Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Abstract

Biofilm består av grupper av bakterier innkapslet i en selv utskilt matrise. De spiller en viktig rolle i industriell forurensning samt i utvikling og utholdenhet av mange helserelaterte infeksjoner. En av de mest godt beskrevet og undersøkt biofilm i human sykdom oppstår ved kronisk pulmonar infeksjon i cystisk fibrose pasienter. Når man studerer biofilm i sammenheng med verten, kan mange faktorer påvirker biofilmdannelse og utvikling. For å identifisere hvordan vertsfaktorer kan påvirke biofilmdannelse og utvikling, ble det benyttet en statisk kammer, dekkglass metode for å dyrke biofilmer i nærvær av verts-avledede faktorer i form av sputum-supernatanter. Bakterier blir sådd inn i kammer og utsatt for sputum filtrater. Etter 48 timer med vekst, er biofilm farget med et kommersielt biofilm levedyktighet kit før konfokal mikroskopi og analyse. Etter bilde oppkjøpet, kan biofilm egenskaper vurderes ved hjelp av ulike programvareplattformer.Denne metoden tillater oss å visualisere viktige egenskaper biofilm vekst i nærvær av forskjellige stoffer, inkludert antibiotika.

Introduction

Bakterielle biofilmer er grupper av mikroorganismer som er festet til hverandre og innkapslet i et selv utskilt matrise. ^1,2 klassisk, representerer de bakterier fysisk festet til en abiotiske eller biotiske overflaten dannet under forhold med flyt. Biofilm har også vist seg å vokse i statiske betingelser (fravær av strømning) og distal fra overflater, slik som ved luft-væske-grensesnittet av termiske bassenger eller pellicles dannet i reagensglass. Disse biofilm har lenge vært anerkjent i miljøet og er en stor ulempe for industrielle prosesser, som de kan dannes i vannreservoarer eller i rør, noe som resulterer i begroing, korrosjon og blokkeringer. ^3,4

Biofilmer er også avgjørende i helsevesenet, ettersom de har vist seg være involvert i kateterrelaterte infeksjoner, lungeinfeksjoner hos pasienter med cystisk fibrose, så vel som i en rekke andre infeksjoner. ^5,6 Ett av kjennetegnene på biofilm infeksjoner er deøkt mottakelighet av bakterier mot antibiotika og nedsatt clearance av det medfødte immunsystemet. ^7-9 Den mest studerte, klinisk relevante scenarier med biofilm-basert infeksjon oppstår hos pasienter med cystisk fibrose (CF), som er kronisk infisert med Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa kan gjennomgå en rekke endringer i løpet av opprettelsen av kronisk infeksjon som gjør det svært vanskelig å behandle. ^10,11 Biofilm kan forskjellig aktivere medfødt immunitet og kjøre betennelse. ^12-14 Ettersom disse infeksjoner føre til økt sykelighet og dødelighet hos CF-pasienter, er det viktig å forstå faktorer som kan påvirke biofilm utvikling i denne sammenheng.

En fersk studie antyder at verts-faktorer er avgjørende i dannelsen av P. aeruginosa biofilm aggregater. ¹⁵ Disse biofilm bidra til redusert følsomhet for antibiotika og vertsforsvarsmekanismer. den presence av vert-avledede faktorer, slik som nøytrofil elastase, så vel som utskilte produkter fra mikroorganismer som er tilstede i CF-lunge, har potensial til å betydelig modulere biofilmdannelse og utvikling. ¹⁶ I tillegg biofilmer kommuniserer med verten for å modulere ekspresjon av tallrike veier og initiere betennelse. Mens høy gjennomstrømning metoder, slik som standard krystallfiolett analyse, kan gi noen informasjon med hensyn til biofilm-prosessen, visualisering av biofilmen som reaksjon på disse faktorene gi mer detaljert informasjon.

I dette manuskriptet beskriver vi en fremgangsmåte for å anvende forhold fra sputum av pasienter med CF for å studere utviklingen av biofilm in vitro. Denne metoden gjør det mulig for rask visualisering av biofilm utsatt for spytt inneholder vertsfaktorer ved bruk av et kommersielt biofilm levedyktighet kit. Denne teknikken kan brukes til visuelt å identifisere endringer som skjer i løpet av biofilmveksten i nærvær av exogenooss produkter, og representerer en forbedret metode for å analysere endringer i biofilm-utvikling under ulike forhold.

Protocol

Legg merke til at forskningsetiske Board (REB) er nødvendig for å samle inn og lagre spyttprøver fra mennesker. Disse studiene ble godkjent av Hospital for Sick Children REB # 1000019444.

1. Klar CF Sputumprøver

1. Samle spyttprøve fra pasienter under rutinemessig besøk til cystisk fibrose klinikken og holde på is.
2. Transportere spyttprøve på is i løpet av den første timen av samlingen, til forskningslaboratorium, for å gjennomgå behandling.

2. Sputum Processing

1. Registrere volumet av spyttprøve erholdt. Legg fosfatbufret saltvann (PBS) til 2 x volumet av prøven (dvs. 2 deler PBS, 1 del prøve).
2. Bland prøven godt med en overføring pipette. Vortex prøven på den høyeste innstillingen for 1 min for å blande fullstendig.
3. Aliquot 1 ml av ovennevnte blanding i de riktige tall 1,5 ml mikrosentrifugerør og spinne ned ved 5000 xg i20 min ved 4 ° C.
4. Etter sentrifugering, fjern supernatanten og kast pellet.
5. Filter sterilisere supernatanten gjennom et 0,22 um filter og samles i en ren mikrosentrifugerør.
   MERK: Sterilitet av filtratet er testet ved å plate på LB agar og inoculating flytende medier.
6. Oppbevar sputum supernatanten ved -80 ° C for fremtidig bruk.
   MERK: Sputum fra flere pasienter kan også samles etter filtrering.
7. Før bruk fortynne sputum filtratet 1/10 v / v (100 ul av oppspytt, 900 mL av media) i ønsket media.
   MERK: Her ble standard lysogeni kjøttkraft (LB) media brukes.

3. Chambered coverglass Metode for biofilmdannelse

1. Grow bakteriell isolat av interesse over natten i ønsket media ved 37 ° C med risting (200 rpm).
   Merk: En rekke forskjellige bakterier ble anvendt, inkludert kliniske isolater som Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia komplekse og Achromobacter xylosoxidans. Valg av media avhenger stammer og forhold av interesse, men LB media kan brukes til innledende forsøk.
2. Fra dyrking over natten, plassere 40 ul kultur i 4 ml friskt medium og vokse i 3-4 timer ved 37 ° C med risting (200 rpm) for å oppnå en kultur med en optisk tetthet ved 600 nm (OD ₆₀₀₎ på omtrent 0,5 -0,6.
3. Fortynn kulturen fra trinn 3,2 til 1/5 i ønsket media med 10% sputum filtratet eller uten oppspytt filtrat (som kontroll). Annen konsentrasjon av sputum filtrat kan testes (dvs. 50% eller 100%).
4. Bruk 200 ul av fortynningen til frø brønner med lysbilde kamre.
5. Tillater bakterier å feste i 4 timer ved 37 ° C uten risting.
6. Etter 4 timer, tar ut mediene og forsiktig vaske biofilm med 1x frisk media. Bytt ut med 200 mL frisk medier.
   MERK: For å studere effektene av sputum på biofilm, de fresh media bør inneholde sputum supernatant.
7. Tillat biofilm for å vokse til ønsket tid ved 37 ° C uten risting, ved å erstatte mediet hver 12. time, uten vasking inntil tiden for mikroskopi.
   MERK: For å studere effekten av spytt supernatanter på biofilm antibiotika mottakelighet, er antibiotika lagt til media etter 24 timer av biofilm vekst og opprettholdes i media før farging og avbildning av biofilm.

4. Farging Biofilm og konfokalmikroskopi

1. Etter ønsket vekst tid (24-48 timer fungerer best), fjerne media fra kammer brønner og vask forsiktig hvert kammer to ganger med 300 ul steril PBS.
2. Forbered farging blandingen i biofilm ved å blande 1 mL av hver farge (gitt i levedyktighet kit) for hver ml oppløsning som trengs. Gjør fargestoff i vann eller medieløsning.
   MERK: Vann er anbefalt av produsenten.
3. Tilsett 200 ul av fargestoff blanding til hver brønn av kammer, coverglass og inkuber ved værelsestemperatur i mørke i 45 min.
4. Fjerne flekker blandingen fra kamrene og vask hver brønn med 300 ul steril PBS. Fjern PBS og erstatte med ferskvann eller media.
5. Fortsett med visualisering av biofilm via konfokalmikroskopi.

5. Visualisering Biofilm med konfokalmikroskopi

1. Les farget biofilm i kamrene umiddelbart etter farging (innen en time). Minimalisere forsinkelsen i visualisering av skinnene ved farging 1 til 2 8-brønns kammer om gangen.
2. Utfør bildebehandling ved hjelp av konfokal mikroskop med laser for eksitasjon og filtersett for oppkjøpet.
   MERK: Her, spinning disk confocal system med spektrale borealis lasere (Grønn: 491nm, Rød: 561 nm) ble brukt for eksitasjon. Utslipps filter sett av 515/40 og 624/40 ble brukt til å visualisere flekker fra biofilm levedyktighet kit.
3. Ta bilder med en 25X vann objektiv på konfokal mikroskop med kamera.
4. Ta 3-5 bilder fra hver brønn.
   MERK: Så for en 8 vel kamret dekkglass, vil 24-40 bildene bli generert.
5. Lagre bilder for analyse.
   MERK: Bilder bør lagres som OME-TIFF-filer som skal analyseres ved hjelp COMSTAT ^18,19. Instruksjoner for biofilm bildeanalyse kan bli funnet på http://www.comstat.dk/. Når bildene er importert, kan parametre som gjennomsnittlig tykkelse, biomasse og overflatedekning for hver kanal (rød og grønn) analyseres.

Representative Results

Den generelle utformingen av forsøket er vist i figur 1. Bruken av denne protokollen gir en praktisk metode for å visualisere endringene i biofilmer vokst for ulike tidsperioder (for eksempel 24, 48 eller 72 timer). Viktigere, eksogene signaler, for eksempel sputum filtrater, kan tilsettes for å visualisere endringene i biofilm utvikling. Som vist i figur 2, kan nærvær av 10% sputum filtrater endre arkitekturen av biofilm (figur 2A, nedre paneler). ¹⁶ Disse bildene kan analyseres ved hjelp COMSTAT programvare for å oppnå viktige biofilm matriser, herunder midlere tykkelse av biofilm, total biomasse og overflatedekning. Dette gjenspeiles i en generell økning i biofilm tykkelse (Tall 2B, og 3). ¹⁶ Virkningene av antibiotika for biofilm i nærvær sputum er vist i figur 3. ved visuali zing endringene i biofilm utvikling, kan man bedre sette pris på hvordan ulike faktorer kan påvirke biofilm vekst, til en mye bedre grad enn tradisjonelle biofilm analyser, for eksempel krystallfiolett farging.

Figur 1: Samlet design av eksperimentet. Flytskjema over basisprotokollen. En over natten (O / N) kulturen blir fortynnet 1 / 1.000 og fikk vokse til en endelig OD ₆₀₀ på 0,5. Dette blir ytterligere fortynnet 1 / 1.000 og 200 ul podes inn i brønnen av kammer, dekkglass og tillatt å feste i 3-4 timer. Etter dette, blir mediet fjernet og erstattet med friskt medium. Biofilm får vokse på ønsket tid. Media kan eksogene produkter eller antibiotika legges til biofilm. Etter vekst, blir media fjernet, biofilmer er farget og confocal bildebehandling blir utført.ge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Representative bilder av biofilm utvikling etter eksponering for spyttfiltratene. (A) Representative bilder av Burkholderia cepacia kompleks (BCC) kliniske isolater følgende 48 timer med vekst i Chambered dekkglass med media alene (topp paneler) eller i nærvær av 10% spyttfiltratene (lavere paneler) etterfulgt av farging med biofilm levedyktighet kit. En skala enhet representerer 19,68 mikrometer. (B - C) Gjennomsnittlig tykkelse av isolater (B) og døde: levende ratio (C) av flere bilder av BCC isolater dyrket i 48 timer i lysbilde kamre i fravær (hvite søyler) eller nærvær (svarte striper) av sputum filtrater. Hver søyle representerer gjennomsnittet av 45 bilder plottetmed standard feil av gjennomsnittet. ** P <0,001 sammenlignet med kontroll (media alene) ved anvendelse av Kruskal-Wallis test. Figur tilpasset fra Kennedy et al. ¹⁶ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Representative bilder av antibiotikabehandling på biofilm utsatt for sputum filtratet. (A) Bilder av Burkholderia vietnamiensis kliniske isolater etter 48 timers vekst i kammer, dekkglass med mediene alene (venstre) eller i nærvær av 10% sputum filtrater (til høyre) med eller uten 1 000 ug / m av tobramycin. Biofilmer ble dyrket i 24 timer i medium alene, eller medium supplert med 10% (v / v) sputum filtrater. Etter 24 timer ble mediet fjernet og erstattet med medien (+/- sputum) som inneholder antibiotika. En skala enhet representerer 19,68 mikrometer. (B - C) Gjennomsnittlig tykkelse av isolatene (B) og døde: levende ratio (C) av flere bilder (n = 9) av B. vietnamiensis isolater dyrket i 48 timer i glide kamre i fravær eller nærvær av sputum filtrater. Hver søyle representerer middelverdi av 45 bilder plottet sammen med standardavvik av gjennomsnittet. ** P <0,001 sammenlignet med kontroll (0 ug / ml) ved anvendelse av Kruskal-Wallis test. Figur tilpasset fra Kennedy et al. ¹⁶ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Fremgangsmåtene beskrevet heri tillater visualisering av bakterielle biofilmer dyrket i nærvær av eksogene produkter. Ikke overraskende, er produksjonen av exoproducts av viktighet ved bruk av denne type system. For eksempel ditiotreitol (DTT), blir ofte brukt på human spyttprøver for å bidra til å flytendegjøre prøvene. Imidlertid kan virkningen av DTT alene redusere biofilm utvikling og levedyktighet (data ikke vist). Dermed riktige kontroller for alle forhold er nødvendig. Videre er tilsetningen av human sputum-produkter skaper iboende variabilitet på eksperimentet på grunn av det faktum at sputum til hver pasient har en unik mikrobiomer. For å justere for dette, har vi brukt samlespyttprøver for å unngå pasientspesifikke resultater. I tillegg er valg av riktig media viktig når du bruker noen modell system. Standard medier for biofilmvekst av den tiltenkte organismen anbefales for første installasjon av systemet. Hvis målet med eksperimentet er å presidentify hvordan eksogene produkter påvirker biofilmdannelse, er et næringsstoff rike medier som gir tilstrekkelig biofilmdannelse foreslått. Dette vil gi tilstrekkelig næring for vekst, samtidig bestemme hvordan eksogene faktorer kan påvirke biofilm. Andre medier, for eksempel minimale eller definerte medier, kan brukes til å bedre etterligne visse vilkår. Andre medier har blitt brukt med gode resultater i dette systemet (data ikke vist). Festingen av biofilm til kamret dekkglass er robust, må imidlertid stor forsiktighet tas når du fjerner / legger til media eller under vasketrinnene av biofilm for å hindre forstyrre biofilm.

Bruken av levende døde flekken som per produsentens protokoll har gitt gode resultater for systemet beskrevet. En rekke faktorer kan påvirke den fluorescens-forholdet av bildene (inklusive fargestoff opptak av bakterier, relativ densitet på biofilm og detektor forsterkning), bør imidlertid denne metoden er relatert til hva som er observert i bildets. Andre tiltak kan anvendes for å representere den relative mengde av død / levende biofilm, slik som biomasse fra døde celler som et forhold av den totale biomassen som er tilstede i biofilmen (som utledet fra COMSTAT). Ved hjelp av bakterietall for å bekrefte biofilm levedyktighet i gjentatte forsøk anbefales å bekrefte de visuelle observasjoner av denne modellen. På grunn av iboende heterogenitet av biofilm, bør flere bilder fra hvert kammer og flere kammere benyttes for hver tilstand i et eksperiment. Dette øker omkostningene og varigheten av disse eksperimentene.

Oppkjøpet av bilder er viktig før analyse av data fra disse forsøkene. Hensyn må tas for å ikke over mette bilder, og ved fastsettelse av mikroskop oppsett. Avhengig av detaljnivået som kreves og mikroskop tilgjengelig, kan en rekke ulike formål (10X, 25x, 40X og 63X) brukes til å hente bilder, selv om vi finner ut at 25X objektiv gir bedre bilder. Tykkelsen av tHan Z-stack kan også påvirke den generelle bildekvalitet og detaljnivå. Å ha bilder tatt hver 0,5-1 mikrometer synes å gi klare bilder på 25X objektiv, samtidig som Z-stack bilder i en størrelse som kan analyseres ved COMSTAT på standard datasystemer.

Disse forsøk er mer kostbar og tidkrevende enn andre feste analyser, og kan ikke gjøres i en høy gjennomstrømning måte. I denne prosedyren, bakterier fester seg til et borsilikat overflate, som ikke er representative for en in vivo-tilstanden og kan påvirke biofilmdannelse og utvikling. Men de gir ytterligere informasjon og kan generere hypoteser for mekanismen knyttet til biofilm antibiotikaresistens og fysiologiske respons på eksogene signal. Hvis målet med forsøket er å forstå hvordan biofilmer endre seg i respons til forskjellige faktorer, i stedet for å identifisere anti-biofilm-forbindelser ved hjelp av high-throughput metoder for eksempel den ytterligere informasjon oppnådd under anvendelse av thans teknikk gjør metoden verdt. Dermed dagens metode er et betydelig fremskritt i forhold til tidligere fastsatte feste analyser som krystallfiolett analysen, som er mest brukt til å studere biofilm.

Kritiske trinn i denne prosedyren er: 1) Sikre rettidig behandling av spyttprøver for å unngå degradering; 2) Å være forsiktig med mediaendring på de biofilm for å unngå forstyrrelse av biofilm, og 3) Å gjøre gjentatte målinger av biofilm avbildning for å sikre en nøyaktig representasjon av biofilmen tykkelse på grunn av heterogeniteten av biofilmdannelse.

Når systemet er satt opp for en gitt bakterieart, kan man teste en rekke forskjellige tilstander, blant annet virkningene av eksogene faktorer på flere kliniske isolater. Dette systemet har blitt anvendt for å studere effekten av antibiotika på biofilm utsatt for human sputum ¹⁶ og å sammenligne meget motstandsdyktig og mellomliggende resistente kliniske isolater. ¹⁷ Endringer i kamret dekkglass, for eksempel belegg bunnen med mucin eller kollagen mikro stillas (f.eks puracol), kan ytterligere utvide rekkevidden av eksperimenter mulige. Det kan være mulig å tilpasse denne system for å studere direkte interaksjoner, for eksempel de som er mellom epitelceller og bakterier, eller mellom forskjellige bakteriearter. Dette er en utvidelse av modellen beskrevet av Jurcisek et al. ²⁰ Fremgangsmåten benytter sleidekammeret vekst lik den som er beskrevet her og bruker formalin for å feste biofilmer før visualisering. Alternativt i denne metoden visual vi biofilmer umiddelbart etter farging og ikke bruke et fiksativ. I tillegg legger vi eksogene faktorer for å teste effekten av antibiotika på biofilm. Denne modellen har således potensiale til å betydelig øke vår forståelse av bakterielle biofilmer i human sykdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf