Summary
الغدة البين في الزرد هي نظيره teleostean من الغدة الكظرية الثدييات. يدخل هذا البروتوكول كيفية تنفيذ نازعة 3-β هيدروكسي ستيرويد (Δ 5-4 إيزوميراز، 3β-HSD) فحص النشاط الأنزيمي، الذي يكتشف خلايا الستيرويدي المنشأ متباينة في الزرد النامية.
Introduction
الغدة الكظرية، عنصرا حاسما في المحور hypothalamo الغدة النخامية، الغدة الكظرية، تفرز المنشطات وينسق التوازن الستيرويد والاستجابة الجسدية للإجهاد. تتكون الغدة الكظرية القشرة الخارجية، التي تفرز المنشطات بطريقة منطقة محددة، والنخاع الداخلية، الذي يجمع الكاتيكولامينات. الغدة البين في teleosts هي النظير من الغدة الكظرية في الثدييات، وتتكون من خلايا البين وأليفة الكروم الستيرويدي المنشأ، والتي هي المعادل الوظيفي من قشرة الغدة الكظرية والنخاع، على التوالي 1-3. وأفادت الدراسات التي أجريت باستخدام نموذج الزرد التي تتشكل على حد سواء الأنساب الخلية الستيرويدي المنشأ وأليفة الكروم من الآليات الجزيئية والخلوية التي تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الثدييات 1،2. ولذلك، فإن الزرد هو نموذج يحتمل أن تكون قوية لدراسة الأمراض الوراثية، ومراقبة الغدد الصم العصبية، وبيولوجيا الأنظمة من المحور hypothalamo الغدة النخامية، الغدة الكظرية (البين).
الصورة = "jove_content"> في الغدة الكظرية، 3β-HSD يحفز تحويل هرمون البروجسترون من بريغنينولون، 17α-هيدروكسي من 17α-hydroxypregnelolone، والاندروستيرون من ديهيدرو 4،5. 3β-HSD ضروري لbiosynthesizing جميع فئات المنشطات الهرمونية، وهما هرمون البروجسترون، السكرية، مستحضرات معدنية، الاندروجين، وهرمون الاستروجين. وهما البشري 3β-HSD نظائر الانزيمات HSD3B1 وHSD3B2 وأعرب تفاضلي 6. وأعرب عن HSD3B1 في المشيمة والأنسجة الطرفية، في حين أعرب HSD3B2 في قشرة الغدة الكظرية والغدد التناسلية. HSD3B1 الإنسان وHSD3B2 هي شارك في orthologs من hsd3b1 الزرد، وهو ما يعبر عنه في الأنسجة البين والغدد التناسلية الكبار. hsd3b2 الزرد هو جين أعرب أمومي التي تختفي قبل توالد 7 النصوص. وقد تم تطوير هذا البروتوكول من 3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي كامل جبل لالزرد عن طريق تعديل طريقة ليفي، وهوق التي وصفها ميلانو وآخرون. ، على أقسام المجمدة من ثمانية أنواع مكتملة العظام 8. بسبب نفاذية الأنسجة والشفافية البصرية من الزرد النامية، كلها جبل 3β-HSD الكيمياء النسيجية يمكن أن تستخدم بنجاح للجنين الزرد ثابت واليرقات وتحديدا ترسيم أنسجة البين متباينة.
وقد تم تطبيق هذا الاختبار حساس وسريع لمختلف المسوخ وmorphants مما يدل على أنواع مختلفة من dysmorphogenesis بين الكليتين. النشاط 3β-HSD البين غائب في الجنين حيث تعطلت مواصفات الأنسجة البين من خلال ضربة قاضية محددة من عامل النسخ Ff1b وانخفضت كما يتأثر التمايز البين من قبل ضربة قاضية للcoregulator Ff1b Prox1 9،10. والجدير بالذكر، أن يتم الكشف عن النشاط 3β-HSD في المسوخ مع عيوب مرحلة مبكرة شديدة، مثل أعور رأس الدبوس والحول، حيث 3β-Hالتنمية المستدامة الكيمياء النسيجية يحدد كيف يتأثر الهجرة الخلية البين 11. عدم المساس تمايز الأنسجة البين حتى في غياب كامل من الدم والأوعية الدموية. لذلك، كيف ترسم إشارات المستمدة من البطانة الجهاز البين وضع يمكن تحديد 12،13. وبشكل عام، وقد استخدم هذا الاختبار بنجاح النسيجية لدراسة مواصفات، والتمايز، وهجرة الخلايا الستيرويدي المنشأ في نموذج الزرد. لذلك، يجب أن تكون فعالة وأداة يمكن الاعتماد عليها لأي شاشات الوراثية أو الكيميائية التي تستهدف اضطرابات الجهاز الكظرية والبين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية على الزرد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية Tunghai جامعة (IRB الموافقة NO 101-12.) والتي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
1. الحلول المالية ل3β-HSD الأنزيمية آخر تلطيخ
- إعداد العابر للديهيدرواندروستىرون [10 ملغ / مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)].
- إعداد β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد هيدرات (1.2 ملغ / مل في 0.1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2).
- إعداد نيكوتيناميد (فيتامين B3، 50 ملغ / مل في H 2 O).
- إعداد نتروبلو الأزرق 4-نيترو (50 ملغ / مل في 70٪ ثنائي ميثيل الفورماميد).
- قسامة كل هذه المكونات في أنابيب microfuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: في تجربتنا، وتجميد والذوبان المتكررة من aliquots من كل الحلول المذكورة أعلاه لا تؤثر على شدة 3β-HSD تلطيخ النشاط.
2. Wحفرة جبل 3β-HSD آخر تلطيخ
ملاحظة: النشاط الأنزيمي 3β-HSD قابلا للاكتشاف في الأجنة الزرد في أقرب وقت 28 ساعة بعد الإخصاب (HPF) عند المثقف في 28.5 درجة مئوية، وهو ما يتسق مع بداية التعبير مرنا من hsd3b1 2،7. ويستند البروتوكول النشاط تلطيخ كله جبل 3β-HSD في هذه الدراسة على الطريقة الموصوفة سابقا 8 و تم تحديد أن تكون ناجحة في الزرد تطوير ما يصل إلى 7 أيام بعد الإخصاب 9. لتحليل المكروية الأوعية الدموية في الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين، كلها جبل 3β-HSD النشاط تلطيخ يجب أن يطبق على خطوط المعدلة وراثيا معربا-البطانة محددة مضان، مثل تيراغرام (kdrl: EGFP) s843 14 و تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5 15 . لتحليل الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين النظر تنمية الكلى الزرد، ويمكن 3β-HSD النشاط تلطيخ يكون تطبيق صحيفةed لتيراغرام (wt1b: GFP) li1 الأسماك 16، حيث تحدد تشكيل الكبيبة وسليفة الكلوة الأنابيب.
- علاج الزرد النامية تفرخ لهم في 0.03٪ الفنيل في الماء البيض (الملح 0.06 ملغ / لتر الشعاب المرجانية في المياه منزوع الأيونات)، بدءا من مرحلة ما بين 12 و 24 HPF، لمنع تشكيل الصباغ.
- إصلاح الأجنة dechorionated أو اليرقات في الفقرة (أ) 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 0.1٪ توين 20 (PFAT) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو (ب) 2٪ PFAT بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية، تليها 4 ساعة على RT.
تحذير: PFA سامة عن طريق الاستنشاق والجلد عن طريق الاتصال. ومن مدمر على الجلد والأغشية المخاطية والعينين والجهاز التنفسي العلوي. - غسل الأجنة 4X لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.1٪ توين 20 (PBST) في RT.
ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن لا تجفيف العينات أثناء تغيير الحلول الغسيل. - طازجة إعداد ستاحل ining قبل ردود الفعل (الجدول 1). إعداد، الدوامة، وأجزاء أجهزة الطرد المركزي A و B في أنابيب منفصلة.
ملاحظة: لإضافة جميع العناصر مباشرة في أنبوب واحد تسبب هطول الأمطار الشديد. - إضافة الحل كله من الجزء ألف إلى حل كامل من الجزء باء، وتخلط جيدا لإعداد حل تلطيخ، وتوزيع الفور 1 مل في كل microfuge أنبوب يحتوي على أجنة الثابتة وغسلها.
- لف أنابيب microfuge مع رقائق الألومنيوم لحمايتها من ضوء ومكان سواء على محور دوار أو منصة هزاز لطيف اهتزاز في RT.
