Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Abstract

Biofilm består af grupper af bakterier indkapslet i en selvstændig udskilles matrix. De spiller en vigtig rolle i den industrielle forurening samt i udviklingen og vedvarende mange sundhedsrelaterede infektioner. En af de mest velbeskrevne og studeres biofilm i human sygdom opstår i kronisk lungeinfektion af patienter med cystisk fibrose. Når man undersøger biofilm i forbindelse med værten, kan mange faktorer påvirker biofilmdannelse og udvikling. For at identificere hvordan værtsfaktorer kan påvirke biofilm dannelse og udvikling, vi anvendte en statisk kamre dækglas metode til at vokse biofilm i nærværelse af værtsafledte faktorer i form af sputum supernatanter. Bakterier podes i kamre og udsat for opspyt filtrater. Efter 48 timers vækst, er biofilm farves med et kommercielt biofilm levedygtighed kit før konfokal mikroskopi og analyse. Efter overtagelsen billede, kan biofilm egenskaber vurderes ved hjælp af forskellige softwareplatforme.Denne fremgangsmåde tillader os at visualisere centrale egenskaber af biofilm vækst i nærværelse af forskellige stoffer, herunder antibiotika.

Introduction

Bakterielle biofilm er grupper af mikroorganismer, der er knyttet til hinanden og indkapslet i en selvstændig udskilles matrix. ^1,2 Klassisk, de repræsenterer bakterier fysisk knyttet til en abiotisk eller biotisk overflade dannet under forhold med strøm. Biofilm har også vist sig at vokse i statiske forhold (fravær af flow) og distalt fra overflader, såsom ved luft-væske-grænsefladen af ​​termiske puljer eller pellikeler dannet i reagensglas. Disse biofilm har længe været anerkendt i miljøet og er en vigtig ulempe for industrielle processer, som de kan dannes i vandreservoirer eller i rør, hvilket resulterer i biologisk forurening, korrosion og blokeringer. ^3,4

Biofilm er også kritiske i sundhedsvæsenet, da de har vist være involveret i Kateter-relaterede infektioner, lungeinfektioner i patienter med cystisk fibrose, såvel som i mange andre infektioner. ^5,6 Et af kendetegnene ved biofilm infektioner er deøget følsomhed af bakterier mod antibiotika og nedsat clearance af det medfødte immunsystem. ^7-9 Den mest velundersøgte, klinisk relevante scenarier involverer biofilm-baserede infektion forekommer hos patienter med cystisk fibrose (CF), som er kronisk inficeret med Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa kan undergå en række ændringer under etablering af kronisk infektion, der gør det meget vanskeligt at behandle. ^10,11 Biofilm kan forskelligt aktivere medfødte immunitet og drive inflammation. ^12-14 Da disse infektioner fører til øget sygelighed og dødelighed i CF-patienter, er det afgørende at forstå faktorer, der kan påvirke biofilm udvikling i denne sammenhæng.

En nylig undersøgelse viser, at værten-faktorer er kritiske i dannelsen af P. aeruginosa biofilm aggregater. ¹⁵ Disse biofilm bidrage til nedsat følsomhed over for antibiotika og vært forsvarsmekanismer. Den presence af værtsafledte faktorer, såsom neutrofil elastase, samt udskilte produkter fra mikroorganismer til stede i CF lungen, har potentiale til i høj grad at modulere biofilm dannelse og udvikling. ¹⁶ Derudover biofilm interagerer med værten til at modulere ekspression af mange veje og initiere inflammation. Mens høje throughput metoder, såsom standard krystalviolet assay, kan give nogle oplysninger med hensyn til biofilmen proces, visualisering af biofilmen som reaktion på disse faktorer giver mere dybdegående information.

I dette manuskript beskriver vi en fremgangsmåde til anvendelse faktorer fra spyt af patienter med CF at undersøge udviklingen af biofilm in vitro. Denne fremgangsmåde tillader hurtig visualisering af biofilm udsat for sputum indeholdende værtsfaktorer bruger kommercielt biofilm levedygtighed kit. Denne teknik kan anvendes til visuelt at identificere forandringer, der sker i løbet af biofilm vækst i nærvær af exogenoos produkter, og repræsenterer en forbedret metode til at analysere ændringerne i biofilm udvikling under forskellige forhold.

Protocol

Bemærk, at Research Ethics Board (REB) er forpligtet til at indsamle og opbevare spytprøver fra forsøgspersoner. Disse undersøgelser blev godkendt af Hospital for Sick Children REB # 1000019444.

1. Forberedelse CF spytprøver

1. Saml spyt prøve fra patienter under rutinemæssige besøg på cystisk fibrose klinik og holde på is.
2. Transport spyt prøve på is inden for den første time af indsamling, til forskningslaboratoriet, at undergå behandling.

2. Sputum Processing

1. Optag volumenet af sputum prøve opnået. Tilføj phosphatbufret saltvand (PBS) til 2x volumenet af prøven (dvs. 2 dele PBS, 1 del prøve).
2. Prøven blandes godt med en overførsel pipette. Vortex prøven på den højeste indstilling for 1 min for at blande helt.
3. Portion 1 ml af den ovennævnte blanding i det passende antal 1,5 ml mikrocentrifugerør og spin ned på 5000 xg for20 min ved 4 ° C.
4. Efter centrifugering, supernatanten fjernes, og kassér pillen.
5. Filtersteriliser supernatanten gennem et 0,22 um filter og opsamles i et rent mikrocentrifugerør.
   BEMÆRK: Sterilitet filtrat testes ved udpladning på LB-agar og podning flydende medier.
6. Opbevar sputum supernatant ved -80 ° C til senere brug.
   BEMÆRK: Sputum fra flere patienter kan også samles efter filtrering.
7. Før anvendelse fortyndes sputum filtrat 1/10 volumen / volumen (100 pi sputum, 900 pi medier) i det ønskede medie.
   BEMÆRK: Her blev standard lysogeni bouillon (LB) anvendte medier.

3. Chambered dækglas Metode til biofilmdannelse

1. Grow bakteriel isolat af interesse natten over i ønskede medie ved 37 ° C under omrystning (200 rpm).
   Bemærk: En række forskellige bakterier blev anvendt, herunder kliniske isolater Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia kompleks og Achromobacter xylosoxidans. Valget af medier afhænger af stammer og betingelser af interesse, men LB medier kan anvendes til indledende forsøg.
2. Fra dyrkning natten placere 40 pi kultur i 4 ml frisk medium og vokse i 3-4 timer ved 37 ° C under omrystning (200 rpm) for at opnå en kultur med en optisk densitet ved 600 nm _(OD600) på ca. 0,5 -0,6.
3. Fortynd kulturen fra trin 3,2 til 1/5 i ønskede medie med 10% spyt filtrat eller uden sputum filtratet (som kontrol). Andre koncentration af sputum filtrat kan testes (dvs. 50% eller 100%).
4. Brug 200 pi af fortyndingen til frø brønde af slide kamre.
5. Tillad bakterier binde i 4 timer ved 37 ° C uden omrystning.
6. Efter 4 timer, fjerne medierne og forsigtigt vaske biofilmen med 1x frisk medier. Udskift med 200 pi frisk medier.
   BEMÆRK: For at undersøge virkningerne af spyt på biofilmen, de fresh medier bør indeholde sputum supernatant.
7. Tillad biofilm til at vokse til den ønskede mængde tid ved 37 ° C uden omrystning, erstatter medier hver 12 timer, uden vask indtil tiden til mikroskopi.
   BEMÆRK: For at undersøge effekten af ​​sputum supernatanter på biofilmen antibiotisk følsomhed, er antibiotika tilsættes til medierne efter 24 timers af biofilm vækst og vedligeholdes i medierne indtil farvning og billeddannelse af biofilm.

4. Farvning Biofilm og konfokal mikroskopi

1. Efter ønskede vækst tid (24-48 timer virker bedst), fjern medier fra kammer brønde og forsigtigt vaske hvert kammer to gange med 300 pi sterilt PBS.
2. Forbered farvning blanding for biofilm ved at blande 1 pi hver farvestof (forudsat i levedygtighed kit) for hver ml opløsning nødvendige. Gør farvestof i vand eller medier opløsning.
   BEMÆRK: Vand er anbefalet af producenten.
3. Tilsæt 200 pi farvestofblanding til hver brønd i kamre coverglass og inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 45 minutter.
4. Fjern farvning blandingen fra kamrene og vask hver brønd med 300 pi sterilt PBS. Fjern PBS og erstatte med frisk vand eller medier.
5. Fortsæt med visualisering af biofilm via konfokal mikroskopi.

5. Visualisering Biofilm med konfokalmikroskopi

1. Læs farvede biofilm i kamrene umiddelbart efter farvning (indenfor 1 time). Minimere forsinkelse i visualisering af objektglassene ved farvning 1 til 2 8 brønde kamre ad gangen.
2. Udfør billeddannelse ved hjælp konfokal mikroskop med lasere til excitation og filter sæt til erhvervelse.
   BEMÆRK: Her spinning disk konfokal-system med spektrale borealis lasere (Grøn: 491nm, Rød: 561 nm) blev anvendt til excitation. Emissionsfilter sæt 515/40 og 624/40 blev anvendt til at visualisere de pletter fra biofilmen levedygtighed kit.
3. Tag billeder ved hjælp af en 25X vand målsætning om konfokal mikroskop med kamera.
4. Tage 3-5 billeder fra hver brønd.
   BEMÆRK: Således for en 8 godt Chambered dækglas, vil 24-40 billeder genereres.
5. Gem billeder til analyse.
   BEMÆRK: Billederne skal gemmes som OME-TIFF-filer, der skal analyseres ved hjælp COMSTAT ^18,19. Instruktioner for biofilm billedanalyse kan findes på http://www.comstat.dk/. Når billederne er importeret, kan analyseres parametre såsom gennemsnitlig tykkelse, biomasse og overfladedækning for hver kanal (rød og grøn).

Representative Results

Den overordnede udformning af forsøget er vist i figur 1. Brugen af denne protokol giver en bekvem metode til at visualisere ændringer i biofilm dyrket i forskellige perioder (fx, 24, 48 eller 72 timer). Vigtigere, exogene signaler, såsom opspyt filtrater, kan tilsættes for at visualisere ændringer i biofilm udvikling. Som det ses i figur 2, kan tilstedeværelsen af 10% sputum filtrater ændre arkitekturen i biofilmen (figur 2A, underpanel). ¹⁶ Disse billeder kan analyseres under anvendelse COMSTAT software til at opnå centrale biofilm matricer, herunder gennemsnitlig tykkelse på biofilmen, totale biomasse og overfladedækning. Dette afspejles i en samlet stigning i biofilm tykkelse (figur 2B, og 3). ¹⁶ Virkningerne af antibiotika på biofilm i nærværelse spyt, er vist i figur 3. Ved visuali zing ændringerne i biofilm udvikling, kan man bedre forstå, hvordan forskellige faktorer kan påvirke biofilmvækst, til en meget bedre grad end traditionelle biofilm analyser, såsom krystalviolet farvning.

Figur 1: Samlet udformning af eksperimentet. Rutediagram af grundlæggende protokol. En natten over (O / N) kultur fortyndes 1 / 1.000 og lodes vokse til en endelig OD ₆₀₀ på 0,5. Dette er yderligere fortyndet 1 / 1.000 og 200 pi podes i brønd af kamre dækglas og får lov at binde i 3-4 timer. Efter denne, er mediet fjernet og erstattet med frisk medium. Biofilm får lov at vokse til den ønskede tid. Medier, kan tilsættes exogene produkter eller antibiotika til biofilm. Efter vækst, er medier fjernet, biofilm er farves og konfokal billedbehandling udføres.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Repræsentative billeder af biofilm udvikling efter udsættelse for sputum filtrater. (A) Repræsentative billeder af Burkholderia cepacia kompleks (BCC) kliniske isolater efter 48 timers vækst i kamre dækglas med medier alene (toppaneler) eller i nærvær af 10% sputum filtrater (lavere paneler) efterfulgt af farvning med biofilm levedygtighed kit. 1 skala enhed repræsenterer 19,68 um. (B - C) Gennemsnitlig tykkelse isolater (B) og døde: levende forholdet (C) af flere billeder af BCC isolater dyrket i 48 timer i slide kamre i fravær (hvide søjler) eller tilstedeværelse (sorte søjler) af spyt filtrater. Hver søjle repræsenterer middelværdien af ​​45 billeder plottetmed standardfejlen på middelværdien. ** P <0,001 sammenlignet med kontrol (medier alene) under anvendelse af Kruskal-Wallis test. Figur tilpasset fra Kennedy et al. ¹⁶ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Repræsentative billeder af antibiotisk behandling på biofilm udsat for sputum filtrat. (A) Billeder af Burkholderia vietnamiensis kliniske isolater efter 48 timers vækst i kamre dækglas med medier alene (venstre) eller i nærværelse af 10% sputum filtrat (højre) med eller uden 1000 pg / m af tobramycin. Biofilm blev dyrket i 24 timer i medier alene eller medier suppleret med 10% (v / v) sputum filtrater. Efter 24 timer blev mediet fjernet og erstattet med media (+/- sputum) indeholdende antibiotika. 1 skala enhed repræsenterer 19,68 um. (B - C) Gennemsnitlig tykkelse isolater (B) og døde: levende forholdet (C) af flere billeder (n = 9) af B. vietnamiensis isolater dyrket i 48 timer i slide kamre i fravær eller tilstedeværelse af spyt filtrater. Hver søjle repræsenterer middelværdien af ​​45 billeder afbildet med standardfejlen på middelværdien. ** P <0,001 sammenlignet med kontrol (0 ug / ml) under anvendelse af Kruskal-Wallis test. Figur tilpasset fra Kennedy et al. ¹⁶ Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De heri beskrevne fremgangsmåder tillader visualisering af bakterielle biofilm dyrket i nærvær af exogene produkter. Ikke overraskende, at produktionen af ​​de exoproducts er af betydning, når der anvendes denne type system. For eksempel dithiothreitol (DTT), anvendes ofte på menneskelige spytprøver til at hjælpe flydende prøverne. virkningen af ​​DTT alene, kan imidlertid falde biofilm udvikling og levedygtighed (data ikke vist). Således ordentlig kontrol til alle betingelser er nødvendige. Desuden kan tilsætning af humane spyt produkter skaber iboende variabilitet af forsøget på grund af det faktum, at sputum af hver patient har en unik microbiome. For at justere for dette, har vi brugt poolede spytprøver for at undgå patientens specifikke resultater. Derudover er valget af passende medier er vigtigt, når de bruger modelsystem. Standard medier til biofilm vækst i den tilsigtede organisme anbefales til indledende opsætning af systemet. Hvis målet med forsøget er at identcificere hvordan eksogene produkter påvirker biofilmdannelse, foreslås en næringsrige medier, der giver tilstrækkelig biofilmdannelse. Dette vil give tilstrækkelig ernæring for vækst og samtidig bestemme, hvor udefra kommende faktorer kan påvirke biofilm. Andre medier, såsom minimale eller definerede medier, kan anvendes til bedre efterligne visse betingelser. Andre medier har været anvendt med gode resultater i dette system (data ikke vist). Fastgørelsen af ​​de biofilm til kamre dækglas er robust, skal der tages dog stor omhu, når du fjerner / tilføjer medier eller ved vask trin af biofilm at forhindre forstyrre biofilm.

Anvendelsen af ​​levende døde pletter i henhold til producentens protokol har givet gode resultater for det beskrevne system. En række faktorer kan påvirke fluorescensforholdet af billederne (herunder farvestof optagelse af bakterier, relativ massefylde på biofilm og detektor forstærkerindstillinger), dog bør denne metode forholde til det, der observeres i billedets. Andre foranstaltninger kan anvendes til at repræsentere den relative mængde af døde / levende biofilm, såsom biomassen fra de døde celler som andel af den samlede biomasse findes i biofilmen (som afledt af COMSTAT). Det anbefales at bruge kimtal at bekræfte biofilm levedygtighed i gentagne forsøg for at bekræfte de visuelle observationer af denne model. Grundet iboende heterogenitet biofilm, bør flere billeder fra hvert kammer og flere kamre anvendes for hver tilstand i et eksperiment. Dette øger omkostningerne og varigheden af ​​disse eksperimenter.

Købet af billederne er vigtig forud for analyse af data fra disse forsøg. Der skal udvises forsigtighed for ikke forbi mætte billeder og ved fastsættelsen af ​​mikroskop setup. Afhængig af antallet af detaljer, og mikroskopet til rådighed, kan en række forskellige mål (10X, 25X, 40X og 63X) bruges til at erhverve billeder, selvom vi finder, at 25X mål giver bedre billeder. Tykkelsen af ​​than Z-stack kan også påvirke den generelle billedkvalitet og detaljeringsgrad. Under billeder taget hver 0,5-1 um synes at give klare billeder på 25X objektiv, samtidig holde Z-stack billeder med en størrelse, der kan analyseres ved COMSTAT på standard edb-systemer.

Disse eksperimenter er dyrere og tidskrævende end andre vedhæftede assays, og kan ikke ske i en high throughput måde. I denne procedure, bakterier binder sig til en borsilicat overflade, som ikke afspejler en in vivo tilstand og kan påvirke biofilm dannelse og udvikling. Men de give yderligere oplysninger og kan generere hypoteser for mekanisme relateret til biofilm antibiotikaresistens og fysiologiske respons på eksogen signal. Hvis målet med forsøget er at forstå, hvordan biofilm skifter som reaktion på forskellige faktorer, frem for at identificere anti-biofilm forbindelser ved hjælp af high-throughput metoder for eksempel, tjente den yderligere information under anvendelse af thans teknik gør fremgangsmåden umagen værd. den nuværende metode er således en signifikant fremskridt i forhold til tidligere begrænsede vedhæftede assays såsom krystalviolet-assayet, hvilket er mest almindeligt anvendt til at studere biofilm.

Kritiske trin til denne procedure omfatter: 1) At sikre rettidig behandling af spytprøver for at undgå nedbrydning; 2) At være blid med medier ændringer på biofilm for at undgå forstyrrelser af biofilmen og 3) gør gentagne målinger af biofilm imaging for at sikre en nøjagtig gengivelse af biofilmen tykkelse på grund af heterogenitet biofilmdannelse.

Når systemet er sat op for en given bakterieart, kan man teste en række forskellige forhold, herunder virkningerne af udefra kommende faktorer på flere kliniske isolater. Dette system er blevet anvendt til at undersøge virkningen af antibiotika på biofilm udsat for humant sputum ^16, og at sammenligne stærkt resistente og intermediært resistente kliniske isolater. ¹⁷ Modifikationer af kamre dækglas, såsom overtrækning bunden med mucin eller collagen mikro-stillads (f.eks puracol), kan yderligere udvide området for eksperimenter mulige. Det kan være muligt at tilpasse dette system til at studere direkte interaktioner, såsom dem mellem epitelceller og bakterier, eller mellem forskellige bakteriearter. Dette er en udvidelse af den beskrevet af Jurcisek et al model. ^20. Fremgangsmåden anvender slide vækstkammeret svarende til den beskrevet her og bruger formalin for at fastsætte biofilm forud for visualisering. Alternativt i denne metode, vi visualisere biofilm umiddelbart efter farvning og ikke bruge et fiksativ. Desuden har vi tilføje eksogene faktorer at teste effekten af ​​antibiotika på biofilm. Denne model har således potentiale til betydeligt fremme vores forståelse af bakterielle biofilm i human sygdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf