Introduction
Hjertesvikt er en kompleks klinisk syndrom, symptomer som inkluderer tretthet, dyspné, mosjon intoleranse, og væskeansamling i perifere vev. Det er den ledende dødsårsaken i utviklede land 1. Bortsett fra arvet kardiomyopati forårsaket av mutasjoner i sarcomere proteiner eller ionekanaler 2, kan myokardial dysfunksjon være forårsaket av en rekke medisinske tilstander, inkludert hypertensjon, valvulære hjertesykdommer, fedme og diabetes 3. Endringer i hjerteinfarkt struktur, elektro ledning, og energiomsetningen fører til utilstrekkelig hjertepumpekapasitet til å møte sirkulasjons krav, som til slutt resulterer i hjertesvikt 3,4. Å undersøke mekanismene bak hjertesvikt, derfor, er kritisk innen hjerte-forskning. Identifisere molekylære mekanismer som fører til hjertesvikt progresjon kan eventuelt hjelpe til med oppdagelsen av nye terapeutiske mål eller nyttige biomarkører
Cardiac hypertrofi og ombygging spiller en avgjørende rolle i utviklingen av hjertesvikt. Hypertensiv hjertesykdom er nøkkelen medvirkende faktor for hjerte-hypertrofi og mistilpasset ombygging sett hos mennesker 1. For å etterligne disse menneskelige forhold, er dyremodeller ofte etablert gjennom kirurgiske prosedyrer. Spesielt kan den tverrgående eller abdominale aorta være innsnevret for å øke motstanden mot venstre ventrikkel, som til slutt fører til et trykk overbelastning på hjertet. Dette fenomenet resulterer vanligvis i hjertehypertrofi, til en fysiologisk erstatning av kardiomyocytter møte etterspørselen funksjonelle av det kardiovaskulære systemet. Men overstyrer den funksjonelle krav normale fysiologiske kompenserende mekanismer, som fører til hjerte fibrose og contracfliser nyrefunksjon. Tversgående aorta innsnevring (TAC) kirurgi omfatter ofte kompliserte prosedyrer, deriblant torakotomi, mekanisk ventilasjon, og separering av thymus og fettvev fra aortabuen. I motsetning til dette, krever abdominal aorta innsnevring enklere eksperimentelle teknikker 6-8. Den abdominale aorta, mellom de venstre og høyre nyrearteriene, er innsnevret under operasjonen. Kardial hypertrofi og remodellering kan observeres i flere uker etter den abdominale aorta innsnevringen kirurgi 6-8; de frembringer robuste hypertensiv hjertesykdom lik den som genereres av den tverrgående aorta innsnevring kirurgi 9,10. Her beskriver vi en protokoll for å utføre abdominal aorta innsnevring i rotter ved hjelp av en effektiv og svært reproduserbar, og minimalt-invasiv metode. Abdominal aorta ved siden av nyrearteriene blir innsnevret av en 0,72 mm sløyfe dannet av en 4-0 silketråd. Ti uker etter operasjonen, hjertehypertrofi og remodeling kan observeres. Rottemodellen av abdominal aorta snøring-indusert hjertehypertrofi tilveiebringer en plattform for å studere sykdomsmekanismer og patofysiologi, så vel som utvikling av potensielle terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, utgitt av det amerikanske National Institutes of Health (NIH publikasjon nr. 85-23, revidert 1996). Denne protokollen ble godkjent av og i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt av Institutional Animal Care og bruk komité ved National Taiwan University.
1. Animal Surgery
- Forbered en 22 G sprøytespissen av blunting tuppen av nålen på en honing stein. Med en tang, plicate nålen til en rett vinkel.
- Før operasjonen, forberede de nødvendige kirurgiske instrumenter og materialer, samt en bedring bur. Autoklav alle instrumenter og kirurgiske forsyninger før bruk.
- Opprettholde rottene rundt 200 g og holde dem under 12 timers lys / mørke sykluser ved en kontrollert temperatur (21 ± 2 ° C) med fri tilgang til mat og vann. Ta med minst 6 rotter i hver gruppe. Anesthetize rottene med pentobarbital(75 mg / kg i 0,5 ml, ip) eller en annen egnet anestesimiddel. Bekrefte anestesidybden ved å teste halen refleks.
MERK: Fraværet av hale refleks er en indikator på tilstrekkelig anestesi. - Plasser en rotte i liggende stilling på en operasjon plattform med en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen. Barbere mageregionen av rotte med et dyr hårklipper og hår remover lotion for å unngå kirurgiske forurensninger. Skrubb ren barbert underliv med Betadine eller annen rensing reagent før operasjonen.
MERK: Det er viktig å opprettholde et sterilt felt gjennom hele prosedyren. - Foreta en 2 cm snitt langs midtlinjen av buken med en skalpell. Ved hjelp av fysiologisk saltvann, holde abdominal organ fuktig under operasjonen. Fortrenge fordøyelsesorganer nøye til side ved hjelp av bomull baller å eksponere vena cava inferior som ligger i bakre peritoneal regionen. Identifisere den abdominale aorta som ligger sidestilt til og vanligvis påvenstre av den nedre vena cava.
MERK: abdominal aorta er fartøyet som pulserer i takt med pulsen. - Pierce peritoneum med en pinsett til å avdekke fartøyene under. isolere forsiktig abdominal aorta ved siden av nyrearteriene og bestå en 8 cm lang 4-0 silke sutur under abdominal aorta mellom opprinnelsen til høyre og venstre nyrearteriene.
- Lag en løs dobbel knute med sutur; la en løkke diameter 3 mm, og plasser avstumpet og bøyd 22 G nål inne i loopen. Stram knuten rundt aorta og nålen, og deretter fjerne nålen umiddelbart for å oppnå en innsnevring diameter 0,7 mm.
- Lukk bukhulen med 6-0 absorberbare sutur materiale. Suturer muskel eller hud snitt med enkle avbrutte suturer. For å hindre smitte, skrubbe operasjonsstedet med en jod skjær.
- Observere dyret forsiktig til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet, som indikert av fri bevegelighetog matinntak. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. For å forhindre post-kirurgi smerte, behandle rotte med paracetamol (300 mg / kg i 0,5 ml, ip).
MERK: Brukere bør administrere smertestillende som er godkjent av institusjonelle politikk.
2. Tissue og blodprøvetakning
- På 10 uker etter kirurgi, veie rotte og bedøve den med pentobarbital (75 mg / kg i 0,5 ml, IP). Før operasjonen, bekrefter anestesidybden ved å teste sin hale refleks. Plasser rotte på et metall brett.
- Foreta en 2 cm snitt langs midtlinjen av halsen ved hjelp av en skalpell. Fortrenge musklene forsiktig med pinsett for å avsløre luftrøret. Overholdes nøyaktig for å identifisere halspulsårene, som er parallelle med luftrøret og pulserer i takt med hjerterytmen.
- Samle blod fra karotidarterien inn i en blodoppsamlingsrøret er belagt med EDTA. umiddelbart sentrifugeblod i 15 minutter ved 2000 xg og samle plasma. Oppbevar blodplasma ved -80 ° C inntil behov.
- Lag en 5 cm innsnitt i thorax-regionen, rundt midtlinjen av xyphoid prosessen. Pierce membranen med skarpe tang. Ved hjelp av en saks, klippe og fjerne brystkassen langs midt clavicula linjer på begge sider for å avsløre hjertet. Skjære hjertet forsiktig langs hjerte- og kar grenser. Ta hjertet forsiktig uten å gripe tak i vev.
- Monter hjerte på en modifisert Langendorff perfusjon apparat ved å knytte den aortic stammen til perfusjon nålen. Perfuse hjertet med Krebs-buffer (inneholdende 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM KH 2PO 4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 og 11 mM glukose [pH 7,4]) å vaske ut blodet. Vei hjertet og beregne hjerte vekt-til-kroppen-vekt-forhold. Fest hjerte med 4% paraformaldehyde på isen. Husk å ha på seg en maske, siden paraformaldehyde damp er toxic.
3. Tissue Fibrose Kvantifisering
- Plasser Paraformaldehyde-fast hjertevevet på en vev seksjonering enhet og kutte 2 mm tykke seksjoner. Plasser vevet seksjoner i en embedding kassett. Dehydrere vevet gjennom en serie av gradert alkohol bad (50%, 75%, 95% og 100% i 1 time hver).
- Infiltrere vev med xylen i 1 time og til slutt i voks i 1 time. Plasser infiltrert vevet inn i en embedding kassett og legge inn med parafinvoks. Oppbevar den innebygde vev i parafinblokker ved romtemperatur inntil microtoming.
- Skjær den innebygde vevet inn i 4 mikrometer tykke seksjoner. Plasser delene i en 45 ºC vannbad. Dypp et glass lysbilde i vannbad i en vinkel og gradvis nærme seg parafin delen kantene for å tillate delvis tilknytning til raset.
- Flytt gli inn og ut av badekaret for å fjerne eventuelle luftlommer under vev delen og legge til rette for bedre feste. Dry tHan glir ved 37 ºC i 1 time og lagre dem i romtemperatur for histologisk farging.
- Sett lysbilde i en tank. Deparaffinize sleiden med xylen i 30 min og rehydrere det i rekkefølge fortynnet alkohol (95%, 75% og 50% for 3 minutter hver), og endelig i destillert vann. Bruk tilstrekkelig picrosirius rød løsning å fullstendig dekke vevsdelene for en time. Skyll lysbildene i en 0,5% eddiksyreløsning for to endringer, og deretter utføre to skyllinger i absolutt alkohol.
- Lufttørk lysbildet og montere raset i syntetisk harpiks med et dekkglass. Fotografere lysbilde i en synlig lys felt.
MERK: Det røde området på bildet viser en picrosirius rød positiv sone under et mikroskop ved 200X forstørrelse. Beregn prosentandelen av picrosirius rød positiv sone over det totale areal, noe som indikerer graden av fibrose 11.
4. Blood troponin Kvantifisering
- Kvantifisere plasma troponin nivåerved hjelp av en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Analysen hver prøve i duplikat. Belastning 50 ul blodplasma og 50 ul av et antistoff cocktail i de dertil bestemte brønner. Tett plate og inkuberes i 1 time ved romtemperatur på en plate rister ved 400 rpm.
MERK: Cardiac troponin i plasma er en markør for hjerteskade. - Aspirer og vask flytende hver brønn med 250 ul vaskebuffer tre ganger. Etter siste vask, snu platen og tørk den mot rene papirhåndklær for å fjerne overdreven væske.
- Tilsett 100 ul av tetrametylbenzidin substrat til hver brønn og inkuber i 10 min i mørket på en plate rister ved 400 rpm. Tilsett 100 stopp løsning til hver brønn. Rist platen på en platerister i 1 min for å blande. Ta opp den optiske densitet (OD) ved 450 nm.
MERK: troponin konsentrasjon er i forhold til OD-verdien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 uker etter den abdominale aorta innsnevring kirurgi, ble det resulterende hjerte patologi analysert. Kardiale histologi ble målt ved å beregne forholdet mellom hjertevekt til kroppsvekt og ved detektering av mengden av kollagen i hjerte. Cardiac skade ble bekreftet ved å måle plasma cardiac troponin konsentrasjon.
Som vist i figur 1A, ble hjertestørrelsen forstørres etter abdominal aorta innsnevring kirurgi, som vist ved et høyere hjerte-vekt-til-kroppsvektforhold (figur 1B), en indikator på hjertehypertrofi. Ved å bruke picrosirius røde flekker, kan fibrotisk myokard farget med et økt innhold av kollagen (rød) skilles fra normale områder (gul, figur 2). Cardiac fibrose ble øket etter abdominal aorta innsnevring kirurgi (figur 2B) sammenlignet med c ontrols (Figur 2A). Resultatene korrelerer med plasma troponin konsentrasjoner (figur 3). En økt troponin konsentrasjon indikerer at hjerte- ombygging og skade under press overbelastning har oppstått. Til sammen mage aorta innsnevring resulterer i tydelig hjerteskade, merket hjertehypertrofi, og vev ombygging.
Figur 1:. Cardiac Hypertrofi under Pressure Overload (A) Representant hjerte og (B) hjerte-vekt-til-kroppsvektforhold er vist 10 uker etter abdominal aortic innsnevring kirurgi. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av seks uavhengige eksperimenter utført. Forskjeller mellom grupper ble vurdert av t-test. * P <0,05 versus kontroll. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Cardiac fibrose under Pressure Load.
Picrosirius røde flekker avslørt økt kollagen uttrykk. (A) Representative picrosirius rød farging (Skala bar = 200 pm) og (B) i prosent av fibrotisk område 10 uker etter abdominal aorta innsnevring kirurgi. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av seks uavhengige eksperimenter utført. Forskjeller mellom grupper ble vurdert av t-test. * p <0,05 versus kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
s / ftp_upload / 54818 / 54818fig3.jpg "/>
Figur 3: Cardiac skade under Pressure Load.
Blodplasma troponin konsentrasjoner ble målt 10 uker etter abdominal aortic innsnevring kirurgi. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av seks uavhengige eksperimenter utført. Forskjeller mellom grupper ble vurdert av t-test. * p <0,05 versus kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