- تحديد تجريبيا وقت رد الفعل من خلال رصد الإشارات اللونية من خلال المجهر. رواسب طفيفة سوف تتطور مع مرور الوقت. ومع ذلك، فإنها لا تتداخل مع عملية التفاعل.
ملاحظة: للحصول على الأجنة ثابتة عند 28 HPF، وتلطيخ عند 25 درجة مئوية لمدة 4 ساعات يولد إشارة واضحة على الأنسجة البين. - وقف رد فعل عن طريق غسل 4X لمدة 10 دقيقة في PBST. أناو لا حاجة لمزيد المناعى (IHC) تحليل، بعد إصلاح الأجنة ملطخة 4٪ PFAT لمدة 60 دقيقة في RT. خلاف ذلك، وتخزين الأجنة غسلها عند 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- لكامل جبل المجهري، ومسح الملون، وظيفة ثابتة، وغسلها الأجنة مع 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، توجيههم مع الجانب الظهري مواجهة على شريحة، ومراقبة باستخدام المجهر تستقيم تحت إضاءة حقل مشرق.
ملاحظة: لتقديم صورة عالية الدقة من التشكل الأنسجة البين، شقة جبل تحليل من الجنين الملون والنشاط 3β-HSD وdeyolked يوصى. كما يتم وضع الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين الحق فوق الكيس المحي، تحليل مسطح جبل البطنية من الأنسجة البين يسمح الملاحظة المباشرة واضحة من التشكل البين 17.
3. تحليل IHC من الأجنة الملطخة آخر 3β-HSD
ملاحظة: للحصول على تحليل المكروية الأوعية الدموية في steroiالأنسجة dogenic، تتعرض الأجنة الملطخة النشاط 3β-HSD مع مراسل فلوري المعدلة وراثيا-البطانة محددة لالمستعرضة vibratome باجتزاء والتحليل IHC لاحق 12،18.
- بعد تثبيت
- بعد إصلاح الأجنة الملون والنشاط 3β-HSD وغسلها مع 2٪ PFA تستكمل مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية، وغسل 4X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ تريتون X-100 (PBSTx) في RT.
- تضمين
- إعداد 4٪ منخفضة ذوبان الاغاروز عن طريق إذابة الاغاروز في برنامج تلفزيوني في 95 درجة مئوية، وقسامة في أنابيب microfuge، وتخزينها في 4-8 درجة مئوية.
- تذوب قسامة من 4٪ انخفاض ذوبان الاغاروز عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ومن ثم الحفاظ على قسامة في 47 درجة مئوية. تضمين كل جنين في المنصهر 4٪ منخفضة ذوبان-الاغاروز في سقف متجردا من أنبوب 1.5 مل microfuge التي هي بمثابة القالب، والسماح لتبرد حتى الصلبة.
- Vibratome باجتزاء
- عصا قطعة من الشريط ورقة لع الجافlatform من vibratome.
- إزالة كتلة الاغاروز صلابة من القالب بواسطة شفرة حلاقة. تطبيق superglue إلى الشريط ورقة على المنصة، وإصلاح كتلة الاغاروز على الشريط ورقة، مع الجانب الأمامي من العينة مواجهة. خفض كتلة agarose على شكل شبه منحرف المنشور، مع ما يقرب من 4 ملم و 8 ملم على كل جانب من جوانب العلوية والسفلية، على التوالي.
- شطف كتلة الاغاروز التي تحتوي على عينة مع برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ تريتون X-100 (0.5٪ PBSTx) باستخدام قطارة.
- شريحة كتلة agarose إلى 100 ميكرون أقسام وفقا لدليل تعليمات من vibratome. دائما شطف كتلة agarose لمنع جفاف. كما يتم قطع كل شريحة، إزالته من vibratome باستخدام 26 G إبرة حقنة، ونقل إلى لوحة بقعة الباردة التي تحتوي على 0.5٪ PBSTx (500 ميكرولتر / جيد).
- جمع المقاطع الأنسجة النشاط الإيجابي 3β HSD عن طريق فحص تحت المجهر تشريح، ونقل أقسام من قبل بيpette طرف مع نهايته قطع (حوالي 1 ملم القطر الداخلي في فتح) في لوحة 96-جيدا الباردة التي تحتوي على 0.5٪ PBSTx (150 ميكرولتر / جيد). عينات الأنسجة عادة ما تنفصل من كتلة agarose بعد هذه الخطوة.
- Permeabilization والغسل
- تغسل شرائح 6X لمدة 15 دقيقة في 0.5٪ PBSTx في RT، 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني، و4X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ المصل البقري ألبومين / 1٪ DMSO / 0.1٪ تريتون X-100 (PBDTx).
- حجب
- احتضان شرائح لمدة 1 ساعة في 2٪ مصل العجل الجنين (FCS) في PBDTx في RT.
- رد فعل الأجسام المضادة الأولية
- احتضان شرائح لمدة 1.5 أيام في PBDTx يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، الأرنب بولكلونل الفيبرونكتين مكافحة الإنسان والفأر مكافحة الإنسان التنسيق كيناز الالتصاق) في 4 درجات مئوية.
- غسل
- تغسل شرائح 6X لمدة 10 دقيقة في PBDTx في RT.
- حجب
- احتضان شرائح لمدة 1 ساعة في 2٪ FCS في الجريدة الرسميةدي تي في RT.
- رد الفعل المضاد الثانوي
- احتضان شرائح لمدة 1.5 أيام في PBDTx يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية (-fluorophore مترافق الماعز المضادة للأرنب أو المضادة للماوس مفتش) في 4 درجات مئوية.
- غسل
- تغسل شرائح 6X لمدة 10 دقيقة في PBDTx في RT و4X لمدة 10 دقيقة في PBST في RT.
ملاحظة: للحصول على التحليل المجهري متحد البؤر، مسح العينات مع 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني.
- تغسل شرائح 6X لمدة 10 دقيقة في PBDTx في RT و4X لمدة 10 دقيقة في PBST في RT.
4. تحليل متحد البؤر
- مراقبة جبل الجنين كله وقسم من المجهر متحد البؤر مجهزة 10X / 0.5 و 20X / 0.75 عدسة الهدف.
- للكشف في وقت واحد مضان وتلطيخ 3β-HSD، تعيين وضع متعدد المسارات على النحو التالي: 488 نانومتر الأرجون ليزر و505-530 نانومتر ممر الموجة مرشح للكشف عن GFP. 543 نانومتر ليزر الهليوم نيون و560-615 نانومتر ممر الموجة مرشح للكشف عن mCherry. وتنتقل عن طريق قناة الخفيفة للكشف عن 3β-HSD تلطيخ.حجم الثقب هو 1 وحدة إيري، والقرار هو 1024 X 1024 بكسل.
- تجميع أكوام ض (مع 6 فاصل ميكرون) كنوع من الإسقاط 3D، ودمج الإسقاط ومشرق الميدان، وذلك باستخدام المدمج في البرنامج متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد كيفية codevelops الأنسجة بين الكليتين الستيرويدي المنشأ مع الكبيبة الكلى سليفة الكلوة والأوعية الدموية لها الوليد، تم إجراء 3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي على ضعف المعدلة وراثيا تيراغرام (wt1b: GFP) li1، تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5 الجنين في 34 HPF (الشكل 1). في هذه المرحلة، ويقع الأنسجة الستيرويدي المنشأ 3β-HSD النشاط الإيجابي الحق في خط الوسط والذيلية على الفور إلى الكبيبة الكلى سليفة الكلوة، في حين تبدأ بعض الخلايا الستيرويدي المنشأ المهاجرة عبر خط الوسط وتشكيل حافة بارزة من وجهة نظر الظهرية. ويرتبط الأنسجة الستيرويدي المنشأ بشكل وثيق مع الشريان الأبهر الظهري (DA) والوريد الكاردينال الخلفي (PCV).
و3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي على تيراغرام (kdrl: GFP) s843 الأجنة سمح لترسيم واضح للسفن شبه البين، بما في ذلك DA، PCV، وسفينة البين (الحجم الشهيقي الاحتياطي، الشكل 2). تعرض Vibratome أقسام الأجنة الملطخة النشاط 3β-HSD لتحليل IHC للكشف عن البروتين مصفوفة خارج الخلية فيبرونكتين] والمستجيب لها المصب فسفرته الاتصال التصاق كيناز. ترسب شبه DA فبرونيكتين هو ضروري لدعم نمو الحجم الشهيقي الاحتياطي 18.
الشكل 1: الجامع يشن 3β-HSD تلطيخ نشاط يقوم على الزرد التعبير عن صحفيين الفلورسنت. الظهرية (غادر لوحات) وظهراني جانبي (لوحات اليمين) جهات نظر 3β-HSD الملطخة النشاط تيراغرام (wt1b: GFP) li1، تيراغرام (kdrl: mCherry) الجنين CI5 في 34 HPF، والذي يسمح تصور التوزيع المكاني النسبي لبين الكليتين الأنسجة (الأشعة تحت الحمراء)، الكبيبة سليفة الكلوة (PG)، الأنابيب سليفة الكلوة (PT)، الظهرية الأبهر (DA)، الظهري الجانبيالوريد الأبهر (LDA)، والخلفية الكاردينال (PCV). ونظرا لموقع الأنسجة البين في هذه المرحلة، وجهات نظر الظهرية الوحشية هي من الجانب الأيمن للجنين. D، الظهرية. V، بطني. A، الأمامي. P، الخلفي. R، أليس كذلك. L، غادر. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Vibratome باجتزاء والتحليل IHC تيراغرام الملون النشاط 3β-HSD (kdrl: GFP) s843 الأجنة. تعرض الجنين لمدة 34 HPF إلى 3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي وثم vibratome باجتزاء. كانت ملطخة قسم إيجابية النشاط 3β-HSD التي كتبها مزدوجة IHC مع أرنب الفيبرونكتين مكافحة الإنسان (Fن. 1/200) والفأر مكافحة البشرية فسفرته التنسيق التصاق كيناز (pFak، pY397، 1/100). يظهر المقطع العرضي التوزيع النسبي للأنسجة البين (IR) والأوعية المجاورة لها، بما في ذلك الشريان الأبهر الظهري (DA)، الخلفي الكاردينال الوريد (الحجم الشهيقي الاحتياطي)، والوريد الخلفي الكاردينال (PCV). NT، الأنبوب العصبي. NC، الحبل الظهري. S، الجسيدة. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تركيز الأسهم | في 1000 ميكرولتر | التركيز النهائي | |
| الجزء ألف | |||
| [دمس] | 40 ميكرولتر | ||
| DHEA | 10 ملغ / مل | 10 ميكرولتر | 0.1 ملغ / مل |
| NAD | 1.2 ملغ / مل | 10 ميكرولتر | 12 ميكروغرام / مل |
| الجزء باء | |||
| PBST | 936 ميكرولتر | ||
| فيتامين B3 | 50 ملغ / مل | 2 ميكرولتر | 0.1 ملغ / مل |
| NBT | 50 ملغ / مل | 2 ميكرولتر | 0.1 ملغ / مل |
الجدول 1: مكونات رد فعل تلطيخ 3β-HSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زادت قوة الإشارة من النشاط 3β-HSD على مدى رد فعل. تم الكشف عن إشارات واضحة عن النشاط 3β-HSD بعد 4 ساعات من رد فعل لمراحل من 28 HPF فصاعدا. ومع ذلك، ومدة رد الفعل يتطلب تحديد التجريبية، وهذا يتوقف على الغرض من الفحص. في الحالات التي يتطلب تلطيخ معالجة بين عشية وضحاها، على خلفية مزرق قليلا تميل إلى تطوير على العينات. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق زيادة مدة التثبيت (على سبيل المثال، 4 ساعات في 4٪ PFAT في RT) قبل تلطيخ النشاط 3β-HSD. على النقيض من ذلك، overfixation، مثل تحديد ليلة وضحاها مع 4٪ PFAT في RT، يؤدي إلى خلفية واضحة للغاية. ومع ذلك، ستكون هناك حاجة لوقت أطول للحصول على كثافة مرغوب فيه من إشارة. لاحظنا أن تحديد العينات بين عشية وضحاها مع 2٪ بدلا من 4٪ PFAT قبل 3β-HSD تلطيخ النشاط عادة ما يعطي نتائج أكثر من المرغوب فيه في المراقبة مراسل الفلورسنت لاحقة أو أناتحليل HC. ومع ذلك، وتحديد الأجنة مع 4٪ PFAT يسمح للفحص السريع للنشاط 3β-HSD (تكتمل في غضون 1 يوم)، وبالتالي ستستفيد شاشات الوراثية أو الكيميائية استهداف الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين.
بعد تحديد الأجنة بعد 3β-HSD تلطيخ النشاط الضروري لكميات ضئيلة من المكونات الكيميائية تميل إلى الاستمرار في عينات ملطخة حتى بعد الغسيل واسعة وستؤدي إلى خلفية عالية بعد فترة تخزين طويلة. ومع ذلك، إذا الأجنة الملطخة النشاط 3β-HSD هل التعرض للمزيد من التحليل IHC، تخزين النشاط الملطخة 3β-HSD وغسلها الأجنة عند 4 درجات مئوية خلال الليل لا يؤدي إلى تحسين ملحوظ في الخلفية.
تحليل الموقع التهجين (ISH) من 3β-HSD الأجنة الملطخة النشاط في غير ممكن. على سبيل المثال، colocalized التعبير عن النصوص prox1 مع النشاط 3β-HSD في steroidogenالأنسجة جيم 10. لأداء 3β-HSD النشاط تلطيخ بالإضافة إلى فرط ضغط الدم، يجب أن تكون ثابتة الأجنة في 4٪ PFAT لمدة 4 ساعة قبل وبعد فحص النشاط 3β-HSD على حد سواء بحيث نسخ RNA الخلوية يمكن الحفاظ عليها مع نوعية مرغوبة لتحليل ISH.
وقد تم تطبيق التحليل ISH باستخدام riboprobes من ff1b، cyp11a1، hsdb1، ونجم في الدراسات التنموية لل1،2،11 الأنسجة الستيرويدي المنشأ بين الكليتين. وriboprobe من ff1b بالكشف عن الخلايا البدائية البين بنسبة 22 HPF، في حين أن من cyp11a1 ونجم كشف تمييز الخلايا البين بنسبة 24 HPF. بالمقارنة مع 3β-HSD تلطيخ النسيجية الذي يكتشف فقط أنسجة البين متباينة من 28 HPF فصاعدا، تحليل ISH يمكن استخدامها لتحليل مجموعة متنوعة من الجينات البين محددة في كل من الخلايا البدائية البين ومتباينة. ومع ذلك، 3β-HSD النسيجية تلطيخ هكتارق ميزة كونها بسيطة وسريعة وموثوقة لتحليل النمط الظاهري للأنسجة البين الستيرويدي المنشأ متباينة، وبالتالي هو أداة قوية للدراسات التنموية مفصلة، فضلا عن شاشات الوراثية أو الكيميائية على نطاق واسع. وفقا لمراجعتنا من المؤلفات ذات الصلة، لا يوجد اي الأجسام المضادة المحددة التي يمكن الكشف موثوق تعبير البروتين في أنسجة البين الستيرويدي المنشأ من خلال المناعية. ولذلك، فإن طريقة تلطيخ النسيجية-3β HSD مفيد بشكل خاص في تحديد الأنسجة والتشكل الخلوي للأنسجة البين الستيرويدي المنشأ.
على الرغم من أن 3β-HSD تلطيخ النسيجية مفيد للالتصور للأنسجة البين الستيرويدي المنشأ متباينة، فإنه لا يقدم تقاريره مباشرة القدرة على تخليق الستيرويد أو وظيفة الخلايا البين. الطفرات أو المواد الكيميائية التي تؤثر على الإنزيمات المنبع أو المصب من 3β-HSD في سلسلة التوليف الستيرويدي المنشأ لا يجوزبالضرورة يتم الكشف مع هذا الأسلوب وصفها، لأنها قد أو قد لا التشويش إما حجم أو التشكل من الأنسجة البين. وبالتالي، يجب على المستخدمين من هذا البروتوكول أن تأخذ في الاعتبار أن بعض العاهات الأنزيمية التي تؤثر على وظيفة ولكن ليس التشكل من الأنسجة البين قد لا يتم الكشف بسهولة عن طريق هذا الأسلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور كريستوف Englert والبروفيسور ديدييه Stainier لالإهداء تيراغرام (wt1b: GFP) li1 وتيراغرام (kdrl: EGFP) s843 سلالات، على التوالي، ومرفق تايوان الزرد الأساسية لتوفير تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من وزارة تايوان للعلوم والتكنولوجيا (96-2628-B-029-002-MY3، 101-2313-B-029-001، 102-2628-B-029-002-MY3، 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W.
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
