Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.

Abstract

Ha sido bien aceptado que la médula espinal respuestas gliales contribuyen significativamente al desarrollo del dolor neuropático. Información relativa a las actividades tremenda gliales en los niveles celular y molecular ha sido obtenida a través de los sistemas de cultivo celular in vitro. Los sistemas in vitro utilizados, incluyen principalmente la glía primaria derivada de tejido cortical cerebral neonatal y líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, estos sistemas no siempre son representativas de las características de las células gliales de la médula espinal in vivo. Con el fin de investigar más a fondo el papel de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo de los nervios periféricos del dolor neuropático inducido por lesión usando un sistema de cultivo que mejor refleja la condición in vivo, nuestro laboratorio ha desarrollado un método para establecer la médula espinal primaria cultivos gliales mixtos a partir de ratones adultos. Brevemente, las médulas espinales se recogen de los ratones adultos y procesados ​​a través de la digestión con papaína seguido de la eliminación de la mielina con un densdad-gradiente medio. Suspensiones de células individuales se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (cDMEM) suplementado con 2-mercaptoetanol (2-ME) en 35,9 o C. Estas condiciones de cultivo fueron optimizadas específicamente para el crecimiento de las células gliales mixtos. En estas condiciones, las células están listas para ser utilizado para la experimentación entre 12 - 14 d (células son por lo general en la fase de registro durante este tiempo) después del establecimiento del cultivo (D 0) y pueden ser mantenidos en condiciones de cultivo hasta D 21. Este sistema de cultivo se puede utilizar para investigar las respuestas de las células gliales de la médula espinal a la estimulación con diversas sustancias y agentes. Además del dolor neuropático, este sistema puede ser utilizado para estudiar las respuestas gliales en otras enfermedades que implican cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal.

Introduction

El dolor crónico es un problema de salud grave que afecta a aproximadamente 100 millones de adultos en los Estados Unidos, con un coste anual estimado de hasta $ 635 billón 1. La creciente evidencia ha indicado una contribución significativa de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, uno de los tipos más devastadores de dolor crónico 2. Un sistema adecuado de cultivo in vitro podría ayudar significativamente en la investigación aún más las funciones de las células gliales en los niveles celular y molecular.

En la actualidad, los sistemas de cultivo in vitro gliales en utilizadas por los investigadores incluyen principalmente células gliales derivadas de tejidos corticales neonatales de ratón o rata cerebros y inmortalizados líneas de células gliales derivadas de ratón o rata neonatal células gliales primarios. células neonatales contienen un número significativo de células no diferenciadas que se pueden diferenciar aún más en las células gliales (astrocitos y microglia principalmente), proporcionando así unacélulas bundant para el uso experimental 3. Sin embargo, nuestro estudio anterior ha demostrado que las células gliales del cerebro neonatal respondieron significativamente diferente de las células gliales de la médula espinal para adultos a la estimulación de lipopolisacárido (LPS). Por ejemplo, la interleucina (IL) -4 muestran mejorada efectos inhibidores sobre el óxido nítrico inducida por LPS (NO) en la rata adulta glia médula espinal en comparación con células gliales del cerebro neonatal 4. Además, los perfiles de producción de quimioquinas tras la estimulación por un neuropéptido, la calcitonina péptido relacionado con el gen (CGRP), son indiscutiblemente diferente entre glia cerebro de ratón neonatal (métodos descritos en la Ref. 5) y de ratón adulto médula espinal glia (Figura 1). líneas celulares establecidas son fáciles de usar y de mantener y pueden proporcionar un gran número de células en un período de tiempo corto. En general, las líneas celulares inmortalizadas son generados ya sea usando un sistema de inmortalización mediada por virus (tales como la línea celular microglial ampliamente utilizado BV2) 6, 7 o después de THe identificación de transformación espontánea (tal como la línea celular de astrocitos C8-D1A y la línea celular microglial C8-B4) 8, 9 líneas celulares son excelentes en el estudio de las características moleculares de los astrocitos y microglia individualmente.; sin embargo, los resultados obtenidos de líneas celulares siempre requieren una validación adicional en las células primarias o en condiciones in vivo. También hay que señalar que no ha habido un informe de una línea celular glial que se deriva de un glia de la médula espinal de roedores.

Para ayudar a la investigación de la función de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, un sistema de cultivo que se deriva de la médula espinal de ratón adulto se ha desarrollado mediante la adaptación de un método reportado previamente utilizado para generar de rata adulta cultivos gliales mixtos 4, 5 . El cultivo glial médula espinal de ratón se refinó aún más recientemente 10 y se describe en más detalle en este artículo. Adultas de la médula espinal mezclado culturas gliales cSe establecerá una con un ratón a partir de cepas seleccionadas que se adapten a las necesidades del estudio en particular, y las células se pueden mantener en cultivo durante hasta 21 días después del inicio del cultivo. Este método se puede utilizar en estudios de dolor neuropático, así como en las investigaciones de diversas enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos en la médula espinal, tales como la esclerosis amiotrófica lateral (ALS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) -asociado neuropatía sensorial, y múltiple la esclerosis (MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Nueva Inglaterra. El siguiente protocolo es para la preparación de cultivos gliales de la médula espinal 4 de ratón adulto.

1. Preparación de las soluciones en una campana de cultivo bajo condiciones asépticas

  1. Preparar medios de cultivo: modificación del medio de Eagle (cDMEM) que contiene DMEM completo de Dulbecco (con 4,5 g / l de glucosa), 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina , 250 ng / ml de anfotericina B y 50 mM 2-mercaptoetanol (2-ME; véase el punto 1.1.1). Mezclar y filtrar esterilizar todos los demás componentes y luego añadir FBS. Almacenar los medios de cultivo a 4 ° C.
    1. Preparar 50 mM 2 ME-/ solución salina tamponada con fosfato solución madre (PBS): Añadir 100 ml de concentrado 2-ME (14,3 M) en 28,6 ml de PBS 1x, y esterilizar el filtro (la solución se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses). TSE 1 ml de 2-ME solución de reserva por cada 1.000 ml de medio de cultivo.
  2. Preparación de los medios de gradiente de densidad
    1. Preparar una solución isotónica medios de gradiente de densidad de valores (por ejemplo, el 100% de Percoll) a partir de 1 parte de 10x PBS estéril regular y 9 partes de medios de gradiente de densidad estéril de valores (por ejemplo, Percoll).
    2. Diluir los medios de gradiente de densidad de 100% (hecho en 1.2.1) con 1x regular de PBS estéril para hacer un medio de gradiente de densidad de 20% (por ejemplo, 10 ml de medio de gradiente de densidad de 100% con 40 ml de 1x PBS) y almacenarla en 4 o C. Llevar los medios de gradiente de densidad de 20% a temperatura ambiente (TA) antes de preparar el cultivo celular.
  3. Preparación de las soluciones del sistema de disociación de papaína
    NOTA: El sistema de disociación de papaína puede ser identificado en la Tabla de Materiales. Otros kits de disociación similares (incluyendo los reunidos en la casa) también se pueden utilizar. Todo Components deben ser estériles.
    1. Añadir 32 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) a la mezcla de inhibidor de ovomucoide (polvo).
    2. Añadir 5 ml de EBSS a un vial de papaína (polvo). Coloque el vial de la papaína en un 37 ° C baño de agua durante 10 minutos o hasta que la papaína se disuelve.
    3. Añadir 500 l de EBSS a un vial de DNasa (polvo). Mezclar suavemente.
    4. Añadir 250 l de la solución de DNasa (arriba) al vial de la papaína.
    5. Calcular la cantidad total de la mezcla de papaína / DNasa anterior es necesario (aproximadamente 800 l de mezcla de papaína / DNasa por ratón médula espinal) y transferir la mezcla necesaria en un tubo de 50 ml para la digestión del tejido (paso 3.2). Almacenar el sobrante en el vial original a 4 ° C durante al menos dos semanas.
    6. Mantenga todos los componentes de los kits en hielo hasta que se necesite.
  4. Preparar tubos de recogida de la médula espinal: un tubo estéril de 15 ml con 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS; del sistema de papaína disociación,0; para la recogida de la médula espinal) y un tubo estéril de 15 ml con PBS 1x (para llenar la jeringa de 5 ml, véase el paso 2.4). Además, preparar una placa de Petri estéril (35 mm o 60 mm) con 5 ml de HBSS y mantenerlo en la campana de cultivo.

2. Colección de la médula espinal

NOTA: Todo el equipo debe ser estéril. Realizar la recolección en un área designada aprobado por el IACUC.

  1. Obtener las siguientes herramientas para las médulas espinales de recolección de ratón: tijeras rectas afilados / romos de 18 cm quirúrgicos, un bisturí de 12 cm estándar (# 3 sólido), de acero al carbono hojas de bisturí estériles Nº 10, una pequeña decapitator animal, de 12 cm estándar curvada fórceps y una aguja 20G estéril unida a una jeringa de 5 ml.
  2. La eutanasia a los animales con CO2 y desinfectar la cabeza de ratón y la región trasera con un 70% de etanol (EtOH).
  3. Decapitar al animal con decapitator. Hacer una incisión longitudinal medio de la espalda baja para exponer la capa muscular. Haceruna transección limpia a través de la columna de vertebrados en el nivel de la cadera (también cortar a través de la capa muscular que cubre la columna de vertebrados) con las tijeras quirúrgicas estériles rectas (18 cm).
  4. Colocar el animal en una hoja de fresca toallita desechable. Con cuidado, inserte la aguja G 20 (que se adjunta a una jeringa de 5 ml lleno de PBS 1x estéril (paso 1.4)) en la columna vertebral hacia el lado rostral. Mantenga el animal hacia abajo con fuerza y ​​empuje la jeringa rápidamente. Toda la médula espinal debe salir desde el extremo del cuello uterino. Recoger la médula espinal en el tubo que contiene 15 ml de HBSS.
  5. Repita el paso 2.4 para el resto de los ratones. Entre cada animal, desinfectar todos los instrumentos utilizados con EtOH al 70%.
    NOTA: Por lo general, una sola placa de 12 pocillos se puede establecer por cada 4 médulas espinales de ratones (véase 4.3).

3. Preparación de la suspensión de células únicas

Nota: Realice los pasos 3 y 4 en una campana de cultivo para mantener todo estéril.

  1. Transferir todos los cables de la columna vertebral en la placa de Petri que contiene HBSS-(paso 1.4). Cortar cada una de las médulas espinales en muchos, pequeños trozos finos con tijeras y pinzas estériles. Transferir el tejido de la médula espinal al tubo cónico de 50 ml que contiene la papaína preparado / mezcla de enzimas ADNasa (etapa 1.3.5) usando pinzas estériles o una pipeta ml 10 (evitar la adición de HBSS a la mezcla de enzimas, ya que esto va a diluir aún más la preparó solución de enzima y puede resultar en una disminución del rendimiento de la enzima).
  2. Vortex el tubo suavemente para mezclar. Incubar el tubo a 37 ° C durante 1 h en un incubador / agitador con agitación orbital a 150 rpm.
  3. Vortex el tubo de nuevo y vigoroso triturar la solución de enzima con el tejido usando una pipeta de 5 ml para promover aún más la disociación.
  4. Transferir la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA.
  5. Durante la centrifugación, mezclar 2,7 ml de EBSS con 300 l de reconstituido inh albúmina ovomucoidesolución ibitor (1.3.1) en un tubo estéril. Añadir 150 l de la solución de DNasa (etapa 1.3.3).
  6. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con la solución preparada anteriormente (paso 3.5). Vortex bien para romper el sedimento celular.
  7. Añadir 3 ml de solución reconstituida albúmina ovomucoide inhibidor (etapa 1.4.1) a la suspensión celular. centrifugar las células a 70 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante (que contiene fragmentos de membrana).

4. eliminación adicional de la mielina de la suspensión de células únicas

  1. Añadir 8 ml de medio de gradiente de densidad de 20% (preparado en la etapa 1.2.2) en el tubo que contiene el sedimento celular, vórtice suavemente para perturbar el sedimento, y centrifugar las células a 800 xg durante 30 min a TA sin frenado. Retire cuidadosamente la capa superior de los desechos (en su mayoría de mielina) y el sobrenadante, pero mantener el sedimento.
  2. Para eliminar restos de la gradiente de densidad, se lavan las células por resuspending el sedimento celular con 8 ml de una cDMEM diluido (1 parte cDMEM y 2 partes HBSS). Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar las células de nuevo con la cDMEM diluido (arriba) de la misma manera. Mantener las células en hielo hasta la siembra de ellos.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo (cDMEM suministra con 2-ME (preparado en el paso 1.1)). Para una placa de 12 pocillos, utilice 3 ml x 4 (número de ratones utilizados) + 2 ml = 14 ml de medios de comunicación. Esto asegurará que haya suficiente suspensión de células para toda la placa (12 pocillos) y proporcionará para pozos adicionales que se pueden utilizar para determinar el número promedio de células por pocillo y el contenido microglial de la cultura. Si se van a utilizar otros tipos de recipientes de cultivo, calcular el volumen total de medios de cultivo necesario proporcionalmente.
  4. Añadir 1 ml de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
  5. Se incuban las células a 35,9 ° C con 5% de CO 2.
  6. NOTA: En los días 1, el cultivo puede contener cantidades significativas de desechos debido a la mielina residuo desde el tejido de la médula espinal; por lo tanto, se recomienda cambiar los medios de comunicación en el día 1 (véase la discusión para más información). Los cultivos están listos para el tratamiento entre D 12 - 14. Las células son por lo general 80% de confluencia en D 12 y pueden ser de casi el 100% de confluencia de D 14. Por lo general, el D 12, hay cerca de 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos .

Figura 4
Figura 2:. Imágenes representativas de células gliales mixtas en diferentes momentos después del establecimiento de la cultura glia mixto glia mixtos médula espinal primarios se prepararon a partir de adultos C57BL / 6 ratones. imágenes representativasmostrar el progreso de la cultura gliales después de la siembra. Al día 1, algunas células se unen a la placa de cultivo, pero todavía están en su mayoría ronda. También hay muchas células flotantes y escombros significativa. Al día 4, la mayoría de las células están unidas a la placa de cultivo. Las células aparecen ramificada con los procesos visibles. Las células se distribuyen de forma esporádica y las culturas son aproximadamente 20-30% de confluencia en este momento. En el día 8, las culturas son entre un 50-60% de confluencia. Algunas áreas de las culturas tienen grandes parches de células. Otras áreas de las culturas tienen escasa crecimiento de las células. Algunas células dentro de los parches adquieren una apariencia "cuadrado-como". Al día 12, los cultivos están en o por encima de 80% de confluencia (confluencia de 90% en la imagen que se muestra aquí). De células se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento en este momento y entre los días 12-14 es el momento óptimo para el uso de las células de la glia para los experimentos. Por favor, haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta figura.

  1. Examinar el contenido de la microglia utilizando células de los pozos adicionales (paso 4.3) a través de células activadas por fluorescencia estándar (FACS) protocolo de tinción 11 usando la combinación de anti-ratón-CD45 y anticuerpos monoclonales anti-CD11b ratón. Células CD45 + CD11b + se identifican como microglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Este método se puede usar para preparar células gliales mixtos a partir de los dos ratones y ratas. El número total de células medio por pocillo en una placa de 12 pocillos en D-12 después del inicio del cultivo debe ser relativamente estable, con alrededor de 100.000 células por pocillo cuando las células se derivan de la médula espinal de ratón. Las células gliales obtenidas a partir de este método se pueden utilizar en experimentos diseñados para examinar las respuestas gliales de la médula espinal adultos tras la administración de las sustancias y agentes de interés. La Figura 3 proporciona un ejemplo de citoquinas y quimioquinas respuestas de un experimento típico en el que adultos de la médula espinal microglia se obtuvieron de ratones adultos BALB / c y tratados con LPS (Salmonella Minnesota Re595) en D 13 post-inicio del cultivo. Se recogieron los sobrenadantes 24 h de tratamiento post-LPS para la determinación de los niveles de citoquinas y quimioquinas a través de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) utilizando comercialmente availabkits LE.

Cuando se estableció por primera vez este sistema de cultivo glial adulto, las células fueron incubadas en un ambiente de cultivo estándar a 37 ° C. Bajo esta condición, el contenido microglial media osciló 5-10%. Sin embargo, se observó que a pesar del uso de técnicas de cultivo consistentes, culturas serían en algunos casos tener ya sea muy bajo contenido microglial (<2%) o relativamente alto contenido microglial (15 - 20%) 10. Puede ser frustrante para obtener cultivos que tienen muy pocos microglia cuando los resultados experimentales se basan en las respuestas de la microglía en el cultivo mixto. Siguiendo la sugerencia del Dr. Alejandro MS Mayer (Departamento de Farmacología, Chicago Colegio de Medicina Osteopática) 12, el método fue modificado por el crecimiento de las células gliales mixtos a 35,9 ° C Esto dio como resultado un rendimiento más consistente microglial y superior (que oscila entre 10 a 40% y el restante en su mayoría around 20%) dentro de la mayoría de las culturas. Esta mejora se ilustra en la Figura 4 Como se informó anteriormente, microglia se estima para compensar 5 -. 21% de la población glial del SNC en ratones adultos 13-15. Aunque ambas condiciones de cultivo proporcionan cultivos que contienen cantidades similares de microglia como se estima in vivo, la condición de cultivo modificado (35,9 ° C) es más apropiado para los experimentos en los que es fundamental para examinar las respuestas de ambos astrocitos y microglia.

Figura 1
Figura 1:. Relacionados con el gen de la calcitonina péptido (CGRP) inducida por la producción de quimioquinas por las células gliales mixtas células gliales mixtos preparados a partir de cerebros neonatales ratón Balb / c (izquierda) o médula espinal de adultos BALB / c de ratón (derecha) se trataron con diversas dosis de CGRP. Los niveles de varias quimiocinas en los sobrenadantes de cultivo se determinaron mediante ensayo multiplex (realizado por el fabricante) en los momentos óptimos (media ± SEM, n = 2 - 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 3: Respuestas de citoquinas y quimioquinas de ratón adulto Spinal Cord mezcladas Glia a LPS estimulación células gliales mixtos médula espinal adulta se prepararon a partir de ratones BALB / c y se estimularon con diversas dosis de LPS.. Los niveles de IL-6 (A), factor de necrosis tumoral (TNF) alfa (B), la proteína de interferón-gamma-inducible 10 (IP-10, también conocida como CXCL10) (C), y los monocitos proteína quimioatrayente 1 (MCP- 1, también conocido como CCL2) (D) en sobrenadantes de cultivo se determinaron mediante ELISA en 24 h de tratamiento post-LPS.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 4:. Microglial contenido en adultos mezcla de culturas gliales células gliales mixtos se generan a partir de ratones adultos C57B6 / L y se cultivaron a 37 ° C, ya sea o 35.9 ° C contenido Microglial de cada cultivo se analizó mediante citometría de flujo utilizando APC-anti-ratón-CD45 (clon 30-F11) y FITC-anti-ratón-CD11b (clon M1 / ​​70). se muestran parcelas representativos de los análisis de citometría de flujo. (Células CD45 + CD11b +) Las poblaciones de células totales procedentes de los cultivos se identificaron en parcelas A (37 ° C) y C (35,9 ° C), y las poblaciones microgliales se aislaron más lejos de las respectivas poblaciones de células totales en B (37o C) y D (35,9 ° C). Se realizó un análisis de citometría de flujo, y se analizaron todos los datos como se ha descrito previamente 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es fundamental para llevar a cabo todos los pasos, incluyendo el cambio de horario, de manera coherente con el fin de obtener resultados reproducibles entre los experimentos medios de comunicación. Los siguientes pasos son particularmente críticos para obtener una excelente calidad de adultos glía mixta.

La digestión enzimática es un aspecto importante de este protocolo. Es crucial que las piezas de tejido son bien digerido con el fin de obtener una suspensión de células individuales. Sin embargo, el exceso de la digestión dará lugar a significativamente menos células. Cada laboratorio necesita para llevar a cabo pruebas piloto para determinar el tiempo de digestión exacta basada en los tipos de viales usados ​​para la incubación, la cantidad de tejido media utiliza cada vez, y el tipo de agitador (giratoria frente agitador orbital). Además, independientemente del sistema de papaína disociación elegido, es esencial utilizar consistentemente los mismos componentes de las mismas fuentes, como la sustitución ocasional de componentes podría conducir a variaciones significativas en el rendimientodel número total de células.

En este protocolo, la mielina se elimina el uso de un medio de gradiente de densidad. Es fundamental para realizar y utilizar soluciones de gradiente de densidad a temperatura ambiente ya que las densidades de estas soluciones son sensibles a la temperatura. Soluciones de gradiente de densidad normalmente se almacenan a 4 ° C. Si es necesario, las soluciones de gradiente de densidad se pueden mantener a temperatura ambiente durante la noche antes del día de la creación de la cultura. Además, después de la 30 min de centrifugación de células en el gradiente de densidad de 20%, las células deben retirarse inmediatamente de la centrífuga para evitar que grandes trozos de escombros de desplazamiento (es decir, alejándose de la parte superior de la solución; véase el paso 4.1).

Es importante para eliminar los residuos de D 1 mensaje inicio del cultivo. Aunque las células van a sobrevivir y proliferar si el medio de cultivo se cambia cada 3 a 4 d, el cambio de los medios de comunicación en los días 1 y proporcionará una cultura "más limpia" más "de reposo" más adelante. Estapermite que las células crezcan en un ambiente menos perturbado, y las células se pueden mantener hasta 21 días post-inicio del cultivo.

contenido Microglial para cada experimento puede ser examinado antes de usar el glia mixto. Incluso con la técnica más consistente, contenido microglial todavía puede variar significativamente entre los experimentos. Algunos efectos celulares dependen de contenido microglial 4, 10; por lo tanto, es crucial controlar el contenido de la microglia de cada grupo de cultivos establecidos. Los datos obtenidos de esta práctica pueden ayudar a interpretar variaciones entre experimentos, así como para proporcionar nuevos conocimientos (a veces inesperado) en relación con la contribución de los astrocitos en comparación con microglia bajo una condición experimental particular. Además, se han observado variaciones estacionales en el contenido microglial. Esto puede ser un factor adicional a considerar en la planificación de grandes conjuntos de experimentos. Por otra parte, mientras que las neuronas normalmente no sobrevivirán en virtud de nuestra condición de cultivo,como NeuN (un marcador neuronal-) células positivas no se han observado en nuestros cultivos gliales después de la tinción inmunohistoquímica, la cultura puede contener un número limitado de oligodendrocitos (esto no se ha cuantificado de forma rutinaria). Uno debe decidir si esta población debe ser examinada en función de las condiciones experimentales específicas.

Como con muchos métodos experimentales, este método puede ser modificado de acuerdo con las necesidades de los investigadores individuales. Es esencial para llevar a cabo experimentos piloto para probar completamente las modificaciones específicas antes de usarlos de forma rutinaria. Además, hay que señalar que la glia mezclado se puede utilizar para obtener cultivos de microglia-agotado y microglia enriquecido para estudiar las respuestas de los astrocitos dominante frente a las células de microglia-dominante después de estimulaciones específicas, como se describió anteriormente para las células gliales mixtos neonatales 3, 4. Sin embargo, el rendimiento de las células de microglia enriquecido se limitará a menos que un gran número de médulacuerdas se utilizan para establecer la cultura al principio. Esta es una limitación de este método, en particular si se utilizan ratones. Cuando se utilizan las médulas espinales de rata, una médula espinal individuo (en lugar de 4 médula espinal de ratón) puede ser usado para configurar una placa de 12 pocillos. Finalmente, el contenido microglial no parece ser significativamente diferentes entre las culturas gliales ratón y rata adulta de la médula espinal 4, 5 Ambos cultivos gliales de ratón y de rata adulta de la médula espinal producen una respuesta robusta a la estimulación LPS en términos de la producción de citoquinas.; Sin embargo, se pueden observar las diferentes respuestas cuando se utilizan estímulos alternativos.

En total, este sistema de cultivo glial roedor adulto proporciona un método alternativo para estudiar las células gliales in vitro. Los resultados obtenidos de este sistema de cultivo más estrechamente reflejan lo que se observaría en condiciones in vivo en comparación con los resultados obtenidos a partir de cultivos neonatales o líneas celulares. En el método actual, las células gliales son collected de roedores adultos, como responder adulto glia a los estímulos de manera muy diferente en comparación con la glía neonatal 4 (Figura 1). Las células no se manipulan de manera significativa a través de procedimientos de inmortalización, que se utilizan para generar y mantener líneas celulares. Aunque este método fue inicialmente desarrollado para ser utilizado en estudios de dolor neuropático, que puede ser utilizado para estudiar otras enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos en la médula espinal, tales como ALS y MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter