Introduction
A insuficiência cardíaca é uma síndrome complexa clínica, cujos sintomas incluem fadiga, dispneia, intolerância ao exercício, e retenção de líquidos nos tecidos periféricos. É a principal causa de morte em países desenvolvidos 1. Além de cardiomiopatia hereditária causada por mutações em proteínas sarcômero ou canais iónicos 2, disfunção miocárdica pode ser causada por uma variedade de condições médicas, incluindo a hipertensão, doenças de coração valvular, obesidade, diabetes e 3. Mudanças na estrutura do miocárdio, condução elétrica, e chumbo metabolismo energético a capacidade inadequada de bombeamento cardíaco para atender às demandas do aparelho circulatório, que resulta em insuficiência cardíaca 3,4. Investigar os mecanismos subjacentes insuficiência cardíaca, portanto, é crítico no domínio da investigação cardiovascular. Identificando os mecanismos moleculares que conduzem à progressão da insuficiência cardíaca, eventualmente, pode auxiliar na identificação de novos alvos terapêuticos ou biomarcadores úteis
hipertrofia e remodelação cardíaca desempenha um papel crítico no desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Doença cardíaca hipertensiva é o fator de contribuição chave da hipertrofia cardíaca ea remodelação maladaptive visto em pacientes humanos 1. Para imitar essas condições humanas, os modelos animais são muitas vezes estabelecida através de procedimentos cirúrgicos. Em particular, a aorta abdominal transverso ou podem ser constrito para aumentar a resistência contra o ventrículo esquerdo, o que acaba por conduzir a uma sobrecarga de pressão no coração. Este fenómeno resulta geralmente em hipertrofia cardíaca, uma compensação fisiológica dos cardiomiócitos para satisfazer a exigência funcional do sistema cardiovascular. No entanto, a demanda funcional substitui os mecanismos compensatórios fisiológicas normais, levando a fibrose cardíaca e contraçãoimpairment telha. cirurgia transversal constrição aórtica (TAC) muitas vezes envolve procedimentos complicados, incluindo toracotomia, ventilação mecânica, e separação do timo e tecido adiposo do arco aórtico. Em contraste, a constrição da aorta abdominal mais simples requer técnicas experimentais 6-8. A aorta abdominal, entre a esquerda e artérias renais direita, é contraída durante a cirurgia. Hipertrofia e remodelação cardíaca pode ser observado várias semanas após a cirurgia abdominal aórtica constrição 6-8; eles produzem doença cardíaca hipertensa robusta semelhante à gerada pelo transversal cirurgia constrição da aorta 9,10. Aqui, descrevemos um protocolo para conduzir a constrição da aorta abdominal em ratos utilizando um método eficiente, altamente reprodutível e minimamente invasiva. A aorta abdominal adjacente às artérias renais é limitado por um circuito de 0,72 milímetros formado por um fio de seda 4-0. Dez semanas após a cirurgia, hipertrofia cardíaca e remodeling pode ser observada. O modelo de rato de hipertrofia cardíaca induzida por constrição da aorta abdominal fornece uma plataforma para o estudo de mecanismos da doença e fisiopatologia, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação no. 85-23, revista em 1996). Este protocolo foi aprovado e em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade Nacional de Taiwan.
1. Cirurgia animal
- Prepare um G agulha de seringa 22 por embotamento da ponta da agulha em uma pedra de afiar. Utilizando um alicate, plicate a agulha a um ângulo direito.
- Antes da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos necessários e materiais, bem como uma gaiola de recuperação. Autoclave todos os instrumentos e material cirúrgico antes do uso.
- Manter os ratos em torno de 200 g e mantê-los sob 12 h ciclo claro / escuro a uma temperatura controlada (21 ± 2 ° C), com livre acesso a comida e água. Incluir pelo menos 6 ratos em cada grupo. Anestesiar os ratos com pentobarbital(75 mg / kg em 0,5 ml, ip) ou um outro agente anestésico apropriado. Confirmar a profundidade da anestesia, testando o reflexo da cauda.
NOTA: A ausência do reflexo da cauda é um indicador de anestesia adequada. - Coloque um rato na posição supina sobre uma plataforma de cirurgia com uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo. Raspar a região abdominal do rato com um cortador de pêlos e cabelos loção removedor para evitar contaminações cirúrgicos. Esfregar o abdômen limpa raspada com betadine ou outro reagente de limpeza antes da cirurgia.
NOTA: É importante manter um campo esterilizado durante todo o procedimento. - Adicione de 2 cm da incisão ao longo da linha média do abdómen com um bisturi. Usando solução salina normal, manter o órgão abdominal úmida durante a cirurgia. Deslocar os órgãos digestivos cuidadosamente para o lado usando bolas de algodão para expor a veia cava inferior, que se situa na região peritoneal posterior. Identificar a aorta abdominal, que se encontra justaposta e, geralmente, sobre aesquerda da veia cava inferior.
NOTA: A aorta abdominal é o vaso que pulsa no tempo com o ritmo cardíaco. - Furar o peritônio com um par de fórceps para descobrir os vasos abaixo. Gentilmente isolar a aorta abdominal ao lado das artérias renais e passar a 8 cm de comprimento por 4-0 sutura de seda por baixo da aorta abdominal entre as origens do direito e artérias renal esquerda.
- Faça um nó duplo solto com a sutura; deixar um loop 3 mm de diâmetro e coloque a agulha 22 G embotada e dobrada dentro do loop. Apertar o nó em torno da aorta e da agulha, e em seguida, remover a agulha imediatamente para alcançar uma constrição diâmetro 0,7 mm.
- Fechar a cavidade abdominal com 6-0 material de sutura absorvível. Suturar o músculo ou da pele incisões com suturas interrompidas simples. Para prevenir a infecção, esfregue o local da cirurgia com uma tintura de iodo.
- Observar o animal com cuidado até que ele recupera a consciência suficiente, como indicado pela livre circulaçãoe ingestão de alimentos. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Para prevenir a dor pós-cirurgia, o tratamento de ratos com acetaminofeno (300 mg / kg em 0,5 ml, ip).
Nota: Os usuários devem administrar analgésicos conforme aprovado por políticas institucionais.
2. Tecidos e coleta de sangue
- No pós-operatório de 10 semanas, pesar o rato e anestesiar com pentobarbital (75 mg / kg em 0,5 ml, ip). Antes da cirurgia, confirmar a profundidade da anestesia, testando o seu reflexo cauda. Coloque o rato em uma bandeja de metal.
- Adicione de 2 cm da incisão ao longo da linha média do pescoço utilizando um bisturi. Deslocar os músculos cuidadosamente com uma pinça para expor a traqueia. Observe cuidadosamente para identificar as artérias carótidas, as quais são paralelas à traqueia e vibram no tempo com o ritmo cardíaco.
- Recolhe-se o sangue a partir da artéria carótida dentro de um tubo de recolha de sangue revestido com EDTA. imediatamente centrífugao sangue durante 15 minutos a 2000 xg e recolher o plasma. Armazenar o plasma do sangue a -80 ° C até ser necessário.
- Adicione 5 cm de incisão na região torácica, em torno da linha média do processo xifóide. Perfurar o diafragma com uma pinça afiada. Utilizando um par de tesouras, cortar e remover a caixa torácica ao longo das linhas médio-clavicular de ambos os lados para expor o coração. Extirpar o coração cuidadosamente ao longo das fronteiras cardíacas e vasculares. Retire o coração suavemente sem agarrar o tecido.
- Monte o coração em um aparelho de perfusão Langendorff modificado por amarrar o tronco da aorta para a agulha de perfusão. Perfundir o coração com tampão de Krebs (contendo NaCl 110 mM, KCl 2,6 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM de NaHCO 3, e glucose 11 mM [pH 7,4]) para lavar o sangue. Pese o coração e calcular a relação coração de peso-para-corpo-peso. Corrigir o coração com 4% de paraformaldeído, em gelo. Lembre-se de usar uma máscara, uma vez que o vapor paraformaldeído é toxic.
3. tecido fibroso Quantificação
- Colocar o tecido cardíaco fixo-paraformaldeído em um dispositivo de corte de tecido e cortado 2 mm de espessura. Coloque as secções de tecido em uma cassete de incorporação. Desidratar o tecido através de uma série de banhos de álcool graduado (50%, 75%, 95%, e 100% durante 1 h cada).
- Se infiltrar o tecido com xileno, durante 1 hora e finalmente em cera, durante 1 h. Coloque o tecido infiltrado numa cassete de incorporação e incorporar com cera de parafina. Armazenar os tecidos embebidos em blocos de parafina à temperatura ambiente até microtoming.
- Corte o tecido embebido em 4 mm de espessura. Coloque as secções em banho-maria 45 ºC. Mergulhar uma lâmina de vidro para o banho de água a um ângulo e gradualmente se aproxima das bordas parafina secção parcial para permitir a ligação à corrediça.
- Mova o controle deslizante dentro e fora do banho para remover bolsas de ar potenciais sob a secção de tecido e para facilitar uma melhor fixação. Dry tele desliza a 37 ºC durante 1 hora e armazená-los à temperatura ambiente durante coloração histológica.
- Coloque o slide em um tanque. Desparafinar o diapositivo com xileno durante 30 minutos e re-hidratar-o em álcool diluído sequencialmente (95%, 75%, e 50% durante 3 min cada) e finalmente com água destilada. Use solução vermelho de picrosirius suficiente para cobrir completamente as secções de tecido, durante 1 h. Lavar as lâminas em uma solução de ácido acético 0,5% para duas alterações, e depois executar duas lavagens em álcool absoluto.
- Ar seco o slide e montar o slide em resina sintética com uma lamela. Fotografar o slide em um campo de luz visível.
NOTA: A área vermelha na fotografia mostra uma zona positiva vermelho picrosirius sob um microscópio com ampliação de 200X. Calcular a percentagem da zona positiva vermelho de picrosirius sobre a área total, o que indica a extensão de fibrose 11.
4. Sangue troponina Quantificação
- Quantificar os níveis de troponina plasmausando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Ensaiar cada amostra em duplicado. Carga de 50 ul de plasma sanguíneo e de 50 ul de uma mistura de anticorpos nos poços apropriados. Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador de placas a 400 rpm.
NOTA: A troponina cardíaca no plasma é um marcador de lesão cardíaca. - Aspirar o líquido e lavar cada cavidade com 250 uL de tampão de lavagem três vezes. Após a última lavagem, inverter a placa e apagá-lo contra toalhas de papel limpo para remover o líquido em excesso.
- Adicionar 100 ul de substrato de tetrametilbenzidina a cada poço e incubar durante 10 min no escuro, num agitador de placas a 400 rpm. Adicionar 100 ul de solução de paragem a cada poço. Agitar a placa num agitador de placas durante 1 minuto para misturar. Grave a densidade óptica (OD) a 450 nm.
NOTA: A concentração de troponina é proporcional ao valor OD.
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Representative Results
10 semanas após a cirurgia a constrição da aorta abdominal, foi analisada a patologia cardíaca resultante. A histologia cardíaco foi medido através do cálculo da razão entre o peso do coração para o peso corporal e detectando a quantidade de colagénio no coração. lesão cardíaca foi confirmada pela medição da concentração plasmática troponina.
Como mostrado na Figura 1A, o tamanho cardíaco foi alargada após a cirurgia constrição da aorta abdominal, como demonstrado por uma maior taxa de coração-peso-para-peso corporal (Figura 1B), um indicador de hipertrofia cardíaca. Usando coloração vermelho picrosirius, miocárdio fibrótico coradas com um maior conteúdo de colágeno (vermelho) podem ser distinguidas das áreas normais (amarelo, Figura 2). A fibrose cardíaca foi aumentada após cirurgia abdominal constrição da aorta (Figura 2B) em relação ao C ONTROLOS (Figura 2A). Os resultados correlacionam-se com as concentrações de troponina de plasma (figura 3). Um aumento da concentração de troponina indica que a remodelação cardíaca e lesões durante sobrecarga de pressão ocorreu. Tomados em conjunto, aorta abdominal constrição resulta em lesão cardíaca evidente, marcada hipertrofia cardíaca ea remodelação do tecido.
Figura 1:. Rácios de hipertrofia cardíaca durante sobrecarga de pressão (A) coração Representante e (B) Coração de peso-para-peso corporal são mostradas 10 semanas após a cirurgia constrição da aorta abdominal. Os dados representam a média ± EPM de seis experiências independentes realizadas. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. * P <0,05 versus controlo. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fibrose cardíaca durante sobrecarga de pressão.
Picrossírius coloração vermelha revelou aumento da expressão de colágeno. (A) coloração com vermelho de picrosirius representativas (Barra de escala = 200 pm) e (B) percentagem de área de fibrose 10 semanas após a cirurgia a constrição da aorta abdominal. Os dados representam a média ± EPM de seis experiências independentes realizadas. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. * p <0,05 versus controlo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: lesão cardíaca durante sobrecarga de pressão.
As concentrações de troponina plasma do sangue foram medidos 10 semanas após a cirurgia constrição da aorta abdominal. Os dados representam a média ± EPM de seis experiências independentes realizadas. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. * p <0,05 versus controlo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
