Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

Utvecklingen av neuropatisk smärta innebär patologiska förändringar av ryggmärgs gliaceller. Ett pålitligt gliaceller odlingssystemet som härrör från vuxna ryggmärgsvävnad och utformade för att studera dessa celler in vitro saknas. Därför visar vi här hur man kan upprätta primära blandade gliaceller kulturer från vuxen mus ryggmärg.

Abstract

Det har väl accepterat att ryggmärgen gliaceller svar bidrar i hög grad till utvecklingen av neuropatisk smärta. Enorma information om gliaceller aktiviteter på cellulär och molekylär nivå har erhållits genom in vitro cellodlingssystem. De in vitro-system som används, omfattar huvudsakligen primära glia härledd från neonatal hjärna kortikal vävnad och odödliggjorda cellinjer. Dock kan dessa system inte speglar egenskaperna hos ryggmärgs gliaceller in vivo. För att ytterligare undersöka rollerna för ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av perifer nervskada inducerad neuropatisk smärta med ett odlingssystem som bättre speglar in vivo tillstånd, har vårt laboratorium utvecklat en metod för att fastställa primär ryggmärgs blandade gliaceller kulturer från vuxna möss. I korthet är ryggmärg in från vuxna möss och bearbetas genom papaindigestion följt av myelin avlägsnande med hålorhet-gradient medium. Enkelcellsuspensioner odlas i fullständigt Dulbeccos modifierade Eagle-medium (cDMEM) kompletterat med 2-merkaptoetanol (2-ME) vid 35,9 ° C Dessa odlingsbetingelser optimerades speciellt för tillväxten av blandade gliaceller. Under dessa betingelser, cellerna är redo att användas för experiment mellan 12-14 d (celler är vanligen i log-fasen under denna tid) efter upprättandet av kulturen (D 0) och kan hållas i odlingsbetingelser upp till D 21. detta odlingssystem kan användas för att undersöka svaren från ryggmärgs gliaceller vid stimulering med olika substanser och agenter. Förutom neuropatisk smärta, kan detta system användas för att studera gliaceller svar i andra sjukdomar som involverar patologiska förändringar av ryggmärgs gliaceller.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kronisk smärta är ett allvarligt hälsoproblem som drabbar cirka 100 miljoner vuxna i USA, med en uppskattad årlig kostnad på upp till $ 635.000.000.000 ett. Montera bevis har visat ett betydande bidrag av ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av neuropatisk smärta, en av de mest förödande typer av kronisk smärta 2. En riktig odling in vitro-systemet skulle bidra avsevärt under ytterligare undersöka rollerna för gliaceller på cellulär och molekylär nivå.

För närvarande är de in vitro-gliaceller kultursystem som används av forskare omfattar huvudsakligen gliaceller erhållna från kortikala vävnader från neonatala musen eller råtthjärnor och immortaliserade gliala cellinjer härledda från neonatal mus eller råtta primära gliaceller. Neonatala celler innehåller ett betydande antal odifferentierade celler som kan ytterligare differentieras till gliaceller (främst astrocyter och mikroglia), vilket ger enbundant celler för experimentell användning 3. Dock har vår tidigare studie visat att neonatal hjärn gliaceller svarade signifikant annorlunda än vuxna ryggmärgen gliaceller på lipopolysackarid (LPS) stimulering. Till exempel, interleukin (IL) -4 som visas förstärkt hämmande effekter på LPS-inducerad kväveoxid (NO) produktion i vuxen råtta ryggmärgen Glia jämfört med neonatal hjärna glia 4. Vidare profilerna av kemokinproduktion efter stimulering genom en neuropeptid, kalcitonin-gen-relaterad peptid (CGRP), är obestridligen olika mellan neonatal mushjärna glia (metoder som beskrivs i ref. 5) och vuxen mus ryggmärg glia (Figur 1). Etablerade cellinjer är lätta att använda och underhålla och kan ge ett stort antal celler i en kort tidsperiod. I allmänhet immortaliserade cellinjer genereras antingen med användning av ett virus-medierad immortalisering systemet (såsom utbredda microglial cellinje BV2) 6, 7 eller efter the identifiering av spontan transformation (såsom astrocyt cellinjen C8-D1A och microglial cellinje C8-B4) 8, 9 Cellinjer är utmärkta i att studera de molekylära egenskaperna hos astrocyter och mikroglia individuellt.; emellertid de resultat som erhållits från cellinjer kräver alltid ytterligare validering i primära celler eller i in vivo-betingelser. Det bör också noteras att det inte har funnits en rapport av en glia-cellinje som är härledd från en gnagare ryggmärgen glia.

Att hjälpa till att undersöka rollen av ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av neuropatisk smärta, ett kultursystem som är härledd från vuxen mus ryggmärg har utvecklats genom att anpassa en tidigare rapporterade metoden som används för att generera från vuxen råtta blandade gliaceller kulturer 4, 5 . musen ryggmärgen gliaceller kulturen ytterligare förfinas nyligen 10 och beskrivs mer detaljerat i den här artikeln. Vuxna ryggmärgen blandade gliaceller kulturer cen upprättas med en mus från utvalda stammar som passar behoven hos den särskilda studien, och celler kan upprätthållas i odling under upp till 21 d lägga initiering av kulturen. Denna metod kan användas i neuropatiska smärtstudier, samt i undersökningar av olika neurologiska sjukdomar som involverar patologiska förändringar i ryggmärgen, såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS), humant immunbristvirus (HIV) -associated sensorisk neuropati och multipel skleros (MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Följande protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of New England. Följande protokoll är för framställning av gliaceller kulturer från fyra vuxna mus ryggmärg.

1. Beredning av lösningar i en kultur Hood under aseptiska förhållanden

  1. Förbereda odlingsmedia: komplett Dulbeccos modifikation av Eagles medium (cDMEM) innehållande DMEM (med 4,5 g / L glukos), 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 lU / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin , 250 ng / ml amfotericin B, och 50 ^ M 2-merkaptoetanol (2-ME, se 1.1.1). Blanda och filtrera sterilisera alla andra komponenter och sedan lägga till FBS. Lagra odlingsmedia vid 4 ° C.
    1. Förbered 50 mM 2-ME / fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) stamlösning: tillsätt 100 | il av koncentrerad 2-ME (14,3 M) i 28,6 ml av 1 x PBS, och filtrera sterilisera (lösningen kan lagras vid 4 ° C i flera månader). Use 1 ml 2-ME stamlösning för varje 1000 ml odlingsmedia.
  2. Framställning av densitetsgradienten media
    1. Bered en stam isoton lösning densitetsgradient media (t.ex. 100% Percoll) från en del 10x vanlig steril PBS och 9 delar steril lager densitetsgradient media (t.ex. Percoll).
    2. Späd 100% densitetsgradient media (gjord i 1.2.1) med vanlig 1x steril PBS för att göra en 20% densitetsgradient media (t.ex. 10 ml 100% densitetsgradient media med 40 ml 1x PBS) och lagra den på fyra o C. Föra de 20% densitetsgradient media till rumstemperatur (RT) innan beredning av cellkulturen.
  3. Beredning av lösningar från papain dissociation systemet
    OBS! Papain dissociation systemet kan identifieras i materialtabellen. Andra liknande dissociation kit (inklusive de som monterade in-house) kan också användas. alla components måste vara sterila.
    1. Tillsätt 32 ml av Earles balanserade saltlösning (EBSS) till blandningen den ovomukoid-inhibitor (pulver).
    2. Tillsätt 5 ml EBSS till en papain flaskan (pulver). Placera papain flaska i en 37 ° C vattenbad i 10 min eller till dess att papain är upplöst.
    3. Tillsätt 500 l av EBSS till en DNas flaska (pulver). Blanda försiktigt.
    4. Tillsätt 250 mikroliter av den DNas-lösning (ovan) till papain flaskan.
    5. Beräkna den totala mängden av ovanstående papain / DNas blandning behövs (cirka 800 mikroliter av papain / DNas blandning per mus ryggmärg) och överföra den nödvändiga blandningen i en 50 ml rör för vävnads matsmältningen (steg 3,2). Förvara överblivna i originalflaskan vid 4 ° C under minst två veckor.
    6. Förvara alla komponenter ur satser på is tills det behövs.
  4. Förbereda ryggmärgsuppsamlingsrören: ett sterilt 15 ml rör med 5 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS; från papain dissociation systemet,0; för att samla ryggmärg) och en steril 15 ml rör med 1x PBS (för att fylla upp 5 ml spruta, se steg 2.4). Dessutom förbereda en steril petriskål (35 mm eller 60 mm) med 5 ml HBSS och förvara den i kulturen huva.

2. Ryggmärgs Collection

OBS: All utrustning måste vara sterila. Utför samlingen i ett visst område som godkänts av IACUC.

  1. Erhålla följande verktyg för skörd mus ryggmärg: raka skarpa / trubbiga 18 cm kirurgiska saxar, en 12-cm standard skalpell (# 3 fast), kolstål sterila skalpellblad # 10, ett litet djur Decapitator, 12 cm standard böjda pincett, och en steril 20G nål fäst vid en 5-ml spruta.
  2. Avliva djuret med CO2 och desinficera musen huvudet och det bakre området med 70% etanol (EtOH).
  3. Decapitate djur med Decapitator. Göra en mellersta längsgående snitt på nedre delen av ryggen för att exponera muskelskiktet. Göraen ren transection genom vertebrat kolonnen vid höftnivå (även skär genom muskelskiktet som täcker vertebrat-kolonn) med de sterila raka kirurgisk sax (18 cm).
  4. Placera djuret på ett ark av färsk engångsservett. Försiktigt in 20 G nål (fäst vid en 5 ml spruta fylld med sterilt 1x PBS (steg 1,4)) i ryggraden mot rostralt sidan. Håll djuret ordentligt och tryck på sprutan snabbt. Hela ryggmärgen skulle komma ut från livmoder änden. Samla ryggmärgen i 15 ml rör innehållande HBSS.
  5. Upprepa steg 2,4 för resten av mössen. Mellan varje djur, desinficera alla begagnade instrument med 70% EtOH.
    OBS: Normalt kan en enda 12-brunnar upprättas för varje fyra mus ryggmärg (se 4.3).

3. Beredning av den inre cellsuspensionen

Obs: Utför steg 3 och 4 i en kultur huva för att hålla allt sterilt.

  1. Överföra alla ryggmärg i HBSS innehållande petriskål (steg 1,4). Skär varje ryggmärgen i många fina, små stycken med steril sax och pincett. Överför ryggmärg till 50 ml koniska rör som innehåller den förberedda papain / DNas enzymblandning (steg 1.3.5) med hjälp av steril pincett eller en 10 ml pipett (undvika att lägga HBSS till enzymblandningen, eftersom detta kommer att ytterligare försvaga beredd enzymlösning och kan resultera i minskad prestanda av enzymet).
  2. Vortexa röret försiktigt för att blanda. Inkubera röret vid 37 ° C under 1 h i en inkubator / skakare med orbital skakning vid 150 rpm.
  3. Vortex röret igen och kraftfullt mal sönder enzymlösningen med vävnaden med hjälp av en 5 ml pipett för att främja ytterligare dissociation.
  4. Överför cellsuspensionen till ett 15-ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid RT.
  5. Under centrifugeringen, blanda 2,7 ml EBSS med 300 ul av rekonstituerad albumin ovomukoid inhibitor lösning (1.3.1) i ett sterilt rör. Tillsätt 150 mikroliter av den DNas-lösning (steg 1.3.3).
  6. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten med lösningen som framställts ovan (steg 3,5). Vortex väl att bryta cellpelleten.
  7. Tillsätt 3 ml rekonstituerat albumin ovomukoid inhibitor-lösning (steg 1.4.1) till cellsuspensionen. Centrifugera cellerna vid 70 xg under 6 min vid RT. Avlägsna supernatanten (som innehåller membran-fragment).

4. Ytterligare borttagning av myelin från den inre cellsuspensionen

  1. Lägga 8 ml 20% densitetsgradient media (framställd i steg 1.2.2) i röret som innehåller cellpelleten, vortex försiktigt för att störa pelleten, och centrifugera cellerna vid 800 xg under 30 min vid RT utan bromsning. Försiktigt bort det översta lagret av skräp (mestadels myelin) och supernatanten, men behålla pelleten.
  2. För att ta bort rester av densitetsgradienten, tvätta cellerna genom resuspending cellpelleten med 8 ml av en utspädd cDMEM (en del cDMEM och 2 delar HBSS). Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna igen med den utspädda cDMEM (ovan) på samma sätt. Håll cellerna på is tills sådd dem.
  3. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i odlingsmedier (cDMEM levereras med 2-ME (framställd i steg 1,1)). För en 12-brunnar, använd 3 ml x 4 (antal möss används) + 2 ml = 14 ml media. Detta kommer att säkerställa att det finns tillräcklig cellsuspension för hela plattan (12 brunnar) och kommer att ge extra brunnar som kan användas för att fastställa den genomsnittliga cellantalet per brunn och microglial innehållet i kulturen. Om andra typer av odlingskärl används, beräkna den totala volymen av nödvändig odlingsmedier proportionellt.
  4. Tillsätt 1 ml av cellsuspensionen i varje brunn i en 12-brunnars platta.
  5. Inkubera cellerna vid 35,9 ° C med 5% CO2.
  6. OBS: På dag 1, kan odlings innehåller signifikanta mängder av skräp på grund av återstoden myelin från ryggmärgen vävnad; således ändra media på dag 1 rekommenderas (se diskussionen för mer information). Kulturer är redo för behandling mellan D 12 - 14. Cellerna är vanligen 80% sammanflytande på D 12 och kan vara nära 100% sammanflytande av D 14. Typiskt, på D 12, finns det cirka 100 tusen celler per brunn i en 12-brunnar .

figur 4
Figur 2:. Bilderna av blandade gliaceller vid olika tidpunkter efter inrättandet av den blandade Glia kultur Primära ryggmärgs blandade glia bereddes från vuxna C57BL / 6 möss. representativa bildervisar utvecklingen av gliaceller kulturen efter plätering. Vid dag 1, är vissa celler fäst till odlingsplattan, men de är fortfarande mestadels runda. Det finns också många flytande celler och signifikant skräp. Vid dag 4, är majoriteten av cellerna fäst till odlingsplattan. Celler visas förgrenad med synliga processer. Celler sporadiskt distribueras och kulturer är ca 20-30% sammanflytande vid denna tidpunkt. Vid dag 8, kulturer är mellan 50-60% sammanflytande. Vissa delar av kulturer har stora fläckar av celler. Andra områden av kulturerna har gles tillväxten av celler. Vissa celler inom plåstren ta på en "fyrkantig-liknande" utseende. Vid dag 12, kulturer ligger på eller över 80% sammanflytande (ca 90% sammanflytande i bilden som visas här). Cell är i log-fas av tillväxt vid denna tid och mellan dagarna 12-14 är den optimala tiden för att använda dess gliaceller för experiment. Klicka Vänligen här för enstörre version av denna siffra.

  1. Undersök microglial innehåll med celler från de extra brunnar (steg 4,3) via standardfluorescensaktiverad cellsortering (FACS) färgningsprotokollet 11 med hjälp av en kombination av anti-mus-CD45 och anti-mus CD11b monoklonala antikroppar. CD45 + CD11b + celler identifieras som mikroglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna metod kan användas för att framställa blandade gliaceller från både möss och råttor. Det genomsnittliga totala antalet celler per brunn i en 12-brunnar på D 12 post-initiering av kulturen bör vara relativt stabil, med ungefär 100.000 celler per brunn när celler är härledda från mus ryggmärg. Gliaceller erhållna från denna metod kan användas i experiment som är utformade för att undersöka vuxna ryggmärgen gliaceller svar vid administrering av ämnen och agenter av intresse. Figur 3 ger ett exempel på cytokin och kemokin svar från ett typiskt experiment där vuxna ryggmärgen mikroglia erhölls från vuxna BALB / c-möss och behandlades med LPS (Salmonella Minnesota Re595) om D 13 post-initiering av kulturen. Supematanter samlades in 24 timmar efter LPS-behandling för bestämning av cytokin och kemokin nivåerna via en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) med användning av kommersiellt tillgänglig ile kit.

När denna vuxen gliaceller odlingssystem var först, inkuberades cellerna i ett standardodlingsmiljö vid 37 ° C Under detta tillstånd, den genomsnittliga microglial innehåll varierade mellan 5 - 10%. Emellertid konstaterades att trots användningen av konsekventa odlingstekniker, kulturer skulle i vissa fall har antingen mycket låg microglial innehåll (<2%) eller relativt hög microglial innehåll (15-20%) 10. Det kan vara frustrerande att få kulturer som har mycket få mikroglia när de experimentella resultaten är beroende av de mikrogliaceller svar inom den blandade kulturen. Efter förslag av Dr Alejandro MS Mayer (Institutionen för farmakologi, Chicago College of Osteopathic Medicine) 12, var den metod som modifierats genom att odla blandade gliaceller vid 35,9 ° C Detta resulterade i en mer konsekvent och högre microglial avkastning (varierar mellan 10-40% och resterande mestadels around 20%) inom de flesta kulturer. Denna förbättring visas i figur 4 Som tidigare rapporterats är mikroglia beräknas göra upp 5 -. 21% av CNS gliaceller befolkningen i vuxna möss 13-15. Även om båda odlingsbetingelser ge kulturer som innehåller liknande mängder mikroglia beräknade in vivo, är mer lämpligt för experiment där det är viktigt att undersöka svaren från både astrocyter och mikroglia den modifierade odlingsbetingelser (35,9 ° C).

Figur 1
Figur 1:. Kalcitonin Gene-relaterad peptid (CGRP) -inducerad kemokinproduktion av blandade Glial celler Blandade gliaceller framställda från neonatala BALB / c mus hjärnor (vänster) eller vuxen BALB / c mus ryggmärg (höger) behandlades med olika doser av CGRP. Nivåer flera kemokiner i odlingssupernatanter bestämdes via multiplex-analys (utförd av tillverkaren) vid optimala gånger (medelvärde ± SEM, n = 2-6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 3: cytokin- och kemokin svar av Mouse Adult ryggmärg Blandade Glia upon LPS Stimulering Adult ryggmärg blandade gliaceller framställdes från BALB / c-möss och stimulerades med olika doser av LPS.. Nivåer av IL-6 (A), tumörnekrosfaktor (TNF) -alfa (B), interferon-gamma-inducerbar protein 10 (IP-10, även känd som CXCL10) (C), och monocytkemoattraherande protein 1 (MCP- 1, även känd som CCL2) (D) i odlingssupernatanterna bestämdes via ELISA vid 24 timmar efter LPS-behandling.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Blandade gliaceller genererades från vuxna C57B6 / L möss och odlades vid antingen 37 ° C eller 35,9 ° C microglial innehåll hos vuxna Blandade Glial kulturer: Figur 4. Microglial innehåll varje kultur analyserades via flödescytometri med användning av APC-anti-mus-CD45 (klon 30-F11) och FITC-anti-mus-CD11b (klon M1 / ​​70). Representativa tomter från flödescytometrisk analyser visas. Den totala cellpopulationer från odlingarna identifierades i tomter A (37 ° C) och C (35,9 ° C), och mikrogliaceller populationer (CD45 + CD11b + celler) vidare isolerades från respektive totala cellpopulationer i B (37o C) och D (35,9 ° C). Flödescytometrisk analys utfördes och alla data analyserades som tidigare beskrivits 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det är viktigt att utföra alla steg-inklusive medierna förändras schema på ett konsekvent sätt i syfte att erhålla reproducerbara resultat mellan experiment. Följande steg är särskilt kritisk för att erhålla utmärkt kvalitet vuxen blandad glia.

Den enzymatiska nedbrytning är en viktig aspekt av detta protokoll. Det är avgörande att vävnaden bitar är väl-digererad för att erhålla en enkelcellsuspension. Dock kommer över matsmältning leda till betydligt färre celler. Varje laboratorium måste utföra pilottester för att fastställa den exakta koktiden baserat på de typer av flaskor som används för inkubation, den genomsnittliga vävnads använda mängden varje gång, och den typ av shaker (roterande kontra orbital shaker). Vidare, oberoende av papain dissociation som valts, är det viktigt att konsekvent använda samma komponenter från samma källor, som tillfällig ersättning av komponenter kan leda till betydande variationer i utbytetav det totala antalet celler.

I detta protokoll är myelin bort med hjälp av en densitetsgradient medium. Det är kritiskt för att göra och använda densitetsgradient lösningar vid RT eftersom densiteterna för dessa lösningar är temperaturkänslig. Densitetsgradient lösningar är vanligtvis lagras vid 4 ° C Om nödvändigt, kan densitetsgradienten lösningarna hållas vid RT över natten innan dagen för inrättandet av kulturen. Dessutom, efter 30 minuters centrifugering av celler i densitetsgradienten 20%, celler bör avlägsnas omedelbart från centrifugen för att undvika stora bitar av skräp från växling (dvs., rör sig bort från toppen av lösningen; se steg 4.1).

Det är viktigt att ta bort skräp på D ett inlägg initiering av kulturen. Även celler kommer att överleva och föröka sig om odlingsmedia byts varje 3-4 d, föränderliga medie på D 1 kommer att ge en mer "vilande" och "renare" kultur senare. Dettatillåter celler att växa i en mindre störd miljö, och celler kan hållas upp till 21 d post-initiering av kulturen.

Microglial innehåll för varje experiment kan undersökas innan du använder den blandade glia. Även med den mest konsekventa teknik kan microglial innehåll fortfarande varierar kraftigt mellan experiment. Vissa cellulära effekter är beroende av microglial innehåll 4, 10; därför är det viktigt att övervaka microglial innehållet i varje uppsättning av kulturer etablerade. Data som erhållits från denna praxis kan bidra till att tolka variationer mellan experiment, samt att tillhandahålla nya (ibland oväntade) kunskap om bidrag astrocyter kontra mikroglia enligt ett visst experimentellt tillstånd. Dessutom har säsongsbetingade variationer på microglial innehåll observerats. Detta kan vara en ytterligare faktor att beakta när man planerar stora uppsättningar av experiment. Dessutom medan neuroner vanligtvis inte överleva under vår kultur villkor,som Neun (en neuronal- markör) -positiva celler inte har observerats i våra gliaceller kulturer efter immunohistokemisk färgning, kan kulturen innehålla ett begränsat antal oligodendrocyter (detta har inte rutinmässigt kvantifierats). Man bör besluta om denna population behöver undersökas beroende på de specifika experimentella betingelser.

Som med många experimentella metoder, kan denna metod modifieras enligt behoven hos enskilda forskare. Det är viktigt att utföra pilotförsök för att till fullo testa specifika ändringar innan du använder dem regelbundet. Vidare bör det noteras att den blandade Glia kan användas för att erhålla mikroglia utarmade och mikroglia-berikade kulturer för att studera svaren av astrocyt-dominant kontra mikroglia-dominanta celler efter specifika stimuleringar, såsom tidigare beskrivits för neonatala blandade gliaceller 3, 4. emellertid kommer utbytet av mikroglia-berikade cellerna är begränsade om inte ett stort antal ryggradssladdar används för att fastställa kulturen i början. Detta är en begränsning hos denna metod, särskilt om möss används. När råtta ryggmärg används, kan en enskild ryggmärg (i stället för 4 mus ryggmärg) kan användas för att ställa in en 12-brunnar. Slutligen har microglial innehåll inte vara signifikant skillnad mellan mus och råtta vuxen ryggmärgs gliaceller kulturer 4, 5 både mus och råtta vuxen ryggmärgs gliaceller kulturer producerar en robust svar på LPS-stimulering i form av cytokin produktion. dock kan differentialsvar observeras när alternativa stimuli används.

Sammantaget ger detta gnagare vuxen gliaceller odlingssystemet en alternativ metod för att studera gliaceller in vitro. Resultat från denna kultur systemet närmare reflektera vad som skulle observeras under in vivo-förhållanden jämfört med resultat som erhållits från neonatala kulturer eller cellinjer. I den nuvarande metoden, gliaceller är collected från vuxna gnagare, som vuxen glia svara på stimuli mycket annorlunda jämfört med neonatal glia 4 (Figur 1). Cellerna inte manipuleras avsevärt genom immortalisering förfaranden, som skulle användas för att generera och bibehålla cellinjer. Även om denna metod utvecklades ursprungligen för att användas i neuropatiska smärtstudier, kan den användas för att studera andra neurologiska sjukdomar som involverar patologiska förändringar i ryggmärgen, såsom ALS och MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter