaceller 4. Videre profiler av chemokin-produksjon ved stimulering av et nevropeptid, kalsitonin-relatert peptid (CGRP), er unarguably forskjellig mellom nyfødt musehjerne gliaceller (metoder som er beskrevet i Ref. 5) og voksne mus ryggmarg gliaceller (figur 1). Etablerte cellelinjer er lett å bruke og vedlikeholde, og kan tilveiebringe et stort antall celler i en kort tidsperiode. Generelt, udødeliggjort cellelinjer genereres enten ved hjelp av et virus-mediert immortalisering system (slik som den mest utbredte microglial cellelinje BV2) 6, 7 eller følgende the identifikasjon av spontan transformasjon (for eksempel astrocytt cellelinje C8-D1a og microglial cellelinje C8-B4) 8, 9 cellelinjer er utmerket i å studere de molekylære egenskaper av astrocytter og mikroglia hver for seg.; men de oppnådde resultatene fra cellelinjer krever alltid ytterligere validering i primærceller eller in vivo forhold. Det bør også bemerkes at det ikke har vært en rapport av en glial cellelinje som er avledet fra en gnager ryggmarg gliaceller.

For å bidra til å undersøke rollen til ryggmargs gliaceller i utviklingen av nevropatisk smerte, et kultursystem som er avledet fra den voksne mus ryggmargen er utviklet ved å tilpasse en tidligere rapportert fremgangsmåte som brukes til å generere en voksen rotte blandede glial kulturer 4, 5 . musen ryggmarg glial kulturen ble ytterligere raffinert nylig 10 og er beskrevet i mer detalj i denne artikkelen. Voksen ryggmargs blandet glia kulturer cet etableres med en mus fra utvalgte stammer som passer til behovene til den spesielle undersøkelse, og cellene kan bli opprettholdt i kultur i opp til 21 d legge initiering av kulturen. Denne fremgangsmåten kan anvendes i nevropatisk smerte studier, samt i undersøkelser av forskjellige neurologiske sykdommer som involverer patologiske endringer i ryggmargen, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), humant immunsviktvirus (HIV) -associated sensorisk neuropati og multippel sklerose (MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende protokoll ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Universitetet i New England. Følgende protokoll er for å forberede gliaceller kulturer fra fire voksne mus ryggmargen.

1. Utarbeidelse av løsninger i en kultur Hood under aseptiske forhold

  1. Forbered vekstmedium: komplett Dulbeccos modifikasjon av Eagle medier (cDMEM) som inneholder DMEM (med 4,5 g / l glukose), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin , 250 ng / mL amphotericin B, og 50 uM 2-merkaptoetanol (2-ME, se 1.1.1). Bland og filtrere sterilisere alle andre komponenter og deretter legge FBS. Oppbevar kultur media ved 4 o C.
    1. Fremstille 50 mM 2-ME / fosfat-bufret saltvann (PBS) forrådsløsning: Tilsett 100 ul konsentrert 2-ME (14,3 M) i 28,6 ml 1 x PBS, og filtersteriliser (oppløsningen kan lagres ved 4 ° C for flere måneder). Use 1 ml 2-ME stamløsning for hver 1000 ml av dyrkningsmedier.
  2. Klargjøring av tettshetsgradient media
    1. Forbered en aksje isotonisk tettshetsgradient media løsning (for eksempel 100% Percoll) fra en del 10x vanlig steril PBS og 9 deler sterilt lager tettshetsgradient media (f.eks Percoll).
    2. Fortynn 100% densitetsgradient medium (laget i 1.2.1) med regelmessige 1x steril PBS for å lage en 20% tetthetsgradient medier (f.eks, 10 ml 100% densitetsgradient media med 40 ml av 1 x PBS) og lagre det ved fire o C. Bringe de 20% densitetsgradient media til romtemperatur (RT) før fremstilling av cellekulturen.
  3. Utarbeidelse av løsninger fra papain dissosiasjon system
    MERK: papain dissosiasjon systemet kan identifiseres i Materials tabell. Andre lignende dissosiasjon sett (inkludert de som er montert i huset) kan også benyttes. all components må være sterile.
    1. Legg 32 ml Earles Balanced Salt Solution (EBSS) til den ovomucoid inhibitoren blanding (pulver).
    2. Tilsett 5 ml EBSS til en papain hetteglass (pulver). Plasser papain hetteglasset i et 37 ° C vannbad i 10 min eller inntil den papain er oppløst.
    3. Legg 500 mL av EBSS til en DNase hetteglass (pulver). Bland forsiktig.
    4. Tilsett 250 ul av DNase-oppløsning (ovenfor) til den papain hetteglasset.
    5. Beregn den totale mengde av de ovenfor papain / DNase blanding er nødvendig (ca. 800 mL av papain / DNase blanding pr mus ryggmarg) og overføre den nødvendige blandingen inn i et 50 ml rør for vevsfordøyelse (trinn 3.2). Oppbevar left i det opprinnelige rør til 4 ° C i minst to uker.
    6. Hold alle komponenter fra kits på is inntil nødvendig.
  4. Forbered ryggmargs samling rør: en steril 15 ml tube med 5 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS, fra papain dissosiasjon system,0; for oppsamling av ryggmargen) og en sterilt 15 ml rør med 1 x PBS (for å fylle opp 5 ml sprøyte, se trinn 2.4). I tillegg utarbeide en steril petriskål (35 mm eller 60 mm) med 5 ml HBSS og holde den i kulturen panseret.

2. Spinal Cord Collection

MERK: Alt utstyr må være sterile. Utfør samlingen i et angitt område godkjent av IACUC.

  1. Skaff følgende verktøy for innhøsting mus ryggmargen: rette skarpe / butt 18 cm kirurgisk saks, en 12-cm standard skalpell (# 3 solid), karbonstål sterile skalpellblader # 10, et lite dyr decapitator, 12-cm standard buet tang, og en steril 20G nål festet til en 5 ml sprøyte.
  2. Avlive dyret med CO 2 og desinfisere mus hode og den tilbakebrettede regionen med 70% etanol (EtOH).
  3. Halshogge dyr med decapitator. Lag en midtre langsgående snitt på korsryggen for å utsette muskelen laget. Lageen ren tran gjennom virveldyr kolonnen på hip-nivå (også skjære gjennom muskellaget som dekker virveldyr kolonne) med sterilt rette kirurgiske saks (18 cm).
  4. Plasser dyret på et ark av fersk engangsklut. Sett forsiktig 20 G nål (koblet til en 5 ml sprøyte fylt med sterilt 1x PBS (trinn 1.4)) inn i ryggmargen mot rostral side. Hold dyret ned tett og presse sprøyten raskt. Hele ryggmarg skal komme ut fra livmorhals slutten. Samle ryggmargen inn i 15 ml tube inneholder HBSS.
  5. Gjenta trinn 2,4 for resten av musene. Mellom hvert dyr, desinfisere alle instrumenter med 70% EtOH.
    MERK: Vanligvis kan en enkelt 12-brønns plate etableres for hver 4 mus ryggmargen (se 4.3).

3. Utarbeidelse av Single Cell Suspension

Merk: Utfør trinn 3 og 4 i en kultur hette for å holde alt sterilt.

  1. Overfør alle ryggmargen inn i HBSS holdige petriskål (trinn 1.4). Skjær hver av ryggmargen til mange fine, små biter med steril saks og pinsett. Overfør ryggmargen vev til den 50 ml konisk rør inneholdende den fremstilte papain / DNase enzymblanding (trinn 1.3.5) ved hjelp av sterile pinsetter eller en 10 ml pipette (HBSS unngå å legge til den enzymblanding, da dette vil ytterligere fortynne stilles enzymoppløsning og kan føre til redusert ytelse av enzymet).
  2. Vortex røret forsiktig for å blande. Inkuber røret ved 37 ° C i 1 time i en inkubator / shaker med kretsende rysting ved 150 rpm.
  3. Vortex i røret igjen og kraftig triturer enzymoppløsningen med vevet ved hjelp av en 5 ml pipette for å fremme ytterligere dissosiasjon.
  4. Overfør cellesuspensjonen til en 15-ml rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Under sentrifugering, bland 2,7 ml EBSS med 300 ul av rekonstituert albumin-ovomucoid inhibitor løsning (1.3.1) i et sterilt rør. Tilsett 150 ul av DNase-oppløsningen (trinn 1.3.3).
  6. Etter sentrifugering, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med løsningen fremstilt ovenfor (trinn 3.5). Vortex vel å bryte cellepelleten.
  7. Tilsett 3 ml av rekonstituert albumin-ovomucoid inhibitor oppløsning (trinn 1.4.1) til cellesuspensjonen. Sentrifuger cellene ved 70 xg i 6 min ved RT. Fjern supernatanten (som inneholder membranfragmenter).

4. Videre Fjerning av Myelin fra Single Cell Suspension

  1. Tilsett 8 ml 20% tettshetsgradient medium (fremstilt i trinn 1.2.2) inn i rør inneholdende cellepelleten, vortex forsiktig for å bryte opp pelleten, og sentrifuger cellene ved 800 xg i 30 minutter ved romtemperatur uten bremsing. Fjern forsiktig det øverste laget av avfall (for det meste myelin) og supernatanten, men beholde pellet.
  2. For å fjerne rester av tettshetsgradient den, vaske cellene ved resuspending cellepelleten med 8 ml av en fortynnet cDMEM (1 del cDMEM og 2 deler HBSS). Sentrifuger cellene ved 400 xg i 10 min ved 4 o C. Fjern supernatanten og vask cellene igjen med fortynnet cDMEM (ovenfor) på samme måte. Hold cellene på is inntil seeding dem.
  3. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i kulturmedier (cDMEM forsynt med 2-ME (fremstilt i trinn 1.1)). For en 12-brønns plate, bruke 3 ml x 4 (antall mus brukes) + 2 ml = 14 ml media. Dette vil sikre at det er tilstrekkelig cellesuspensjon for hele platen (12 brønner), og vil sørge for ekstra brønner som kan brukes for å bestemme den gjennomsnittlige celletall per brønn og microglial innhold av kulturen. Dersom andre typer kulturbeholdere vil bli brukt, beregner det totale volumet av nødvendig kulturmedier proporsjonalt.
  4. Tilsett 1 ml av cellesuspensjonen i hver brønn av en 12-brønns plate.
  5. Inkuber cellene ved 35,9 ° C med 5% CO2.
  6. MERK: På dag 1, kan kulturen inneholder betydelige mengder avfall på grunn av residuet myelin fra ryggmargen vev; dermed endre media på dag 1 er anbefalt (se diskusjons for mer informasjon). Kulturer er klar for behandling mellom D 12 - 14. Cells vanligvis er 80% konfluent på D 12 og kan være nær 100% konfluent av D 14. Vanligvis på D 12, er det rundt 100.000 celler per brønn i en 12-brønns plate .

Figur 4
Figur 2:. Representative bilder av blandede gliaceller på forskjellige tidspunkter etter opprettelsen av den blandede kultur glia Primære ryggmargs blandede gliaceller ble fremstilt fra voksne C57Bl / 6-mus. representative bilderviser fremdriften av glial kultur etter plating. På dag 1 blir noen celler festet til kulturplaten, men de er fortsatt stort sett runde. Det er også mange flytende celler og betydelig rusk. På dag 4, er de fleste av cellene er festet til kulturplaten. Celler vises ramified med synlige prosesser. Cellene blir fordelt og sporadisk kulturer er omtrent 20-30% konfluent på dette tidspunktet. På dag 8, kulturer er mellom 50-60% sammenflytende. Noen områder av kulturene har store flekker av celler. Andre områder av kulturene har sparsom vekst av celler. Noen celler i patcher ta på seg en "firkant-aktig" utseende. På dag 12, kulturer er på eller over 80% sammenflytende (ca 90% sammenflytende i bildet vist her). Cell er i loggen vekstfase på denne tiden og mellom dager 12-14 er det optimale tidspunktet for bruk av gliaceller for eksperimenter. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.

  1. Undersøke microglial innholdet ved hjelp av celler fra de ekstra brønner (trinn 4.3) via en standard fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) fargings protokoll 11 ved hjelp av en kombinasjon av anti-mus-CD45 og anti-mus CD11b monoklonale antistoffer. CD45 + CD11b + celler er identifisert som mikroglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne fremgangsmåte kan anvendes for å fremstille blandede gliaceller fra både mus og rotter. Den gjennomsnittlige totale celleantall per brønn i en 12-brønn plate på D 12 etter initiering av kulturen skal være forholdsvis stabile, med rundt 100.000 celler per brønn når cellene er avledet fra mus ryggmargen. Gliaceller hentet fra denne metoden kan brukes i eksperimenter som er utviklet for å undersøke voksen ryggmargs gliaceller reaksjoner ved administrering av stoffer og stoffer av interesse. Figur 3 gir et eksempel på cytokin og chemokin svar fra en typisk eksperiment hvor voksen ryggmargs microglia ble oppnådd fra voksne BALB / c-mus og behandlet med LPS (Salmonella Minnesota Re595) på D 13 etter initiering av kulturen. Supernatanter ble samlet opp 24 timer etter LPS behandling for bestemmelse av cytokin og kjemokin nivåer via en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) ved anvendelse av kommersielt tilgjle kits.

Når denne voksen glial kulturen systemet først ble etablert, ble cellene inkubert i en standard kultur miljø ved 37 o C. Under denne tilstanden, gjennomsnittlig microglial innhold varierte 5-10%. Det ble imidlertid observert at til tross for bruk av konsistente kulturteknikker, vil kulturer i noen tilfeller ha enten meget lav microglial innhold (<2%) eller relativt høyt innhold microglial (15 - 20%) 10. Det kan være frustrerende å få kulturer som har svært få microglia når de eksperimentelle resultatene er avhengige av mikrogliaceller svar innen blandet kultur. Etter forslag fra Dr. Alejandro MS Mayer (Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine) 12, ble metoden endret ved å dyrke de blandede gliacellene på 35,9 o C. Dette resulterte i en mer konsekvent og høyere microglial yield (varierer mellom 10-40% og resten stort sett around 20%) innen for de fleste kulturer. Denne forbedringen er illustrert i fig 4 Som rapportert tidligere, blir mikroglia beregnet til å utgjøre 5 -. 21% av CNS glial befolkningen i voksne mus 13-15. Selv om begge dyrkningsforhold tilveiebringe kulturer som inneholder lignende mengder av mikroglia som estimert in vivo, den modifiserte dyrkingsbetingelser (35,9 ° C) er mer egnet for eksperimenter som er det avgjørende å undersøke svarene fra både astrocytter og mikroglia.

Figur 1
Fig. 1: Calcitonin Gene-relatert peptid (CGRP) -indusert kjemokin Produksjon av Blandede gliaceller Blandede gliaceller fremstilt fra neonatale BALB / c mus hjerner (til venstre) eller voksne BALB / c-mus ryggmargen (til høyre) ble behandlet med forskjellige doser av CGRP. Nivåer av flere kjemokiner i kultursupernatanter ble bestemt via multipleks analyse (utført av produsenten) til optimale tider (gjennomsnitt ± SEM, n = 2-6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 3: Cytokin og chemokin Responses av Mouse voksen ryggmargs Blandet Glia ved LPS stimulering Voksen ryggmargs blandede gliaceller ble fremstilt fra BALB / c mus og stimulert med ulike doser av LPS.. Nivåer av IL-6 (A), tumor nekrose faktor (TNF) -alpha (B), interferon-Y-induserbar protein 10 (IP-10, også kjent som CXCL10) (C), og monocytt-kjemotiltrekkende protein 1 (MCP- 1, også kjent som CCL2) (D) i kultursupernatantene ble bestemt ved ELISA ved 24 timer etter LPS-behandling.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 4:. Microglial Innhold i Voksen Blandede Glial kulturer Blandede gliaceller ble generert fra voksne C57B6 / L mus og dyrket på enten 37 o C eller 35,9 o C. Microglial innhold fra hver kultur ble analysert via flowcytometri ved hjelp av APC-anti-muse-CD45 (klon 30-F11) og FITC-anti-mus-CD11b (klon M1 / ​​70). Representative plott fra flowcytometrisk analyse vises. Den totale cellepopulasjoner fra kulturene ble identifisert i plott A (37 ° C) og C (35,9 ° C), og mikrogliaceller populasjoner (CD45 + CD11b + celler) ble ytterligere isolert fra de respektive totale cellepopulasjoner i B (37o C) og D (35,9 ° C). Flowcytometrisk analyse ble utført, og alle data ble analysert som tidligere beskrevet fem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er viktig å utføre alle trinnene-, inkludert mediene skiftende tidsplan-på en konsekvent måte for å oppnå reproduserbare resultater mellom eksperimenter. Følgende trinn er spesielt kritisk i å få god kvalitet voksen mixed gliaceller.

Enzymatisk nedbrytning er et viktig aspekt ved denne protokollen. Det er viktig at vevet bitene er godt spaltet for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Imidlertid vil over fordøyelsen resultere i betydelig færre celler. Hver lab trenger for å utføre pilotforsøk for å bestemme den nøyaktige koketiden basert på hvilke typer ampuller som benyttes for inkubering, den gjennomsnittlige vev mengde anvendes hver gang, og den type rister (roterende kontra orbital shaker). Videre, uavhengig av papain dissosiasjon-systemet velges, er det viktig å konsekvent bruke de samme komponentene fra de samme kilder som sporadisk utskifting av komponenter kan føre til betydelige variasjoner i utbyttetav totalt antall celler.

Ved denne protokollen blir myelin fjernes ved hjelp av en densitetsgradient medium. Det er viktig å lage og bruke densitetsgradient-løsninger ved romtemperatur, siden tettheten av disse løsningene er temperaturfølsomme. Tettshetsgradient løsninger er som regel lagret ved 4 o C. Om nødvendig kan de densitetsgradient løsningene holdes ved romtemperatur over natten før dagen for å sette opp kulturen. I tillegg, etter 30 min sentrifugering av cellene i densitetsgradient på 20%, cellene skal fjernes umiddelbart fra sentrifugen for å hindre at store deler av rusk fra å forskyve seg (dvs. beveger seg bort fra toppen av oppløsningen; se trinn 4.1).

Det er viktig å fjerne rusk på D en stolpe initiering av kulturen. Selv om cellene vil overleve og formere seg hvis kulturen media endres hver 3-4 d, endre media på D 1 vil gi en mer "stillestående" og "renere" kultur senere. Dettegjør det mulig for celler å vokse i et miljø mindre forstyrret, og cellene kan holdes opp til 21 d etter initiering av kulturen.

Microglial innhold for hvert eksperiment kan undersøkes før bruk av blandede gliaceller. Selv med den mest konsekvente teknikken, kan microglial innholdet fortsatt varierer betydelig mellom eksperimenter. Noen cellulære effekter er avhengig av microglial innhold 4, 10; således, er det viktig å overvåke microglial innholdet av hvert sett av kulturer etablert. Data oppnådd fra denne praksisen kan bidra til å tolke variasjoner mellom eksperimenter, så vel som for å tilveiebringe nye (noen ganger uventet) kunnskap om bidraget fra astrocytter versus mikroglia under en bestemt eksperimentell tilstand. I tillegg har sesongmessige variasjoner på microglial innhold er observert. Dette kan være en ekstra faktor å vurdere når du planlegger store sett med eksperimenter. Videre, mens neuroner vanligvis ikke vil overleve under vår kultur tilstand,som Neun (en neuronal- markør) -positive celler ikke er observert i våre gliaceller kulturer etter immunhistokjemisk farging, kan kulturen inneholde et begrenset antall oligodendrocytes (dette har ikke blitt rutinemessig kvantifisert). Man bør avgjøre om denne populasjonen må undersøkes avhengig av de spesifikke eksperimentelle forhold.

Som med mange eksperimentelle metoder, kan denne metoden endres i henhold til behovene til enkeltforskere. Det er viktig å utføre pilotforsøk for å teste de konkrete endringene før du bruker dem regelmessig. Videre bør det bemerkes at den blandede gliaceller kan anvendes for å oppnå microglia fattige og microglia-anrikede kulturer for å studere reaksjoner i astrocytt-dominant versus microglia-dominant celler etter spesifikk stimulering, som tidligere beskrevet for neonatale blandede gliaceller 3, 4. imidlertid vil utbyttet av microglia-anrikede celler begrenset med mindre et stort antall spinalledninger blir brukt til å etablere kulturen ved begynnelsen. Dette er en begrensning av denne fremgangsmåten, spesielt hvis mus brukes. Ved bruk av rotteryggmargen, kan en individuell ryggmargen (i stedet for 4 mus ryggmargen) brukes til å sette opp en 12-brønns plate. Til slutt, ikke microglial innhold ikke ut til å være vesentlig forskjellig mellom mus og rotter voksen ryggmargs glia kulturer 4, 5 Både mus og rotter voksen ryggmargs gliaceller kulturer produsere en robust respons på LPS stimulering i form av cytokin produksjon.; kan imidlertid differensial reaksjoner observeres når alternative stimuli blir brukt.

Alt i alt gir dette gnager voksen glial kultursystem en alternativ metode for å studere gliaceller in vitro. Resultatene fra denne kulturen systemet nærmere reflektere hva som ville bli observert under in vivo betingelser sammenlignet med resultatene fra neonatale kulturer eller cellelinjer. I den nåværende fremgangsmåten, glialceller er collected fra voksne gnagere, som voksen gliaceller reagerer på stimuli veldig annerledes i forhold til neonatal gliaceller 4 (figur 1). Cellene er ikke manipulert betydelig gjennom immortaliseringskonstruksjoner prosedyrer, som ville bli brukt til å generere og opprettholde cellelinjer. Selv om denne fremgangsmåten ble opprinnelig utviklet for å brukes i nevropatisk smerte undersøkelser, kan det brukes til å studere andre nevrologiske sykdommer som involverer patologiske endringer i ryggmargen, slik som ALS og MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter