Introduction
心脏衰竭是一种复杂的临床综合征，其中包括疲劳，呼吸困难症状，运动耐受力，和体液潴留在外围组织。它是死亡的发达国家1的首要原因。除了引起的肌节蛋白质或离子通道2突变遗传性心肌病，心肌功能障碍可以通过各种医学病症，包括高血压，心脏瓣膜疾病，肥胖和糖尿病3引起的。在心肌结构，电传导，和能量代谢导致心脏泵送能力不足的变化，以满足循环的要求，最终导致心脏衰竭3,4。调查心脏衰竭背后的机制，因此，是在心血管领域的研究非常重要。识别导致心脏衰竭恶化的分子机制，最终可以帮助在新的治疗目标的或有用的生物标记物的发现
心脏肥大和重塑起着心脏衰竭的发展中起关键作用。高血压心脏疾病是心肌肥厚和人类患者1所示的适应不良重塑的关键因素。模仿这些人类的条件下，动物模型通常通过外科手术成立。特别是，在横向或腹主动脉可以收缩，以增加对左心室，这最终导致在心脏的压力超负荷的阻力。这种现象通常导致心脏肥大，心肌细胞的一生理补偿，以满足对心血管系统的功能需求。然而，功能需求覆盖了正常的生理代偿机制，导致心肌纤维化和承包商瓷砖损害。横向主动脉缩窄（TAC）手术往往涉及复杂的程序，包括开胸，机械通气和胸腺分离和脂肪组织从主动脉弓。相比之下，腹主动脉缩窄，需要简单的实验技术6-8。腹主动脉，在左右肾动脉之间，是在手术过程中收缩。心肌肥厚和重塑可在腹主动脉缩窄手术后6-8可以观察到几个星期;它们产生类似于由横向主动脉缩窄术9,10-生成健壮高血压心脏疾病。在这里，我们描述了一种协议使用高效的，高度可再现的，和微创方法大鼠进行腹主动脉缩窄。邻近肾动脉腹主动脉通过由4-0丝线形成的0.72毫米环收缩。手术，心脏肥大和remodelin十周后g的被观察到。腹主动脉缩窄致心肌肥大的大鼠模型为研究疾病机理与病理生理学，以及潜在疗法的发展平台。
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Protocol
所有的动物实验均按照指南实验动物的护理和使用，卫生的美国国立卫生研究院公布（NIH公开号85-23，1996年修订）进行。该协议被批准，并按照规定设置的机构动物护理和使用委员会台大的准则。
1.动物手术
- 通过钝的针尖上的珩磨石制备22克的注射器针头。使用钳子，折扇针直角。
- 手术前，准备所需的手术器械和材料，以及作为恢复笼。使用前高压灭菌所有仪器和手术用品。
- 维持约200克老鼠，并让他们在12小时亮/暗周期在控制温度（21±2℃），免费获得食物和水。包括至少6只大鼠各组中使用。麻醉戊巴比妥大鼠（75毫克/公斤0.5毫升，IP）或另一种适当的麻醉剂。通过测试尾反射确认麻醉深度。
注意：没有尾反射的是充足的麻醉的一个指标。 - 将在仰卧位老鼠在手术平台，加热垫，以保持体温。剃鼠的腹部区域与动物毛发推剪和毛发去除洗剂，以避免手术污染。擦洗优碘或手术之前，另一个清洁剂的干净剃光腹部。
注：保持整个过程中的无菌场是很重要的。 - 使沿着用手术刀腹部中线2厘米的切口。在手术过程中使用生理盐水，保持腹腔脏器湿润。仔细置换消化器官用棉球，以暴露下腔静脉即位于后腹膜区域的一侧。识别腹主动脉，其位于并列并通常在离开下腔静脉。
注：腹主动脉是在时间上与心脏速率脉动容器中。 - 刺破腹膜一双镊子到下面揭露的船只。轻轻隔离邻近肾动脉的腹部大动脉，并传递一个8厘米长的4-0丝线缝合右侧的起源和左肾动脉之间的腹主动脉下方。
- 请用缝线一个松散的双结;留3毫米直径的环形，并放置迟钝和弯曲22克针在循环内。拧紧围绕主动脉和针的结，然后立刻取出针达到0.7毫米直径的收缩。
- 用6-0可吸收缝合线材料关闭腹腔。缝合肌肉或皮肤切口，用简单的间断缝合。为了防止感染，擦洗手术部位用碘酒。
- 仔细观察动物，直到它重新获得足够的意识，通过自由移动指示和食物摄取。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。以防止手术后的疼痛，治疗与对乙酰氨基酚（于0.5ml 300毫克/千克，IP）的大鼠。
注：用户应给予止痛药批准的体制政策。
2.组织和血液样品采集
- 10周手术后，称重大鼠并（0.5毫升，IP 75毫克/千克）用戊巴比妥麻醉它。手术前，通过测试其尾部反射确认麻醉深度。放置鼠上的金属托盘。
- 使沿使用手术刀颈部的中线2厘米的切口。仔细取代肌肉用钳子暴露气管。仔细观察，以确定在颈动脉，其中平行于气管和在时间上与心脏速率脉动。
- 收集从颈动脉血液进入涂有EDTA的血液收集管。立时离心机血在2000 XG 15分钟，收集血浆。直到需要在-80存储血浆℃。
- 使5厘米的切口在胸部区域，围绕xyphoid过程的中线。皮尔斯锋利的钳隔膜。使用剪刀，切割和去除肋骨沿两侧中期锁骨线暴露心脏。仔细切除的心脏沿心脏和血管的边界。不抓组织轻轻取出心脏。
- 通过捆绑主动脉树干灌注针安装在修改后的Langendorff灌流心脏。灌注用Krebs缓冲液的心脏（含有110 mM氯化钠，2.6毫摩尔的KCl，1.2毫摩尔KH 2 PO 4，1.2毫硫酸镁 ，25mM的碳酸氢钠 ，和11毫米的葡萄糖[pH为7.4]）洗出血液。权衡的心脏，并计算心脏重量到身体重量比。修正了冰4％多聚甲醛的心脏。记得要戴口罩，因为水蒸气多聚甲醛是TOX我知道了。
3.组织纤维化定量
- 将组织切片设备上的多聚甲醛固定的心脏组织，切2mm厚的部分。放置的组织切片中的包埋盒。通过一系列梯度乙醇浴（50％，75％，95％，并且对于每个1小时100％）的脱水的组织。
- 渗透用二甲苯组织1小时，最后在蜡1小时。放置渗透组织成一个包埋盒和石蜡嵌入。储存在室温下石蜡块的包埋组织直到显微切片。
- 切片包埋组织成4微米厚的切片。放置在部分45ºC水浴。以一个角度浸载玻片放入水浴中，并逐渐接近石蜡切片边缘，以允许部分附着到滑动。
- 移动滑动进出浴下的组织切片去除潜在的气穴，并促进更好附件。干ŧ他滑动在37ºC1小时，并将其在室温下储存用于组织学染色。
- 把滑入的槽。 Deparaffinize用二甲苯滑动30分钟，并在顺序地稀释酒精再水合它（95％，75％和50％对每个3分钟）和最后在蒸馏水中。使用足够天狼猩红溶液完全覆盖组织切片1小时。冲洗在0.5％的乙酸溶液的幻灯片两个变化，然后在无水乙醇执行两个漂洗。
- 风干载玻片和盖玻片安装在合成树脂的幻灯片。照片在可见光领域的幻灯片。
注：红色区域中的照片显示了在200倍显微镜下天狼猩红正面区域。计算天狼猩红正面区域超过总面积，这表明纤维化11的程度的百分比。
4.血肌钙蛋白定量
- 量化血浆肌钙蛋白水平使用酶联免疫吸附测定（ELISA）。测定一式两份每个样品。负载血浆的50微升和50微升的抗体鸡尾酒到适当孔中。密封该板，并在400rpm在室温下孵育1小时在板振荡器上。
注：在血浆中心脏肌钙蛋白是心肌损伤的标记物。 - 吸出液体，并用250微升洗涤缓冲液三次洗每个孔中。最后一次洗涤后，翻转板吸干对清洁纸巾除去多余的液体。
- 加入100μl四甲基联苯胺底物至每孔，并孵育在黑暗中10分钟上以400rpm板振荡器。加入100微升终止液到每个孔中。摇板振荡器上在板1分钟以混合。记录450nm处的光密度（OD）。
注：肌钙蛋白浓度是成比例的OD值。
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Representative Results
腹主动脉缩窄手术10周后，将得到的心肌病理分析。心脏组织学是通过计算心脏重量的体重的比率，并通过在心脏检测胶原蛋白的量来测量。心脏损伤，通过测定血浆心肌肌钙蛋白浓度证实。
如在图1A中所示，心脏大小腹主动脉缩窄手术后放大，由更高心脏重量到体重比（ 图1B），心脏肥大的指标作为证明。通过使用苦味酸天狼猩红染色，具有增加的胶原含量（红色）染色的纤维变性心肌可以从正常区域（黄色， 图2）来区分。心脏纤维化相比至c腹主动脉缩窄术（ 图2B）后增加 ontrols（ 图2A）。结果关联与血浆肌钙蛋白浓度（ 图3）。增加的肌钙蛋白浓度表明压力超负荷时心肌重塑和伤害已经发生。综合来看，明显的心肌损伤腹主动脉缩窄结果，标志着心肌肥厚和组织重塑。
图 1： 压力超负荷时心肌肥厚 （A）代表心脏和（B）心脏重量与车身重量比是腹主动脉缩窄手术10周后显示。数据代表平均值±进行六个独立实验的SEM。组之间的差异是由学生t检验评估。 * P <0.05相对于对照。 8fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2： 压力超负荷时心肌纤维化。
天狼星红染色显示增加胶原蛋白的表达。 （A）的代表性的天狼猩红染色（比例尺= 200微米）和（B）腹主动脉缩窄手术10周后的纤维化面积的百分比。数据代表平均值±进行六个独立实验的SEM。组之间的差异是由学生t检验评估。 * P <0.05与控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3： 压力超负荷时心脏损伤。
血浆肌钙蛋白浓度腹主动脉缩窄手术10周后测量。数据代表平均值±进行六个独立实验的SEM。组之间的差异是由学生t检验评估。 * P <0.05与控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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