Abstract
Biyofilmler kendinden salgılanan matris kaplı bakteri gruplarından oluşur. Bu endüstriyel kirlenme hem de bir çok sağlık ile ilgili enfeksiyonların gelişmekte ve önemli bir rol oynamaktadır. insan hastalığında en iyi tarif ve çalışılan biyofilm biri kistik fibroz hastalarının kronik akciğer enfeksiyonu meydana gelir. konak bağlamında biyofilm öğrenim görürken, birçok faktör biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyebilir. Ev sahibi faktörleri biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyen nasıl tespit etmek amacıyla, balgam yüzer şeklinde bir ev sahibi türevli faktör varlığında, biyofilm büyümeye statik odacıklı coverglass yöntemi kullanılmıştır. Bakteri odalarına tohumlanmış ve balgam süzüntüler maruz kalmaktadır. büyüme 48 saat sonra, biyofilm önce konfokal mikroskopi ve analiz için ticari bir biyofilm canlılığı kiti ile boyandı. Görüntü alınmasının ardından, biyofilm özellikleri farklı yazılım platformları kullanarak değerlendirilebilir.Bu yöntem antibiyotikler de dahil olmak üzere, farklı maddelerin varlığında biyofilm büyüme önemli özelliklerini görselleştirmek sağlar.
Introduction
Bakteri biyofilmleri birbirlerine bağlanmış ve bir öz salgılanan matris kaplı olan mikroorganizmaların gruplarıdır. 1,2 Klasik olarak, fiziksel olarak akış koşulları altında meydana gelen bir abiyotik veya biyotik yüzeye bağlı bakteri temsil etmektedir. Biyofilmler, aynı zamanda bu tür test tüplerinde oluşan ısı havuzları veya ince zarlar hava-sıvı arayüzü itibarıyla yüzeylerin statik koşullar altında (akış olmaması) ve distal, büyümeye gösterilmiştir. Onlar biyolojik kirlenme, paslanma ve tıkanmalara neden su rezervuarları veya borularda oluşabilir gibi bu biyofilm uzun, endüstriyel prosesler için büyük bir kayba ortamında tanınan ve vardır oylandı. 3,4
Onlar kateter ile ilişkili enfeksiyonlar, kistik fibroz hastalarında akciğer enfeksiyonları, yanı sıra çok sayıda diğer enfeksiyonlarda rol gösterilmiştir olarak biyofilm, aynı zamanda sağlık ortamlarında kritik önem taşımaktadır. Biyofilm enfeksiyonlarının işaretlerinden 5,6 biri de olanBakterilerin antibiyotiklere duyarlılığının katlanmış ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından açıklığı engelli. Biyofilm tabanlı enfeksiyonu kapsayan 7-9 en iyi okudu, klinik olarak anlamlı senaryolar kronik Pseudomonas aeruginosa biyofilm bulaşmış kistik fibrozis (KF) olan hastalarda ortaya çıkar. P. aeruginosa çok zor tedavi yapmak, kronik enfeksiyon kurulması sırasında bir dizi değişiklik uğrayabilir. 10,11 Biyofilmler farklı olarak doğuştan gelen bağışıklık etkinleştirmek ve inflamasyonu sürebilirim. Bu enfeksiyonlar KF hastalarında artmış morbidite ve mortalite neden 12-14 gibi, bu bağlamda biyofilm gelişimini etkileyen faktörleri anlamak önemlidir.
Yeni yapılan bir çalışmada konak faktörleri P. aeruginosa biyofilm agrega oluşumunda kritik olduğunu göstermektedir. 15 Bu biyofilm antibiyotik ve konak savunma mekanizmaları indirgenmiş duyarlılık katkıda bulunur. preseörneğin nötrofil elastaz gibi CF akciğer mikroorganizmaların salgılanan ürünler olarak ev sahibi türevli faktörlere nce, büyük ölçüde biyofilm oluşumunu ve gelişimini modüle potansiyeline sahiptir. 16 Ayrıca, biyofilm sayısız yolların ifadesini modüle ve inflamasyonu başlatmak için ev sahibi ile etkileşim. Böyle standart kristal viyole deneyi olarak yüksek kapasiteli yöntemleri, biyofilm süreci ile ilgili olarak bazı bilgiler sağlayabilir iken, bu faktörlere yanıt olarak biyofilm görselleştirme daha derinlemesine bilgi sağlar.
Bu yazıda in vitro biyofilm gelişimini incelemek için KF'li hastaların balgam faktörlerini kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir ticari biyofilm canlılığı kiti kullanılarak balgam içeren konak faktörlerine maruz kalan biyofilm hızlı görselleştirme sağlar. Bu teknik, görsel exogeno mevcudiyetinde biyofilm büyüme sırasında oluşan değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilirUS ürünleri ve çeşitli koşullar altında biyofilm gelişme değişiklikleri analiz etmek için geliştirilmiş bir yöntemi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma Etik Kurulu (REB) toplamak ve insan denekler gelen balgam örnekleri saklamak için gerekli olduğunu unutmayın. Bu çalışmalar Sick Children REB # 1000019444 için Hastanesi tarafından kabul edildi.
1. Hazırlama CF Balgam Örnekleri
- kistik fibroz kliniğine rutin ziyaretler sırasında hastaların balgam örneği toplayın ve buz üzerinde tutmak.
- işleme geçmesi, araştırma laboratuarına, koleksiyonun ilk saat içinde buz üzerinde balgam örneği taşıyın.
2. Balgam İşleme
- Elde edilen balgam örneğinin hacmini kaydedin. Örnek (örneğin, 2 parça PBS, 1 kısım örnek) hacminin 2x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ekleyin.
- Bir transfer pipet yardımıyla iyice örnek karıştırın. Vortex 1 dk tamamen karıştırmak için en yüksek ayarda örnek.
- Kısım uygun sayı, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yukarıdaki karışımın 1 ml ve 5.000 xg aşağı doğru döndürün4 ° C'de 20 dakika.
- santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak ve pelet atın.
- Filtre 0.22 um'lik bir filtreden süpernatantı steril ve temiz bir mikrosantrfuj tübüne birikir.
NOT: süzüntü sterilite LB agar kaplama ve sıvı ortamları aşılayarak test edilir. - ileride kullanmak üzere, -80 ° C'de, balgam süpernatant saklayın.
NOT: Balgam birden hastalar da filtrasyon aşağıdaki havuza edilebilir dan. - Balgam Süzüntü, 1/10 hac / hac istenen medyada (balgam 100 ul, ortam 900 ul) seyreltilmiş, kullanılmadan önce.
NOT: Burada, standart lizojeni suyu (LB) ortamı kullanılmıştır.
Biyofilm Oluşumunun 3. odacıklı coverglass Yöntemi
- (200 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de arzu edilen ortam ilgi gece boyunca bakteriyel izolatı büyütün.
Not: Farklı bakteri çok sayıda kullanılmış, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus klinik izolatlarının dahil,Burkholderia cepacia karmaşık ve Achromobacter xylosoxidans. ortam seçimi Ancak LB ortamı ilk uygulamalar için kullanılabilir suşları ve ilgi koşullara bağlıdır. - Gecelik kültürden taze ortam 4 ml kültür, 40 ul koyun ve yaklaşık olarak 0.5, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluğu ile bir kültür elde etmek için (200 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de 3-4 saat boyunca büyümeye -0.6.
- % 10 balgam süzüntü ya da (kontrol olarak) balgam filtrattan olmadan istenilen medyada 1/5 adım 3.2 kültürünü sulandırmak. Balgam filtre bulunan konsantrasyonu test edilebilir (örneğin,% 50 ya da% 100).
- slayt odaları kuyu tohum seyreltme 200 ul kullanın.
- Bakteriler çalkalamadan 37 ° C'de 4 saat eklemesini sağlar.
- 4 saat sonra, medyayı çıkarın ve yavaşça 1x taze medya ile biyofilm yıkayın. 200 ul taze medya ile değiştirin.
NOT: biyofilm üzerindeki fres balgam etkilerini araştırmakh medya balgam süpernatant içermelidir. - biyofilm mikroskopi için saatine kadar yıkama olmadan Ortam her 12 saat yerine, sallayarak olmadan 37 ° C'de zaman istenilen miktarda büyümeye olanak sağlar.
NOT: biyofilm antibiyotik duyarlılık balgam Süpernatantları etkisini incelemek için, antibiyotikler biyofilm büyüme 24 saat aşağıdaki ortama ilave edilir ve boyama ve biyofilm görüntüleme kadar medyada muhafaza edilir.
4. Boyama Biyofilmler ve Konfokal Mikroskop
- İstenilen büyüme süresi (24-48 saat en iyi şekilde çalışır) ardından, oda kuyulardan ortamını çıkarın ve yavaşça steril PBS 300 ul ile iki kez her odasına yıkayın.
- gerekli çözeltinin her ml (canlılık kitte sağlanan), her boyanın 1 ul karıştırılarak biyofilm boyama karışım hazırlayın. Su veya ortam çözelti içinde boya sağlayın.
NOT: Su üretici tarafından tavsiye edilmektedir. - bölmeli covergla her bir kuyu için boya karışımının 200 ul eklep, 45 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin ve.
- odalarından boyama karışımı çıkarın ve steril PBS 300 ul her bir yıkama. PBS çıkarın ve tatlı su ya da medya ile değiştirin.
- konfokal mikroskobu ile biyofilm görselleştirme ile devam edin.
5. Konfokal Mikroskop ile biyofilm görselleştirme
- hemen (1 saat içinde) boyandıktan sonra odalarına lekeli biyofilm okuyun. Bir seferde 2 8-kuyu odalarına 1 boyanarak slaytların görselleştirme gecikmeyi en aza indirmek.
- edinimi için uyarma ve filtre setleri için lazerler ile konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: Burada, spektral borealis lazerler ile dönen disk konfokal sistemi (Yeşil: 491nm, Kırmızı: 561 nm) uyarma için kullanılmıştır. 515/40 ve 624/40 emisyon filtre setleri biyofilm canlılığı kiti lekeleri görselleştirmek için kullanılmıştır. - kamera ile konfokal mikroskop bir 25X su objektif kullanarak fotoğraf çekmek.
- her bir kuyunun 3-5 görüntüleri çekmek.
NOT: Böylece 8 de odacıklı coverglass için, 24-40 görüntüleri oluşturulur. - Analiz için görüntüleri kaydedin.
NOT: OME-TIFF dosyalarını COMSTAT 18,19 kullanılarak analiz edilecek şekilde Görüntüler kaydedilmesi gerekir. biyofilm görüntü analizi için talimatlar http://www.comstat.dk/ adresinde bulunabilir. görüntüleri ithal edildikten sonra, bu tür her kanala (kırmızı ve yeşil) için ortalama kalınlığı, biyokütle ve yüzey kapsama gibi parametreler analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney genel tasarımı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu protokolün kullanılması farklı zaman aralıklarında (örneğin, 24, 48 veya 72 saat) için yetiştirilen biyofilm değişiklikleri görselleştirmek için uygun bir yöntem sağlar. Önemli bir şekilde, örneğin, balgam süzüntüler gibi dış sinyaller, biyofilm gelişme değişiklikleri görselleştirmek için ilave edilebilir. Şekil 2'de de görüldüğü gibi,% 10, balgam süzülen maddelerin varlığı biyofilm mimarisi (Şekil 2A, alt paneller) değiştirebilir. 16 Bu görüntüler biyofilm ortalama kalınlığı, toplam biyokütle ve yüzey kapsama dahil anahtar biyofilm matrisleri elde etmek COMSTAT yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Bu genel olarak, biyofilm kalınlığındaki artışa (Şekil 2B ve 3) yansıtılır. Varlığı balgam biyofilm üzerinde antibiyotiklerin 16 etkileri Şekil 3'te gösterilmiştir. visuali tarafından biyofilm gelişimi değişiklikleri zing, bir daha farklı faktörler kristal viyole boyaması gibi geleneksel biyofilm deneyleri, çok daha iyi bir dereceye kadar, biyofilm gelişimini etkileyebilir nasıl takdir edebilirsiniz.
Şekil 1: Deney Genel tasarım. Temel protokol akış diyagramı. Bir gecelik (O / N), kültür 1 / 1,000 seyreltildi ve nihai OD 0.5 600 büyümeye bırakılır. bölmeli coverglass kuyuya ekilmiş ve 3-4 saat boyunca bağlanmaya bırakılmıştır olan bu daha 1/1000 ve 200 ul seyreltilir. Bundan sonra, ortam çıkarılır ve taze ortam ile değiştirilmiştir. Biyofilmler, istenen bir süre için büyümeye bırakılmıştır. Medya, eksojen ürünler veya antibiyotikler biyofilm eklenebilir. büyüme sonrasında, ortam biyofilm boyanır ve konfokal görüntüleme gerçekleştirilir kaldırılır.ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: balgam süzüntülere maruz kaldıktan sonra biyofilm gelişimi Temsilcisi görüntüler. (A), Burkholderia cepacia kompleks Örnek görüntüleri (BCC), tek başına (üst panel) ortam ile bölmeli coverglass büyüme 48 saat aşağıdaki klinik izolatlar ve biyofilm canlılığı kiti ile boyanarak, ardından% 10 balgam süzüntüler (alt paneller) varlığında gerçekleştirilir. 1 ölçek birimi 19.68 mikron temsil etmektedir. (B - C) izolatların (B) ve ölü ortalama kalınlığı: BHK birden fazla görüntü canlı oranı (C), balgam süzülen maddelerin 48 yokluğunda kayıcı odalarında saat (beyaz çubuklar) ya da varlığında (siyah çubuklar) için yetiştirilir izolat. Her çubuk çizilen 45 görüntülerin ortalamasını temsilortalama standart hata ile. ** Kruskal-Wallis testi kullanılarak kontrol (medya tek başına) ile karşılaştırıldığında p <0.001. Kennedy ve ark uyarlanmıştır Şekil. 16 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: balgam süzüntüye maruz biyofilm antibiyotik tedavisinin Temsilcisi görüntüler. (A), Burkholderia vietnamiensis klinik izolatlar görüntüleri (sol), tek başına ortam ile bölmeli coverglass veya veya tobramisinin 1000 ug / m olmayan% 10 balgam süzüntüler (sağ) mevcudiyetinde büyüme 48 saat takip. Biyofilmler, tek başına ortam içinde 24 st için büyütülmüştür veya ortam,% 10 (h / h), balgam süzüntüler ile takviye edilmiştir. 24 saat sonra, ortam uzaklaştırılmıştır ve medi ile değiştirilirantibiyotik içeren bir (+/- balgam). 1 ölçek birimi 19.68 mikron temsil etmektedir. (B - C) izolatların (B) ve ölü ortalama kalınlığı: birden fazla görüntü canlı oranı (C) (n = 9) B. vietnamiensis yokluğunda ve balgam süzülen maddelerin mevcudiyetinde kayıcı odaları 48 saat için büyütülmüştür izolatları. Her çubuk ortalama standart hata ile çizilen 45 görüntülerin ortalamasını temsil etmektedir. ** P <0.001, Kruskal-Wallis testi ile kontrol (0 ug / ml) bulundu. Kennedy ve ark uyarlanmıştır Şekil. 16 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tarifnamede tarif edilen yöntemler eksojen ürünlerin mevcudiyetinde büyütülen bakteri biyofilmlerin görselleştirme için izin verir. bu tip bir sistem kullanılıyorsa Beklendiği gibi, exoproducts üretimi önem taşımaktadır. Örneğin, Ditiyotreitol (DTT), genellikle örnekleri sıvılaştırılması yardımcı insan balgam kullanılır. Bununla birlikte, tek başına DTT etkisi biyofilm gelişimi ve canlılığı azaltılmış olur (veriler gösterilmemiştir). Bu durumda, tüm koşullar için uygun kontrol gereklidir. Ayrıca, insan tükürük ürünlerin eklenmesi nedeniyle, her bir hastanın balgam benzersiz mikrobiyomu sahip olması deneye içkin değişkenliği oluşturur. Bu ayarlamak için, hasta özel sonuçları önlemek için havuza balgam örnekleri kullanmıştır. herhangi bir model sistemi kullanarak ek olarak, uygun ortam seçimi önemlidir. amaçlanan organizmanın biyofilm büyümesi için standart medya sisteminin başlangıç kurulumu için tavsiye edilir. Deneyin amacı, ident iseeksojen ürünler biyofilm oluşumunu nasıl etkilediğini ify, yeterli biyofilm oluşumunu sağlayan bir besin zengin medya önerilmektedir. dışsal faktörler biyofilm nasıl etkileyebileceği belirlerken Bu büyüme için yeterli beslenmeyi sağlayacak. Minimal veya tanımlanmış medya gibi diğer medya, daha iyi taklit belirli koşullar için kullanılabilir. Diğer ortam bu sistemde iyi sonuçlar edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). ortamı ekleme veya biyofilm bozucu önlemek için biyofilm yıkama adımları sırasında / çıkartırken odacıklı coverglass için biyofilm eki, ancak büyük dikkat gösterilmelidir sağlamdır.
üreticinin protokol başına canlı ölü leke kullanımı açıklanan sistem için iyi sonuçlar vermiştir. bir dizi faktör, bununla birlikte, bu yöntem, görüntüde gözlemlenen ile ilgili olmalıdır (boya bakteri alımı, biyofilm ve detektör kazancı ayarları yoğunluğuna dahil) görüntü floresans oranı etkileyebilirs. Diğer önlemler, (COMSTAT elde edilen), biyofilm içindeki toplam biyomas mevcut bir oranda ölü hücrelerden biyokütle ölü / canlı biyofilm, nispi miktarını temsil etmek için kullanılabilir. tekrarlanan deneylerde biyofilm canlılığı teyit etmek için bakteri miktarını kullanarak bu model ile ilgili görsel gözlemler teyit etmek için önerilmektedir. Nedeniyle biyofilmlerin doğasında heterojenite için, her bir bölme ve çoklu odalarından birden fazla görüntü, bir deneyde, her bir durum için kullanılmalıdır. Bu, bu deneylerin maliyeti ve süresi ekler.
görüntülerin elde edilmesi öncesinde, bu deneylerden elde edilen veriler analiz için önemlidir. mikroskop kurulumu belirlerken Bakım üzerinde görüntüleri doyurmak değil alındı ve olmalıdır. Biz 25X objektif daha iyi görüntü verir bulmak rağmen gerekli detay seviyesine ve mevcut mikroskop bağlı olarak, farklı amaçlara (10X, 25X, 40X ve 63X) bir dizi görüntüler elde etmek için de kullanılabilir. T kalınlığıo Z-yığını da genel görüntü kalitesini ve ayrıntı düzeyini etkileyebilir. Her 0.5-1 um çekilmiş görüntüleri sahip standart bilgisayar sistemlerinde COMSTAT tarafından analiz edilebilir bir boyutta Z-yığın görüntüleri tutarken, 25X objektif net görüntüler sağlamak gibi görünüyor.
Bu deneyler, daha pahalı ve zaman başka bağlama deneyleri daha alıcıdır ve yüksek verimli bir şekilde yapılamaz. Bu prosedürde, bakteri, bir in vivo bir durumda yansıtıcı değildir ve biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyen bir borosilikat yüzeyine tutunur. Ancak, ilave bilgi sağlamak ve antibiyotik direnci ve eksojen sinyal fizyolojik yanıtı biyofilm ilgili mekanizma hipotezler üretebilir. Deneyin amacı, biyofilm yerine örneğin yüksek verimli yöntemler kullanılarak anti-biyofilm bileşiklerin belirlenmesi yerine, farklı faktörlere tepki olarak nasıl değiştiğini anlamak için ise, ek bilgi t kullanılarak elde edilenOnun teknik yöntemi değerli yapar. Bu nedenle mevcut metot, en yaygın olarak biyofilm incelemek için kullanılır kristal mor tahlilinde, önceki sınırlı bağlanma deneyleri üzerinde önemli bir gelişmedir.
Bu prosedüre kritik adımlar şunlardır: 1) bozulmasını önlemek için balgam örneklerinin zamanında işlenmesini sağlamak; 2) biyofilm kesintileri önlemek için biyofilm medya değişiklikleri nazik olmak ve 3) nedeniyle biyofilm oluşumu heterojen biyofilm kalınlığı doğru temsilini sağlamak için biyofilm görüntüleme tekrarlanan ölçümler yapmak.
Sistem, belirli bir bakteri türü için set-up sonra, bir çoklu klinik izolatları üzerinde dışsal faktörlerin etkisi dahil olmak üzere farklı koşullar, bir dizi test edebilirsiniz. Bu sistem, insan balgam 16 maruz kalan biyofilm üzerinde antibiyotiklerin etkisini araştırmak için ve son derece dayanıklı ve orta derecede dayanıklı klinik izolatları karşılaştırmak için kullanılır olmuştur. Böyle müsin veya kollajen mikro-iskele (örneğin, puracol) ile alt kaplama olarak odacıklı coverglass 17 Değişiklikler, daha olası deneyler aralığını uzatabilir. Epitel hücreleri ve bakteri ya da farklı bakteri türleri arasındaki gibi doğrudan etkileşimleri incelemek için bu sistemi uyarlamak mümkün olabilir. Bu Jurcisek ve diğ modelin bir açılımıdır. 20 usul burada açıklanan ve görselleştirme önce biyofilm düzeltmek için formalin kullandığı benzer slayt odası büyümesini kullanır. Seçenek olarak ise, bu yöntemde hemen boyanarak biyofilm görselleştirmek ve bir sabitleyici kullanmayın. Ayrıca, biyofilm üzerinde antibiyotik etkisini test etmek dışsal faktörler ekleyin. Bu model, böylece önemli ölçüde insan hastalığı bakteriyel biyofilm anlayışımızı ilerletmek için potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yok.
Acknowledgments
TB Kistik Fibrozis Kanada araştırma bursu kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms . Informatics and Mathematical Modelling. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
