チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Abstract

バイオフィルムは、自己分泌マトリックスに包まれた細菌のグループで構成されています。彼らは、工業汚染だけでなく、多くの健康に関連する感染症の発症と持続に重要な役割を果たしています。ヒトの疾患の中で最もよく説明し、研究バイオフィルムの一つは、嚢胞性線維症患者の慢性肺感染症で発生します。ホストのコンテキストでバイオフィルムを研究すると、多くの要因は、バイオフィルム形成と発展に影響を与えることができます。宿主因子はバイオフィルムの形成及び発達に影響を与えることができる方法を同定するために、我々は、痰上清の形で宿主由来因子の存在下でバイオフィルムを成長させるために、静的チェンカバーガラスの方法を使用しました。細菌は、チャンバーに播種し、痰ろ液にさらされています。成長の48時間後に、バイオフィルムは、共焦点顕微鏡および分析の前に商業バイオフィルムの生存率キットで染色されています。画像取得後、バイオフィルムの特性は、異なるソフトウェア・プラットフォームを用いて評価することができます。この方法は、私たちは、抗生物質などの異なる物質の存在下でのバイオフィルムの成長の重要な特性を視覚化することができます。

Introduction

細菌バイオフィルムは、互いに結合し、自己分泌マトリックスに包まれている微生物の基です。 ^1,2古典的には、それらが物理的に流れの条件の下で形成された非生物または生物の表面に付着した細菌を表します。バイオフィルムはまた、試験管内で形成された熱プールまたはペリクルの空気 - 液体界面でのような表面からの静的条件（流れの欠如）および遠位で成長することが示されています。これらのバイオフィルムは、長い環境で認識され、彼らは生物付着、腐食や閉塞が生じ、貯水池内またはパイプで形成することができるよう、産業プロセスへの主要な不利益であるされています。 ^3,4

彼らはカテーテル関連感染症、嚢胞性線維症の患者では、だけでなく、多数の他の感染症における肺感染症に関与することが示されているようにバイオフィルムは、また、医療現場で重要です。 ^5,6バイオフィルム感染症の特徴の一つは、デです抗生物質に対する細菌の感受性を折り目と自然免疫系によるクリアランスを損ないます。バイオフィルムベースの感染を伴う^7-9で最もよく研究され、臨床的に関連するシナリオが慢性的に緑膿菌バイオフィルムに感染している嚢胞性線維症（CF）の患者に起こります。 緑膿菌は、それが非常に困難治療することを可能にする慢性感染症の確立中に変更の数を受けることができます。 ^10,11バイオフィルムは、示差的に先天性免疫を活性化し、炎症を駆動することができます。 ^12-14これらの感染症は、CF患者において増加罹患率および死亡率につながるように、この文脈では、バイオフィルム発達に影響を与えることができる因子を理解することが重要です。

最近の研究は、宿主因子が緑膿菌バイオフィルムの凝集体の形成に重要であることを示唆しています。 ¹⁵これらのバイオフィルムは、抗生物質および宿主防御機構に対する感受性の低下に貢献しています。 presaの複数形CF肺中に存在する微生物から、このような好中球エラスターゼなどの宿主由来因子、ならびに分泌物のNCEは、大幅にバイオフィルム形成と発展を調節する可能性を秘めています。 ^16はまた、バイオフィルムは、多数の経路の発現を調節し、炎症を開始するためにホストと対話します。標準的なクリスタルバイオレットアッセイ等のハイスループット方法が、バイオフィルムの処理に関していくつかの情報を提供することができ、これらの因子に応答したバイオフィルムの可視化は、より詳細な情報を提供します。

本稿では、 インビトロでのバイオフィルムの発達を研究するためにCF患者の痰からの係数を使用する方法を記載しています。この方法は、市販のバイオフィルムの生存率キットを使用して痰を含む宿主因子に曝露されたバイオフィルムの迅速な可視化を可能にします。この技術は、視覚的にexogenoの存在下でのバイオフィルムの成長中に発生する変化を同定するために使用され得ます私たちの製品、および様々な条件下でのバイオフィルムの開発の変化を分析するための改良された方法を表しています。

Protocol

研究倫理委員会（REB）は、ヒト被験者から痰サンプルを収集し、保存するために必要なことに注意してください。これらの研究は、病気の子供REBの＃1000019444のために病院によって承認されました。

1.準備CF痰試料

1. 嚢胞性線維症の診療所へのルーチンの訪問中に、患者からの痰のサンプルを収集し、氷上に保ちます。
2. 処理を受けるために、研究室に、コレクションの最初の一時間以内に氷上に喀痰試料を輸送。

2.喀痰処理

1. 得られた痰試料の体積を記録します。サンプル（ すなわち、2部PBS、1部の試料）の体積を2倍のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。
2. トランスファーピペットでよくサンプルを混ぜます。 1分が完全に混合するための最高の設定にボルテックスのサンプルを。
3. 適切な数の1.5ミリリットルのマイクロチューブに小分けし、上記混合物の1ミリリットルをし、5,000×gでスピンダウン4℃で20分間。
4. 遠心分離後、上清を除去し、ペレットを捨てます。
5. フィルタは、0.22μmフィルターを通して上清を殺菌し、清潔なマイクロ遠心チューブに集めます。
   注：ろ液の無菌性は、LB寒天上にプレーティングし、液体培地に接種することによってテストされています。
6. 将来の使用のために-80℃で痰上清を保管してください。
   注：複数の患者からの喀痰もろ過以下のプールすることができます。
7. 使用前に、所望のメディアに喀痰ろ液1/10 V / V（痰を100μl、メディアの900μl）を希釈します。
   注記：ここでは、標準のLB培地（LB）培地を用いました。

バイオフィルム形成のための3チェンカバーガラス法

1. 振盪（200rpm）しながら37℃で、所望のメディアの関心を一晩の細菌分離株を成長させます。
   注：別の細菌数を使用した、 緑膿菌 、 黄色ブドウ球菌の臨床分離株を含みます、バークホルデリア・セパシア錯体とアクロのxylosoxidans。媒体の選択は、目的の株および条件に依存し、しかしLB培地は、最初の実験のために使用することができます。
2. 一晩培養物から、新鮮な培地の4ミリリットル中に文化の40μlのを配置し、約0.5の600nmで（OD _600）での光学密度と文化を得るために、振盪（200rpm）しながら37℃で3-4時間成長-0.6。
3. 10％の喀痰ろ液または（対照として）痰ろ液をせずに所望のメディアで1/5にステップ3.2からの培養を希釈します。痰ろ液の他の濃度を試験することができる（ すなわち、50％または100％）。
4. スライドチャンバーのウェルを播種するために希釈液200μlを使用してください。
5. 細菌は振盪せずに37℃で4時間アタッチすることができます。
6. 4時間後、メディアを取り出し、軽く1xの新鮮な培地でバイオフィルムを洗います。 200μlの新鮮な培地と交換してください。
   注：バイオフィルム上の痰の効果を研究するために、FRES時間メディアは、痰上清を含める必要があります。
7. バイオフィルムは、顕微鏡検査のための時間になるまで洗浄することなく、メディアごとに12時間を置き換え、振盪せずに37℃で、所望の時間のために成長することを可能にします。
   注：バイオフィルムの抗生物質感受性に痰上清の効果を研究するためには、抗生物質は、バイオフィルムの成長の24時間後の培地に添加され、染色およびバイオフィルムの撮影まで培地中で維持されています。

4.染色バイオフィルムと共焦点顕微鏡

1. 所望の成長時間（24〜48時間が最高の作品）に続いて、チャンバーウェルから培地を除去し、静かに無菌PBS300μlで2回チャンバーを洗います。
2. 必要なソリューションの各ミリリットルのための（生存率キットで提供される）各色素の1μLを混合することにより、バイオフィルムに対する染色混合物を準備します。水やメディア溶液中の色素を作ります。
   注：水は、製造業者によって推奨されています。
3. チャンバ型coverglaの各ウェルに染料混合物の200μLを追加ssは暗所で45分間、室温でインキュベートし、。
4. 室から染色混合物を削除し、滅菌PBS300μlで各ウェルを洗浄します。 PBSを削除し、新鮮な水やメディアと交換してください。
5. 共焦点顕微鏡を介したバイオフィルムの可視化を進めます。

5.共焦点顕微鏡を用いてバイオフィルムの可視化

1. すぐに（1時間以内）染色した後、チャンバ内の染色されたバイオフィルムをお読みください。一度に2 8ウェルチャンバーに1を染色することによって、スライドの可視化の遅れを最小限に抑えます。
2. 取得のための励起とフィルターのセットのためのレーザーで共焦点顕微鏡を用いて撮影を行います。
   注：ここでは、スペクトルボレアリスレーザーとスピニングディスク共焦点システム（緑：491nm、赤：561 nm）と励起のために使用しました。 40分の515と40分の624の発光フィルターセットは、バイオフィルムの生存率キットから汚れを視覚化するために使用されました。
3. カメラと共焦点顕微鏡で25X水対物レンズを用いて画像を撮影します。
4. 各ウェルから3-5画像を撮影します。
   注：このように8よくチャンバーカバーガラスのために、24から40の画像が生成されます。
5. 分析のために画像を保存します。
   注：画像は、犯罪統計システム^18,19を用いて分析するOME-TIFFファイルとして保存する必要があります。バイオフィルムの画像解析の手順については、http://www.comstat.dk/で見つけることができます。画像がインポートされると、そのような各チャネル（赤と緑）の平均厚さは、バイオマスおよび表面被覆率などのパラメータを分析することができます。

Representative Results

実験の全体的な設計は、図1に示されています。このプロトコルの使用は、異なる時間（ 例えば、24、48または72時間）増殖させたバイオフィルムの変化を視覚化するための便利な方法を提供します。重要なことには、例えば、痰濾液ような外因性シグナルは、バイオフィルムの発達の変化を視覚化するために添加することができます。 図2に見られるように、10％の痰濾液の存在がバイオフィルム（ 図2A、下のパネル）のアーキテクチャを変更することができます。 ¹⁶これらの画像は、バイオフィルムの平均厚さ、総バイオマスおよび表面被覆を含む主要なバイオフィルムマトリックスを得るために犯罪統計システムソフトウェアを用いて分析することができます。これは、バイオフィルムの厚さの全体的な増加（ 図2B、および3）に反映されます。プレゼンス喀痰中のバイオフィルムに対する抗生物質の¹⁶の効果は、図3に示されています。 visualiことでバイオフィルムの開発の変化をシュッ、1がより良い別の要因は、クリスタルバイオレット染色などの伝統的なバイオフィルムアッセイ、よりもはるかに良い程度に、バイオフィルムの成長にどのように影響するかを理解することができます。

図1：実験の全体的なデザイン。基本的なプロトコルの図を流します。一晩（O / N）の文化は1 / 1,000希釈し、最終OD ₆₀₀が0.5に成長させます。これは、チェンカバーガラスのウェルに播種し、3-4時間付着させ、1 / 1,000から200μlをさらに希釈されます。これに続いて、培地を除去し、新鮮な培地と交換します。バイオフィルムは、所望の時間増殖させます。メディアは、外因性の製品や抗生物質は、バイオフィルムに追加することができます。増殖後、培地はバイオフィルムを染色し、共焦点画像化が行われ、除去されます。ge.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 痰ろ液への曝露後にバイオフィルムの開発の代表的な画像。 （A）、バークホルデリア・セパシア複合体の代表的な画像（BCC）は、単独で（上のパネル）、メディアとのチャンバーカバーガラスの成長の48時間後の臨床分離株やバイオフィルムの生存率キットを用いて染色した10％の喀痰ろ液（下パネル）の存在下で実施されます。 1スケールユニットは19.68μmで表します。 （B - C）の平均分離株の厚さ（B）とデッド：BCCの複数の画像のライブ比率（C）は、痰ろ液の非存在下でのスライドチャンバー中48時間（白いバー）または存在（黒棒）のために成長した分離株。各バーは、プロット45の画像の平均を表します平均の標準誤差を持ちます。 **クラスカル・ワリス検定を使用してコントロール（培地のみ）と比較してp <0.001。ケネディらから適応図。 ¹⁶ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3： 痰ろ液に暴露されたバイオフィルム上の抗生物質治療の代表的な画像。メディアのみ（左）または1,000μgのトブラマイシンの/ mの有無にかかわらず10％の喀痰濾液（右）の存在下で、とのチャンバーカバーガラスの成長の48時間後、バークホルデリアvietnamiensis臨床分離株の（A）画像。バイオフィルムは、（v / v）に痰濾液を10％を補った培地単独または培地中で24時間増殖させました。 24時間後、培地を除去し、メディに置き換え抗生物質を含む（+/-痰）。 1スケールユニットは19.68μmで表します。 （B - C）の平均分離株の厚さ（B）とデッド：ライブ複数の画像の比率（C）（N = 9） のB. vietnamiensisのは痰ろ液の非存在下または存在下でスライド室で48時間増殖させ分離株。各バーは、平均の標準誤差でプロット45の画像の平均を表します。 ** P <0.001、クラスカル・ワリス検定を用いてコントロール（0 / mlの）と比較しました。ケネディらから適応図。 ¹⁶ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

本明細書に記載される方法は、外因性生成物の存在下で増殖させた細菌性バイオフィルムの可視化を可能にします。このタイプのシステムを使用する場合に当然のことながら、exoproductsの生産が重要です。例えば、ジチオスレイトール（DTT）は、多くの場合、サンプルを液化するために役立つ人間の唾液サンプルに使用されています。しかし、単独でDTTの効果は、バイオフィルムの発達および生存度を低下させることができる（データは示さず）。このように、すべての条件のための適切なコントロールが必要です。さらに、ヒト痰製品の添加が原因で、各患者の痰がユニークなmicrobiomeを持っているという事実のために、実験に固有の変動を作成します。これを調整するために、我々は、患者の特定の結果を回避するために、プールされた唾液サンプルを使用しています。いずれのモデル系を使用する場合に加えて、適切なメディアの選択が重要です。意図された生物のバイオフィルムの成長のための標準的なメディアは、システムの初期セットアップのために推奨されています。実験の目的は、identをする場合外因性の製品は、バイオフィルム形成に影響を与えているかIFY、適切なバイオフィルム形成を提供して栄養豊富なメディアが提案されています。これは、外因性の要因がバイオフィルムに影響を与える可能性がある方法を決定しながら、成長のための十分な栄養をできるようになります。このような最小限または定義されたメディアなどの他のメディアは、より良い模倣一定の条件に使用することができます。他の媒体は、このシステムの優れた結果を伴って使用されている（データは示さず）。メディアの追加やバイオフィルムを破壊しないようにするバイオフィルムの洗浄工程の間に/削除するときにチャンバーカバーガラスへのバイオフィルムの付着は、しかし、細心の注意を払わなければならない堅牢です。

製造業者のプロトコルに従って、生死染色の使用が記載されたシステムのために良い結果をもたらしました。多くの要因は、しかし、この方法は、画像内に観察されるものに関連するべきである（細菌の色素取り込み、バイオフィルムと検出器の利得設定値の相対密度を含む）画像の蛍光比に影響を与えることができ秒。他の対策は、バイオフィルム中の全バイオマスの存在比と死細胞のバイオマスとして生/死バイオフィルム、（犯罪統計システムから導出される）の相対量を表すために使用されてもよいです。繰り返し実験でバイオフィルムの生存率を確認するために、細菌数を使用すると、このモデルの視覚的観察を確認することをお勧めします。バイオフィルムの固有の不均一性に、各チャンバおよび複数のチャンバから複数の画像は、実験における各条件のために使用されるべきです。これは、これらの実験の費用と期間に追加されます。

画像の取得は、前に、これらの実験からのデータを分析することが重要です。ケアは、顕微鏡のセットアップを決定する際にオーバー画像を飽和させないように注意しなければなりません。我々は、25X対物レンズが良好な画像が得られることを見出しても、必要な詳細のレベルおよび利用可能な顕微鏡に応じて、異なる目的（10X、25X、40X及び63X）の数は、画像を取得するために使用することができます。トンの厚さ彼Zスタックはまた、全体的な画質および詳細のレベルに影響を与えることができます。すべての0.5ミクロンを撮影した画像を有する標準的なコンピュータ・システム上で犯罪統計システムによって分析することができるサイズでZスタック画像を維持しながら、25X対物レンズで鮮明な画像を提供するように思われます。

これらの実験は、他の取り付けアッセイよりも消費する多くのコストと時間であり、ハイスループット様式で行うことができません。この手順では、細菌は、インビボ条件の反射ではなく、バイオフィルムの形成及び発達に影響を与える可能性ホウケイ酸表面に付着します。しかし、それらは、付加的な情報を提供し、抗生物質抵抗性と外因性の信号に対する生理学的応答をバイオフィルムに関連するメカニズムの仮説を生成することができます。実験の目的は、バイオフィルムではなく、例えば、ハイスループット法を用いて、抗バイオフィルム化合物を同定するよりも、別の要因に応じてどのように変化するかを理解することである場合、追加情報は、Tを使用して得ました彼の技術は方法を価値あるものになります。したがって、現在の方法は、最も一般的にバイオフィルムを研究するために使用されるクリスタルバイオレットアッセイ、などの前の限られた添付ファイルのアッセイに対して大きな進歩です。

この手順の重要なステップが含まれます：1）の劣化を避けるために、唾液サンプルのタイムリーな処理を確保します。 2）バイオフィルムの破壊を避けるために、バイオフィルム上のメディアの変化で穏やかなので、3）によるバイオフィルム形成の異質性にバイオフィルムの厚さの正確な表現を確実にするために、バイオフィルムイメージングの繰り返し測定を行います。

システムは指定された細菌種のために、セットアップされると、1は、複数の臨床分離株に対する外因性因子の影響を含むさまざまな条件の数をテストすることができます。このシステムは、ヒト痰¹⁶に露出したバイオフィルムの抗生物質の効果を研究するために、高度に耐性で中間耐性臨床分離株を比較するために使用されています。このようなムチンまたはコラーゲンマイクロ足場（ 例えば、puracol）で底を被覆するようチャンバーカバーガラス¹⁷の変更は、別の可能な実験の範囲を拡張することができます。このような上皮細胞と細菌との間、または異なる細菌種間のものとの直接的な相互作用を研究するためにこのシステムを適応させることが可能です。これはJurcisek らによって記載されたモデルの拡張です。 ²⁰の方法は、ここで説明したのと同様のスライドチャンバーの成長を使用し、前の可視化にバイオフィルムを固定するためにホルマリンを使用しています。また、この方法では、我々はすぐに染色した後、バイオフィルムを視覚化し、固定剤を使用しないでください。さらに、当社はバイオフィルムに対する抗生物質の効果をテストするための外因性因子を追加します。このモデルは、このように大幅にヒトの疾患における細菌バイオフィルムの我々の理解を促進する可能性を秘めています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf