Utvecklingen av neuropatisk smärta innebär patologiska förändringar av ryggmärgs gliaceller. Ett pålitligt gliaceller odlingssystemet som härrör från vuxna ryggmärgsvävnad och utformade för att studera dessa celler in vitro saknas. Därför visar vi här hur man kan upprätta primära blandade gliaceller kulturer från vuxen mus ryggmärg.
Det har väl accepterat att ryggmärgen gliaceller svar bidrar i hög grad till utvecklingen av neuropatisk smärta. Enorma information om gliaceller aktiviteter på cellulär och molekylär nivå har erhållits genom in vitro cellodlingssystem. De in vitro-system som används, omfattar huvudsakligen primära glia härledd från neonatal hjärna kortikal vävnad och odödliggjorda cellinjer. Dock kan dessa system inte speglar egenskaperna hos ryggmärgs gliaceller in vivo. För att ytterligare undersöka rollerna för ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av perifer nervskada inducerad neuropatisk smärta med ett odlingssystem som bättre speglar in vivo tillstånd, har vårt laboratorium utvecklat en metod för att fastställa primär ryggmärgs blandade gliaceller kulturer från vuxna möss. I korthet är ryggmärg in från vuxna möss och bearbetas genom papaindigestion följt av myelin avlägsnande med hålorhet-gradient medium. Enkelcellsuspensioner odlas i fullständigt Dulbeccos modifierade Eagle-medium (cDMEM) kompletterat med 2-merkaptoetanol (2-ME) vid 35,9 ° C Dessa odlingsbetingelser optimerades speciellt för tillväxten av blandade gliaceller. Under dessa betingelser, cellerna är redo att användas för experiment mellan 12-14 d (celler är vanligen i log-fasen under denna tid) efter upprättandet av kulturen (D 0) och kan hållas i odlingsbetingelser upp till D 21. detta odlingssystem kan användas för att undersöka svaren från ryggmärgs gliaceller vid stimulering med olika substanser och agenter. Förutom neuropatisk smärta, kan detta system användas för att studera gliaceller svar i andra sjukdomar som involverar patologiska förändringar av ryggmärgs gliaceller.
Kronisk smärta är ett allvarligt hälsoproblem som drabbar cirka 100 miljoner vuxna i USA, med en uppskattad årlig kostnad på upp till $ 635.000.000.000 ett. Montera bevis har visat ett betydande bidrag av ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av neuropatisk smärta, en av de mest förödande typer av kronisk smärta 2. En riktig odling in vitro-systemet skulle bidra avsevärt under ytterligare undersöka rollerna för gliaceller på cellulär och molekylär nivå.
För närvarande är de in vitro-gliaceller kultursystem som används av forskare omfattar huvudsakligen gliaceller erhållna från kortikala vävnader från neonatala musen eller råtthjärnor och immortaliserade gliala cellinjer härledda från neonatal mus eller råtta primära gliaceller. Neonatala celler innehåller ett betydande antal odifferentierade celler som kan ytterligare differentieras till gliaceller (främst astrocyter och mikroglia), vilket ger enbundant celler för experimentell användning 3. Dock har vår tidigare studie visat att neonatal hjärn gliaceller svarade signifikant annorlunda än vuxna ryggmärgen gliaceller på lipopolysackarid (LPS) stimulering. Till exempel, interleukin (IL) -4 som visas förstärkt hämmande effekter på LPS-inducerad kväveoxid (NO) produktion i vuxen råtta ryggmärgen Glia jämfört med neonatal hjärna glia 4. Vidare profilerna av kemokinproduktion efter stimulering genom en neuropeptid, kalcitonin-gen-relaterad peptid (CGRP), är obestridligen olika mellan neonatal mushjärna glia (metoder som beskrivs i ref. 5) och vuxen mus ryggmärg glia (Figur 1). Etablerade cellinjer är lätta att använda och underhålla och kan ge ett stort antal celler i en kort tidsperiod. I allmänhet immortaliserade cellinjer genereras antingen med användning av ett virus-medierad immortalisering systemet (såsom utbredda microglial cellinje BV2) 6, 7 eller efter the identifiering av spontan transformation (såsom astrocyt cellinjen C8-D1A och microglial cellinje C8-B4) 8, 9 Cellinjer är utmärkta i att studera de molekylära egenskaperna hos astrocyter och mikroglia individuellt.; emellertid de resultat som erhållits från cellinjer kräver alltid ytterligare validering i primära celler eller i in vivo-betingelser. Det bör också noteras att det inte har funnits en rapport av en glia-cellinje som är härledd från en gnagare ryggmärgen glia.
Att hjälpa till att undersöka rollen av ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av neuropatisk smärta, ett kultursystem som är härledd från vuxen mus ryggmärg har utvecklats genom att anpassa en tidigare rapporterade metoden som används för att generera från vuxen råtta blandade gliaceller kulturer 4, 5 . musen ryggmärgen gliaceller kulturen ytterligare förfinas nyligen 10 och beskrivs mer detaljerat i den här artikeln. Vuxna ryggmärgen blandade gliaceller kulturer cen upprättas med en mus från utvalda stammar som passar behoven hos den särskilda studien, och celler kan upprätthållas i odling under upp till 21 d lägga initiering av kulturen. Denna metod kan användas i neuropatiska smärtstudier, samt i undersökningar av olika neurologiska sjukdomar som involverar patologiska förändringar i ryggmärgen, såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS), humant immunbristvirus (HIV) -associated sensorisk neuropati och multipel skleros (MS).
Det är viktigt att utföra alla steg-inklusive medierna förändras schema på ett konsekvent sätt i syfte att erhålla reproducerbara resultat mellan experiment. Följande steg är särskilt kritisk för att erhålla utmärkt kvalitet vuxen blandad glia.
Den enzymatiska nedbrytning är en viktig aspekt av detta protokoll. Det är avgörande att vävnaden bitar är väl-digererad för att erhålla en enkelcellsuspension. Dock kommer över matsmältning leda till betydligt färre celler. Va…
The authors have nothing to disclose.
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |