Introduction
दिल की विफलता के लिए एक जटिल नैदानिक सिंड्रोम, लक्षण है जो की थकान, श्वास कष्ट में शामिल हैं, असहिष्णुता व्यायाम, और परिधि के ऊतकों में तरल पदार्थ प्रतिधारण है। यह विकसित देशों 1 में मौत का प्रमुख कारण है। Sarcomere प्रोटीन या आयन चैनल 2 में परिवर्तन की वजह से विरासत में मिला कार्डियोमायोपैथी के अलावा, मायोकार्डियल रोग, उच्च रक्तचाप, वाल्वुलर हृदय रोग, मोटापा, मधुमेह और 3 सहित चिकित्सा की स्थिति की एक किस्म की वजह से हो सकता है। अपर्याप्त हृदय पंप क्षमता के दौरे संरचना, बिजली के चालन, और ऊर्जा चयापचय नेतृत्व में परिवर्तन संचार की मांग है, जो अंतत: दिल की विफलता 3,4 में यह परिणाम मिलते हैं। तंत्र दिल की विफलता अंतर्निहित की जांच, इसलिए, हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण है। आणविक दिल की विफलता प्रगति के लिए अग्रणी तंत्र की पहचान करना अंततः उपन्यास चिकित्सात्मक लक्ष्य या उपयोगी बायोमार्कर की खोज में सहायता कर सकते हैं
हृदय अतिवृद्धि और remodeling दिल की विफलता के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उच्च रक्तचाप से ग्रस्त हृदय रोग हृदय अतिवृद्धि और maladaptive remodeling मानव रोगियों 1 में देखा के प्रमुख योगदान कारक है। इन मानव की स्थिति की नकल करने के लिए, पशु मॉडल अक्सर सर्जिकल प्रक्रियाओं के माध्यम से स्थापित कर रहे हैं। विशेष रूप से, अनुप्रस्थ या उदर महाधमनी बाएं वेंट्रिकल, जो अंततः दिल में एक दबाव अधिभार की ओर जाता है के खिलाफ प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए constricted जा सकता है। यह घटना आमतौर पर परिणाम हृदय अतिवृद्धि में, cardiomyocytes के एक शारीरिक मुआवजा हृदय प्रणाली के कार्यात्मक मांग को पूरा करने के लिए। हालांकि, कार्यात्मक मांग सामान्य शारीरिक प्रतिपूरक तंत्र को ओवरराइड करता, हृदय फाइब्रोसिस और contrac के लिए अग्रणीटाइल परेशानी होती है। ट्रांसवर्स महाधमनी कसना (टीएसी) सर्जरी अक्सर thoracotomy, मैकेनिकल वेंटिलेशन, और थाइमस की जुदाई और वसा ऊतकों महाधमनी चाप से सहित जटिल प्रक्रियाओं, शामिल है। इसके विपरीत, उदर महाधमनी कसना सरल प्रयोगात्मक तकनीक 6-8 की आवश्यकता है। उदर महाधमनी, बाएँ और दाएँ गुर्दे धमनियों के बीच, सर्जरी के दौरान constricted है। हृदय अतिवृद्धि और remodeling उदर महाधमनी कसना सर्जरी 6-8 के बाद कई हफ्तों से मनाया जा सकता है; वे मजबूत उच्च रक्तचाप से ग्रस्त हृदय रोग अनुप्रस्थ महाधमनी कसना सर्जरी 9,10 द्वारा उत्पन्न कि इसी तरह का उत्पादन। यहाँ, हम एक कुशल, उच्च प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और न्यूनतम इनवेसिव विधि का उपयोग चूहों में उदर महाधमनी कसना संचालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। पेट गुर्दे धमनियों से सटे महाधमनी एक 0.72 मिमी पाश 4-0 रेशम धागा द्वारा गठित द्वारा constricted है। दस सप्ताह सर्जरी, हृदय अतिवृद्धि और remodelin के बादजी मनाया जा सकता है। उदर महाधमनी कसना प्रेरित हृदय अतिवृद्धि के चूहे मॉडल रोग तंत्र और pathophysiology, साथ ही संभावित चिकित्सा विज्ञान के विकास के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करता है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग करें, स्वास्थ्य के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रकाशित के लिए गाइड (एनआईएच प्रकाशन सं। 85-23, संशोधित 1996) के अनुसार आयोजित किया गया। इस प्रोटोकॉल के द्वारा और दिशा निर्देशों नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित के अनुसार अनुमोदित किया गया था।
1. पशु सर्जरी
- एक होनिंग पत्थर पर सुई की नोक blunting द्वारा एक 22 जी सिरिंज सुई तैयार करें। सरौता का उपयोग करना, एक सही कोण करने के लिए सुई मुड़ा।
- सर्जरी से पहले, आवश्यक सर्जिकल उपकरणों और सामग्री, साथ ही एक वसूली पिंजरे तैयार करते हैं। उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों और शल्य चिकित्सा की आपूर्ति आटोक्लेव।
- 200 ग्राम के आसपास चूहों को बनाए रखने और भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक नियंत्रित तापमान (21 ± 2 डिग्री सेल्सियस) पर 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत उन्हें रखने के लिए। प्रत्येक समूह में कम से कम 6 चूहों को शामिल करें। pentobarbital के साथ चूहों anesthetizeया किसी अन्य उपयुक्त संवेदनाहारी एजेंट (75 मिलीग्राम / 0.5 मिलीलीटर, आईपी में किलो)। पूंछ पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
नोट: पूंछ पलटा के अभाव पर्याप्त संज्ञाहरण का सूचक है। - लापरवाह स्थिति में एक चूहे एक हीटिंग पैड शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए के साथ एक शल्य चिकित्सा मंच पर रखें। एक पशु बाल क्लिपर और बाल पदच्युत लोशन के साथ चूहे के पेट क्षेत्र दाढ़ी शल्य संदूषण से बचने के लिए। betadine या अन्य सफाई अभिकर्मक सर्जरी से पहले साथ सफाई से मुंडा पेट रगडें।
नोट: यह प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। - एक छुरी के साथ पेट के midline के साथ एक 2 सेमी चीरा। सामान्य नमक का प्रयोग, सर्जरी के दौरान नम पेट अंग रखने के लिए। कपास गेंदों का उपयोग अवर रग Cava कि पीछे पेरिटोनियल क्षेत्र में झूठ का पर्दाफाश करने के पक्ष को ध्यान से पाचन अंगों विस्थापित। उदर महाधमनी, जिस पर करने के लिए juxtaposed और आमतौर पर झूठ को पहचानेंअवर रग Cava के छोड़ दिया है।
ध्यान दें: उदर महाधमनी पोत है कि दिल की दर के साथ समय में धड़कता है। - संदंश की एक जोड़ी के साथ पेरिटोनियम पियर्स के नीचे जहाजों को उजागर करने के लिए। धीरे उदर महाधमनी गुर्दे धमनियों से सटे अलग और सही के मूल और बाएं गुर्दे धमनियों के बीच उदर महाधमनी के नीचे एक 8 सेमी लंबे 4-0 रेशम सिवनी से गुजरती हैं।
- सीवन के साथ एक ढीला डबल गाँठ करें; एक 3 मिमी व्यास पाश छोड़ देते हैं, और लूप के अंदर पा और तुला 22 जी सुई जगह है। महाधमनी और सुई आसपास गाँठ कस, और फिर सुई निकालने के लिए तुरंत एक 0.7 मिमी व्यास कसना प्राप्त करने के लिए।
- 6-0 absorbable सीवन सामग्री के साथ उदर गुहा को बंद करें। सरल बाधित टांके के साथ मांसपेशियों या त्वचा चीरों सिवनी। संक्रमण को रोकने के लिए हाथ धोने के लिए एक आयोडीन मिलावट के साथ शल्य साइट।
- पशु सावधानी से निरीक्षण करें जब तक यह पर्याप्त चेतना आएगा, के रूप में मुक्त आवाजाही ने संकेतऔर भोजन का सेवन। एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। बाद सर्जरी दर्द को रोकने के लिए, एसिटामिनोफेन (0.5 मिलीलीटर में 300 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ चूहे का इलाज।
ध्यान दें: संस्थागत नीतियों ने मंजूरी दे दी उपयोगकर्ता दर्दनाशक दवाओं प्रशासन चाहिए।
2. ऊतक और रक्त नमूना संग्रह
- 10 सप्ताह के बाद सर्जरी में चूहे के वजन और (0.5 मिलीलीटर, आईपी में 75 मिलीग्राम / किग्रा) pentobarbital साथ यह anesthetize। सर्जरी से पहले, अपनी पूंछ पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। एक धातु ट्रे पर चूहे रखें।
- गर्दन एक छुरी का उपयोग कर के midline के साथ एक 2 सेमी चीरा। संदंश के साथ सावधानी से मांसपेशियों को विस्थापित श्वासनली बेनकाब करने के लिए। मन्या धमनियों, जो श्वासनली के समानांतर हैं और दिल की दर के साथ समय में धड़कना की पहचान करने के लिए सावधानी से निरीक्षण करें।
- EDTA के साथ लेपित एक रक्त एकत्रित ट्यूब में कैरोटिड धमनी से खून ले लीजिए। इसके तत्काल बाद सेंट्रीफ्यूज2,000 XG पर 15 मिनट के लिए रक्त और प्लाज्मा इकट्ठा। -80 में रक्त प्लाज्मा स्टोर डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत है।
- xyphoid प्रक्रिया के midline के आसपास वक्ष क्षेत्र में एक 5 सेमी चीरा। तेज संदंश के साथ डायाफ्राम पियर्स। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, कट और दिल को बेनकाब करने के लिए दोनों पक्षों पर मध्य हंसली तर्ज पर रिब पिंजरे को हटा दें। हृदय और संवहनी सीमाओं पर ध्यान से दिल आबकारी। ऊतक हथियाने के बिना धीरे दिल निकालें।
- छिड़काव सुई को महाधमनी ट्रंक बांधने से एक संशोधित Langendorff छिड़काव उपकरण पर दिल माउंट। क्रेब्स बफर के साथ दिल छिड़कना (युक्त 110 मिमी NaCl, 2.6 मिमी KCl, 1.2 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 1.2 मिमी MgSO 4, 25 मिमी 3 NaHCO, और 11 मिमी ग्लूकोज [7.4 पीएच]) खून बाहर धोने के लिए। दिल वजन और दिल के लिए वजन करने के लिए शरीर के वजन अनुपात की गणना। बर्फ पर 4% paraformaldehyde के साथ दिल को ठीक करें। एक मुखौटा पहनने के लिए, के बाद से paraformaldehyde वाष्प Tox है यादI C।
3. ऊतक फाइब्रोसिस मात्रा
- एक ऊतक सेक्शनिंग डिवाइस पर paraformaldehyde तय हृदय के ऊतकों की जगह और 2 मिमी मोटी वर्गों में कटौती। एक embedding कैसेट में ऊतक वर्गों रखें। वर्गीकृत शराब स्नान (50%, 75%, 95%, और 1 घंटा प्रत्येक के लिए 100%) की एक श्रृंखला के माध्यम से ऊतक निर्जलीकरण।
- 1 घंटे के लिए मोम में 1 घंटे के लिए xylene साथ ऊतक घुसपैठ और अंत में। घुसपैठ ऊतक एक embedding कैसेट में रखें और पैराफिन मोम के साथ एम्बेड। microtoming तक कमरे के तापमान पर पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड ऊतकों स्टोर।
- 4 माइक्रोन मोटी वर्गों में एम्बेडेड ऊतक स्लाइस। एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में वर्गों रखें। एक कोण पर नहाने के पानी में एक गिलास स्लाइड डुबकी और धीरे-धीरे आयल खंड किनारों दृष्टिकोण स्लाइड करने के लिए आंशिक कुर्की की अनुमति है।
- में स्लाइड ले जाएँ और स्नान से बाहर ऊतक धारा के तहत संभावित हवा जेब को दूर करने के लिए और बेहतर लगाव की सुविधा के लिए। सूखी टीवह 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड और उन्हें ऊतकीय धुंधला के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर।
- एक टैंक में स्लाइड रखो। 30 मिनट के लिए xylene के साथ स्लाइड Deparaffinize और और आसुत जल में अंत में (3 मिनट प्रत्येक के लिए 95%, 75%, और 50%) क्रमिक रूप से पतला शराब में यह rehydrate। पर्याप्त picrosirius लाल समाधान का प्रयोग पूरी तरह से 1 घंटे के लिए ऊतक वर्गों को कवर करने के लिए। दो परिवर्तन के लिए एक 0.5% एसिटिक एसिड के घोल में स्लाइड्स कुल्ला, और फिर पूर्ण शराब में दो rinses प्रदर्शन करते हैं।
- स्लाइड हवा शुष्क और एक coverslip के साथ सिंथेटिक राल में स्लाइड माउंट। एक दृश्य प्रकाश क्षेत्र में स्लाइड तस्वीर।
नोट: तस्वीर में लाल क्षेत्र 200X बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे एक picrosirius लाल सकारात्मक जोन से पता चलता है। कुल क्षेत्र है, जो फाइब्रोसिस 11 की हद तक इंगित करता खत्म picrosirius लाल सकारात्मक जोन के प्रतिशत की गणना।
4. रक्त ट्रोपोनिन मात्रा
- प्लाज्मा ट्रोपोनिन स्तर योंएक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) का उपयोग कर। दो प्रतियों में प्रत्येक नमूना परख। लोड रक्त प्लाज्मा के 50 μl और उचित कुओं में एक एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μl। प्लेट को सील करने और 400 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: प्लाज्मा में कार्डिएक ट्रोपोनिन हृदय की चोट के लिए एक मार्कर है। - तरल Aspirate और धोने बफर के 250 μl तीन बार के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धो लें। पिछले धोने के बाद, थाली पलटना और साफ कागज तौलिये के खिलाफ यह दाग अत्यधिक तरल हटा दें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से tetramethylbenzidine सब्सट्रेट के 100 μl जोड़ें और 400 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए सेते हैं। प्रत्येक अच्छी तरह से रोकने के समाधान के 100 μl जोड़ें। एक थाली प्रकार के बरतन पर थाली हिला 1 मिनट मिश्रण करने के लिए। 450 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) रिकॉर्ड।
ध्यान दें: ट्रोपोनिन एकाग्रता आयुध डिपो मूल्य के अनुपात में है।
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Representative Results
10 सप्ताह उदर महाधमनी कसना सर्जरी के बाद, जिसके परिणामस्वरूप हृदय विकृति विश्लेषण किया गया था। कार्डियक ऊतक विज्ञान शरीर के वजन को दिल वजन के अनुपात की गणना के द्वारा और दिल में कोलेजन की राशि का पता लगाने के द्वारा मापा गया था। कार्डिएक चोट प्लाज्मा हृदय ट्रोपोनिन एकाग्रता को मापने के द्वारा पुष्टि की गई।
जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, हृदय आकार के रूप में एक उच्च दिल के लिए वजन करने के लिए शरीर के वजन अनुपात (चित्रा 1 बी), हृदय अतिवृद्धि का सूचक द्वारा प्रदर्शन, उदर महाधमनी कसना सर्जरी के बाद बढ़ा दिया गया है। Picrosirius लाल धुंधला का उपयोग करके, fibrotic एक वृद्धि कोलेजन सामग्री (लाल) के साथ दाग मायोकार्डियम सामान्य क्षेत्रों (पीला, चित्रा 2) से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। ग की तुलना में कार्डिएक फाइब्रोसिस उदर महाधमनी कसना सर्जरी (चित्रा 2 बी) के बाद वृद्धि की गई थी ontrols (2A चित्रा)। परिणाम प्लाज्मा ट्रोपोनिन सांद्रता (चित्रा 3) के साथ सहसंबंधी। एक वृद्धि की ट्रोपोनिन एकाग्रता इंगित करता है कि दबाव अधिभार के दौरान हृदय remodeling और चोट हुई है। साथ में ले ली, स्पष्ट हृदय चोट में उदर महाधमनी कसना परिणाम, हृदय अतिवृद्धि, और ऊतक remodeling चिह्नित।
चित्रा 1:। दबाव अधिभार के दौरान हृदय अतिवृद्धि (ए) प्रतिनिधि दिल और (बी) के दिल के लिए वजन करने के लिए शरीर के वजन के अनुपात में 10 सप्ताह उदर महाधमनी कसना सर्जरी के बाद दिखाए जाते हैं। डेटा छह स्वतंत्र प्रदर्शन प्रयोगों के SEM मतलब ± प्रतिनिधित्व करते हैं। समूहों के बीच मतभेद छात्र की टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया। * पी <0.05 नियंत्रण बनाम। 8fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: दबाव अधिभार के दौरान कार्डिएक फाइब्रोसिस।
Picrosirius लाल धुंधला वृद्धि हुई कोलेजन अभिव्यक्ति का पता चला। (ए) प्रतिनिधि picrosirius लाल धुंधला (स्केल बार = 200 माइक्रोन) और (बी) के 10 सप्ताह उदर महाधमनी कसना सर्जरी के बाद fibrotic क्षेत्र का प्रतिशत। डेटा छह स्वतंत्र प्रदर्शन प्रयोगों के SEM मतलब ± प्रतिनिधित्व करते हैं। समूहों के बीच मतभेद छात्र की टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया। * पी <0.05 नियंत्रण बनाम। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
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चित्रा 3: दबाव अधिभार के दौरान कार्डिएक चोट।
रक्त प्लाज्मा ट्रोपोनिन सांद्रता 10 सप्ताह उदर महाधमनी कसना सर्जरी के बाद मापा गया। डेटा छह स्वतंत्र प्रदर्शन प्रयोगों के SEM मतलब ± प्रतिनिधित्व करते हैं। समूहों के बीच मतभेद छात्र की टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया। * पी <0.05 नियंत्रण बनाम। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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