Summary
Zebra balığı interrenal bezi memeli adrenal bezin teleostean karşılığıdır. Enzimatik aktivite deneyi, gelişmekte olan Zebra balığı farklılaşmış steroidogenik hücreleri tespit; Bu protokol 3-β hidroksisteroid dehidrojenaz (3β-Hsd Δ 5-4 izomeraz) nasıl gerçekleştirileceği tanıtır.
Introduction
böbreküstü bezi, hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin önemli bir bileşeni, steroid salgılar ve steroid homeostazı ve strese bedensel yanıtını koordine eder. böbrek üstü bezi katekolamin sentezleyen bir bölge-spesifik bir şekilde steroid salgılayan dış korteks ve iç medulla içerir. Teleostlarda interrenal bezi, memelilerde adrenal bez karşılığıdır ve adrenal korteks ve medullada sırasıyla 1-3 fonksiyonel eşlenikleridir steroidojenik interrenal ve kromafin hücreleri, oluşmaktadır. Zebra balığı model kullanarak yapılan çalışmalar, hem steroidogenik ve kromaffin hücre soylar yüksek memelilerde 1,2 benzeyen moleküler ve hücresel mekanizmaları tarafından oluşturulan bildirmiştir. Bu nedenle, Zebra balığı, genetik bozukluklar, nöroendokrin kontrolü ve hipotalamus-hipofiz-adrenal (interrenal) ekseninin sistem biyolojisi çalışmak için bir potansiyel olarak güçlü bir modeldir.
4,5 ila 17α-hydroxypregnelolone gelen pregnenolon, 17a-hidroksiprogesteron progesteron dönüşümünü ve androstenedion katalize eder. 3β-HSD 'hormonal steroid, yani progesteron, glukokortikoid, mineralokortikoid, androjen ve östrojenlerin her sınıfları üreten mutantı için gereklidir. İki insan 3β-Hsd HSD3B1 izozimine ve HSD3B2 farklı şekilde 6 ifade edilir. HSD3B2 adrenal korteks ve gonadlar ifade edilir ise HSD3B1, plasenta ve periferik dokularda ifade edilmektedir. İnsan HSD3B1 ve HSD3B2 interrenal doku ve yetişkin gonadlar ifade edilen Zebra balığı hsd3b1, eş ortologlar vardır; Zebra balığı hsd3b2 olan transkript organogenez 7 önce kaybolur bir anne olarak ifade gendir. zebrabalıkları için tüm montaj 3β-HSD 'enzimatik aktivite deneyi protokol, Levy yöntemini değiştirerek geliştirilenMilano ve diğerleri tarafından tarif s. Sekiz Teleost türlerinin 8 donmuş bölümlerinde. Çünkü doku geçirgenliği ve gelişmekte olan zebrafish optik şeffaflık, 3β-Hsd histokimya başarıyla sabit Zebra balığı embriyo ve larva için kullanılabilir tüm montaj ve özellikle farklılaşmış interrenal dokuları tasvir.
Bu, hassas ve hızlı bir deney interrenal dismorfogenezis farklı gösteren Çeşitli mutantlar ve morphants uygulanmıştır. Interrenal 3β-HSD 'aktivitesi interrenal doku dağılımı Ff1b transkripsiyon faktörünün belirli bir devirme yoluyla bozulur ve interrenal farklılaşma Ff1b coregulator Prox1 9,10 bir devirme etkilenir azaltılır embriyoda yoktur. Özellikle, 3β-Hsd faaliyeti gibi tek gözlü toplu iğne başı, şiddetli erken evre defekti olan mutantlar tespit edilebilir ve nerede 3β-H, şaşılıksd histokimyası interrenal hücre göçü 11 nasıl etkilendiğini anlatır. interrenal doku farklılaşması bile kan ve damarsal tam yokluğunda ödün verilmemiş. Bu nedenle endotelyum türevli sinyalleri şekil kadar geliştirilmesi interrenal organı 12,13 belirlenebilir. Genel olarak, bu histokimyasal deney başarıyla zebrabalıkları modelinde özellikleri, farklılaşmasını ve steroidojenik hücrelerinin göçünü incelemek için kullanılmıştır. Bu nedenle, verimli ve adrenal ve interrenal organ bozuklukları hedefleyen herhangi bir genetik veya kimyasal ekranlar için güvenilir bir aracı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: zebrabalıkları tüm deneysel prosedürleri Tunghai Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi (KİK Onay NO 101-12.) Ve onaylı kurallarına uygun olarak gerçekleştirdi.
3β-Hsd enzimatik Aktivite Boyama için 1. Stok Çözümleri
- trans-dehidroepiandrosteron [dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mg / ml] hazırlayın.
- β-nikotinamid adenin dinükleotid hidrat (0.1 M fosfat tampon maddesi içinde 1.2 mg / ml, pH 7.2) hazırlayın.
- Nikotinamid hazırlanması (B3 vitamini, 50 mg / ml H2O).
- 4-nitro mavi tetrazolyum (50 mg / ml% 70 dimetilformamid) hazırlayın.
- -20 ° C'de mikrofüj tüpleri ve mağaza içine kısım tüm bu bileşenler.
NOT: bizim deneyim, tekrarlanan donma ve tüm yukarıda belirtilen çözümlerin hacimde çözülme ise 3β-Hsd etkinlik boyama yoğunluğunu etkilemez.
2. Wdelik montaj 3β-Hsd Etkinlik Boyama
Not: 3β-HSD 'enzimatik aktivitesi erken 28 saat sonra döllenme (HPF) halinde kültürlendiğinde hsd3b1 2,7 mRNA ifadesinin başlangıcı ile tutarlıdır 28.5 ° C, zebra balığı embriyolar tespit edilebilir. Bu çalışmada, tüm montaj 3β-HSD 'aktivitesi boyama protokolü daha önce tarif edilen yönteme 8 dayanır ve 7 gün sonra gübreleme 9 gelişmekte zebrabalıkları başarılı olduğu saptanmıştır. Interrenal steroidojenik doku damar mikro-analizi için, 3β-HSD 'aktivitesi boyama tüm montaj gibi Tg olarak endotel spesifik floresan ifade eden transgenik kuşaklar (kdrl: EGFP) uygulanması gerekir: ci5 15 14 ve TG (MCherry kdrl) s843 . Zebra balığı böbrek gelişimini göz önünde bulundurarak interrenal steroidogenik doku analiz etmek, 3β-Hsd etkinlik boyama başvurunun olabilirLI1 balık 16 glomerülleri ve Pronephric tübüller oluşumu tarif edilmektedir: Tg (GFP wt1b) ED.
- Pigment oluşumunu inhibe etmek için, 12 ve 24 HPF arasındaki aşamasından, yumurta suda% 0.03 feniltiyoüre bölgesindeki (deiyonize su içinde 0.06 mg / L resif tuzu) onları kuluçka geliştirme zebrafish tedavi edin.
- gece boyunca, oda sıcaklığında (RT) ya da (B),% 2 PFAT de 1 saat süre ile,% 0.1 Tween 20 (PFAT) ile desteklenmiş fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde (A)% 4 paraformaldehit (PFA) dechorionated embriyolar veya larvaları saptamak 4 ° C ve oda sıcaklığında 4 saat ve ardından 4 ° C'de 2 saat için.
Dikkat: PFA Solunduğunda ve cilt ile temasında toksiktir. Bu cilt, mukoza zarları, gözler ve üst solunum yollarında yıkıcıdır. - PBS oda sıcaklığında,% 0.1 Tween 20 (PBST) ile desteklenmiş olan 10 dakika için embriyo 4x yıkayın.
NOT: yıkama solüsyonları değiştirirken örnekleri kuru değil için çok önemlidir. - Taze sta hazırlamakreaksiyonlar daha önce ining çözeltisi (Tablo 1). Hazırlamak girdap ve ayrı tüplerde santrifüj parçaları A ve B.
NOT: Düz tek tüp içine tüm bileşenleri ekleme şiddetli yağış neden olur. - , B kısmının tamamı çözeltiye A kısmının tüm solüsyonu ilave boyama solüsyonu hazırlamak için iyice karıştırın ve hemen sabit ve yıkandı embriyoları içeren her bir mikrofüj tüpüne 1 mi dağıtın.
- rotator veya oda sıcaklığında nazik çalkalama için sallanan bir platform da ışık ve yerine korumak için alüminyum folyo ile mikrofüj tüpleri sarın.
- Ampirik mikroskobu ile kromojenik sinyalleri izleyerek reaksiyon süresini belirler. zamanla gelişecektir hafif yağışlar; Bununla birlikte, bu reaksiyon işlemi engel olmaz.
Not: Embriyolar 4 saat 25 ° C'de 28 HPF boyama sabit için interrenal doku net bir sinyal üretir. - PBST içinde 10 dakika için 4x yıkama ederek reaksiyonu durdurun. benf başka immünohistokimyasal (IHC) analizi gereklidir sonrası tamir oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 4 PFAT ile boyanmış embriyolar. Aksi takdirde, bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de yıkandı, embriyolar saklayın.
- tüm montaj mikroskopi için, PBS içinde% 50 gliserol ile lekeli sonradan tespit ve yıkanmış embriyolar temizlemek bir slayt yukarı bakacak şekilde sırt tarafında onları yönlendirmek ve parlak saha aydınlatma altında dik bir mikroskop kullanılarak gözlemlemek.
NOT: tavsiye edilir interrenal doku morfolojisi bir yüksek çözünürlüklü görüntü, 3β-Hsd aktivite lekeli ve deyolked embriyo analizi, düz monte yapmak için. Interrenal steroidogenik doku sağ yumurta sarısının üzerine konumlandırılmış olarak, interrenal doku ventral düz montaj analizi interrenal morfolojisi 17 doğrudan ve net gözlem sağlar.
3β-Hsd Etkinlik lekeli Embriyolar 3. IHK Analizi
NOT: steroi vasküler mikro analiz içindogenic dokusu, bir transgenik endotel spesifik flüoresan raportör 3β-HSD 'aktivitesi lekeli embriyolar vibratome kesilmesi ve daha sonra IHC analizi 12,18 enine tabi tutulur.
- Post-fiksasyon
- 4 ° C 'de 1 saat süre ile% 1 Triton X-100 ile desteklenen% 2 PFA 3β-HSD' aktivitesi-boyanmış ve yıkandı embriyolar sonrası düzeltmek ve% 1 Triton X-100 içeren PBS içinde 10 dakika boyunca 4x yıkayın (PBSTx) oda sıcaklığında karıştırıldı.
- katıştırma
- % 4, 95 ° C, 4-8 ° C de mikrofüj tüplerine kısım ve mağazada PBS içinde agaroz eritilerek agaroz erime noktası düşük hazırlayın.
- 10 dakika süre ile 70 ° C 'de agaroz% 4 düşük erime bir kısım eritin ve sonra 47 ° C'de kısım tutun. Her embriyo yerleştirme eriyik% 4 bir kalıp olarak hizmet veren bir 1.5 mi mikrofüj tüpün müstakil bir kap içinde agaroz, erime noktası düşük, ve katı kadar soğumaya bırakın.
- vibratome Kesit
- Kuru p kağıt şerit bir parça sopavibratome latform.
- bir jilet ile kalıp sertleştirilmiş agaroz blok çıkarın. platformda kağıt şerit superglue uygulayın ve yukarı bakacak şekilde numunenin ön tarafı, kağıt şerit üzerine agaroz blok düzeltmek. sırasıyla, yaklaşık olarak 4 mm, üst ve alt yüzlerin her bir tarafında 8 mm olan, bir yamuk prizma şekline agaroz blok kesin.
- Bir damlalık kullanılarak,% 0.5 Triton X-100 (% 0.5 PBSTx) ile desteklenmiş, soğuk PBS ile numune içeren agaroz blok durulayın.
- vibratome kullanım kılavuzuna göre 100 mikron bölüme agaroz blok dilimleyin. Sürekli kurumasını önlemek için agaroz blok durulayın. Her bir dilim kesme gibi, bir 26 G iğne kullanılarak şırınga vibratome çıkarın ve soğuk% 0.5 PBSTx (500 ul / oyuk) ihtiva eden bir nokta plakaya aktarılır.
- Diseksiyon mikroskobu altında kontrol ederek 3β-Hsd aktivite pozitif doku bölümleri toplayın ve bir pi ile bölümleri aktarmakSoğuk% 0.5 PBSTx (150 ul / oyuk) ihtiva eden bir 96-çukurlu plaka uç kesme (açıklık yaklaşık 1 mm iç çap) sahip Pette ucu. doku örnekleri genellikle bu aşamadan sonra agaroz blok ayırmak.
- Permeabilization ve Yıkama
- PBS içinde 10 dakika% 1 sığır serum albümini /% 1 DMSO /% 0.1 Triton X-100 (PBDTx) ile desteklenmiş dilimler, oda sıcaklığında,% 0.5 PBSTx 15 dakika PBS içinde 10 dakika ve 4 kere 6x yıkayın.
- bloke etme
- Oda sıcaklığında PBDTx 1 saat,% 2 fetal sığır serumu (FCS), dilimler inkübe edin.
- Primer antikor reaksiyonu
- Birincil antikor içeren PBDTx 1.5 gün inkübe dilimleri (örneğin, tavşan poliklonal anti-insan fibronektin ve fare anti-insan fokal yapışma kinaz) 4 ° C'de ilave edildi.
- Yıkama
- Dilimler oda sıcaklığında PBDTx 10 dakika boyunca 6 kat yıkayın.
- bloke etme
- PB içinde% 2 FCS içinde 1 saat boyunca inkübe dilimleriOda sıcaklığında DTx.
- İkincil antikor reaksiyonu
- 4 ° C 'de ikinci bir antikor (florofor-konjuge keçi anti-tavşan veya anti-fare IgG'si) ihtiva eden PBDTx 1.5 gün inkübe dilimleri.
- Yıkama
- Dilimler oda sıcaklığında PBST 10 dakika süreyle 10 oda sıcaklığında PBDTx içinde min ve 4x için 6x yıkayın.
, Odaklı mikroskopik analizi için PBS içinde% 50 gliserol ile örnekleri temizlemek: NOT.
- Dilimler oda sıcaklığında PBST 10 dakika süreyle 10 oda sıcaklığında PBDTx içinde min ve 4x için 6x yıkayın.
4. Konfokal Analizi
- tüm montaj embriyo ve 10X / 0.5 ve 20X / 0.75 objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile bölümüne dikkat ediniz.
- aşağıdaki gibi floresans ve 3β-HSD 'boyama birinin eş zamanlı saptanması için, çok kanallı ayar modu: 488 nm argon lazeri ve GFP tespiti için 505-530 nm bant geçişi filtresi; 543 nm Helyum-Neon lazer ve mCherry tespiti için 560-615 nm bant geçiş filtresi; ve 3β-Hsd boyama tespiti için ışık kanalı iletti.iğne deliği boyutu 1 Airey birimi ve çözünürlüğü 1024 x 1024 piksel olduğunu.
- 3D projeksiyon olarak (6 mikron aralığı ile) z yığınları birleştirin ve kullanarak, projeksiyon ve parlak bir alan birleştirme yerleşik konfokal yazılımı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pronephric böbrek glomerül ve doğmakta olan damarsal ile steroidogenik interrenal doku codevelops, 3β-Hsd enzimatik aktivite deneyi çift transgenik Tg (wt1b: GFP) üzerinde gerçekleştirildi nasıl belirlemek için LI1; Tg (kdrl: mCherry) ci5 embriyo 34 hpf (Şekil 1). Bu aşamada, 3β-Hsd aktivitesi pozitif steroidogenik doku sağ orta hatta yer alan ve bazı steroidogenik hücreler orta hatta genelinde göç başlar ve dorsal görünümünden bir çıkıntılı kenar oluşturacak ise hemen Pronephric böbrek glomerüle kaudale. steroidogenik doku yakından dorsal aorta (DA) ve posterior kardinal venin (PCV) ile ilişkilidir.
Tg (kdrl GFP) üzerine 3β-HSD 'enzimatik aktivite deneyi s843 embriyo DA, PCV içeren, peri-interrenal damar net bir biçimde sınırlandırılmasını izinVe interrenal kabı (IRV; Şekil 2). 3β-HSD 'aktivitesi lekeli embriyoların vibratome bölümleri fokal yapışma kinaz tarafından fosforile edildiğini hücre dışı matris protein fibronektinin ve akım aşağı yöndeki bir tespit edilmesi için IHC analizi yapıldı. Fibronektin peri-DA birikimi IRV büyümeyi 18 desteklemek için gereklidir.
Şekil 1: floresan gazetecilere ifade Zebra balığı üzerinde yapılan 3β-Hsd etkinlik boyama Tüm montaj. Dorsal (panel sol) ve dorsolateral (sağ panel) bir 3β-Hsd aktivite lekeli Tg (wt1b: GFP) görüşlerini LI1 Tg (kdrl: mCherry) 34 hpf ci5 embriyo, interrenal göreli uzaysal dağılımı görselleştirme izin verir doku (IR), Pronephric glomerulus (PG), Pronephric tübüller (PT), dorsal aorta (DA), yan dorsalAort (LDA) ve posterior kardinal ven (PCV). Nedeniyle bu aşamada interrenal dokusunun konumu, dorsolateral görünümleri embriyo sağ tarafında bulunmaktadır. D, dorsal; V, ventral; A, ön; P, arka; R, sağ; L bıraktı. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Vibratome kesit ve 3β-Hsd aktivite lekeli Tg (kdrl: GFP) İHK analizi s843 embriyoların. 34-HPF embriyo 3β-HSD 'enzimatik aktivite deneyi ve vibratome kesit tabi tutulmuştur. 3β-Hsd aktivitesi pozitif bölüm F (tavşan anti-insan fibronektin çift İHK tarafından boyandın; 1/200) ve fare anti-insan fosforlu fokal yapışma kinaz (pFak; pY397, 1/100). enine kesiti interrenal doku (IR) ve dorsal aorta (DA), arka kardinal ven (IRV) ve posterior kardinal venin (PCV) da dahil olmak üzere komşu damarların, göreceli dağılımını göstermektedir. NT, nöral tüp; NC, Notokordun; S, hücre gruplarının. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| stok konsantrasyonu | 1000 ul | Nihai konsantrasyon | |
| Bölüm A. | |||
| DMSO | 40 ul | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 ul | 0.1 mg / ml |
| NAD | 1.2 mg / ml | 10 ul | 12 ug / ml |
| Bölüm B. | |||
| PBST | 936 ul | ||
| B3 vitamini | 50 mg / ml | 2 ul | 0.1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 ul | 0.1 mg / ml |
Tablo 1: 3β-Hsd boyama reaksiyonu bileşenleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3β-HSD aktivitesinin sinyal gücü reaksiyon boyunca arttı. 3β-HSD aktivitesinin net sinyaller itibaren 28 HPF gelen aşamaları için reaksiyon 4 saat sonra tespit edildi. Bununla birlikte, reaksiyon süresi deneyi amacına bağlı olarak, ampirik belirlenmesini gerektirir. boyama gece boyunca işlem gerektirir durumlarda, hafif mavimsi arka örneklerinin geliştirme eğilimindedir. Bu sorun, 3β-HSD 'aktivitesi boyama önce sabitleme süresi (örneğin, oda sıcaklığında 4% PFAT 4 saat) arttırarak aşılabilir. Bu, oda sıcaklığında% 4 PFAT gece boyunca için sabitleme Bunun aksine, overfixation, ile, son derece net arka yol açar. Bununla birlikte, daha uzun bir zaman sinyalinin bir istenen yoğunluğu elde etmek için gerekli olacaktır. Biz 3β-Hsd etkinlik boyama önce bir gecede% 2 yerine 4% PFAT ile örnekleri tespit tipik bir sonraki floresan raportör gözlem ya da I daha fazla arzu edilen sonucu verir farkHC analizi. Bununla birlikte,% 4 PFAT embriyo sabitleme (1 gün içinde tamamlanır), 3β-HSD aktivitesinin hızlı bir deney sağlar ve böylece interrenal steroidojenik dokular hedef genetik ya da kimyasal ekranlar yararlı olacaktır.
kimyasal bileşenlerin eser miktarlarda da iyice yıkandıktan sonra, boyanan örneklerde devam eğilimindedir ve uzun bir depolama süresi sonrasında yüksek bir arka plan neden olur, çünkü 3β-HSD 'aktivitesi boyandıktan sonra embriyolar sonrası sabitleme esastır. Bununla birlikte, 3β-HSD 'aktivitesi boyanmış ve 4 ° C de bir gece boyunca embriyolar yıkandı arka bir fark donanım ile sonuçlanmaz saklama IHC analizi daha da maruz bırakılması 3β-HSD' aktivitesi lekeli embriyolar halinde.
3β-Hsd aktivite lekeli embriyoların in situ hibridizasyon (ISH) analizde mümkündür. Örneğin, prox1 transkriptlerinin sentezlenmesi steroidogen de 3β-Hsd aktivitesi ile birlikte lokalize olduğunuic dokusu 10. ISH ilave olarak 3β-HSD 'aktivitesi boyama yapmak için, embriyolar, hücresel RNA transkript ISH analizi için istenir kalitede korunması, böylece önceki ve 3β-HSD' aktivite deneyi sonrasında 4 saat% 4 PFAT sabit olmalıdır.
Ff1b, cyp11a1, hsdb1 ve yıldızın riboprobes kullanarak ISH analizi interrenal steroidogenik doku 1,2,11 gelişimsel çalışmalarında uygulanmıştır. Cyp11a1 ve yıldızın bu 24 hpf tarafından interrenal hücreleri ayırt tespit ederken ff1b ve riboprob, 22 hpf tarafından ilkel interrenal hücreleri algılar. sadece 28 HPF itibaren gelen farklı interrenal dokuları tespit 3β-HSD 'histokimyasal boyama ile karşılaştırıldığında, ISH analizi her iki ilkel ve farklılaşmış interrenal hücrelerde interrenal spesifik genlerin bir spektrum analiz etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, 3β-Hsd histokimyasal boyama hafarklılaşmış steroidogenik interrenal doku fenotip analiz etmek için, basit, hızlı ve güvenilir olmanın avantajı s ve bu nedenle ayrıntılı bir gelişimsel çalışmalar için güçlü bir araç yanı sıra büyük ölçekli genetik veya kimyasal ekranlar. ilgili literatür incelememiz başı olarak, güvenilir bir immünohistokimya yoluyla steroidogenik interrenal dokuda protein ifadesini algılayabilen özel antikor söz konusudur. Bu nedenle, 3β-Hsd histokimyasal boyama yöntemi doku ve steroidogenik interrenal dokusunun hücresel morfoloji ortaya koymaya özellikle yararlıdır.
3β-HSD 'histokimyasal boyama farklı steroidojenik interrenal doku görselleştirilmesi için yararlı olsa da, doğrudan steroid sentezi yeteneği ya interrenal hücre özelliğe bildirmez. steroidogenik sentez kaskad yukarı veya 3β-HSD aşağı enzimleri etkileyen mutasyonlar veya kimyasal olmayabilironlar ya da boyutu veya interrenal doku morfolojisi ya perturb olmayabilir çünkü mutlaka bu açıklanan yöntemle tespit edilebilir. Bu nedenle, bu protokolün kullanıcıların belirli enzimatik bozukluklar fonksiyonu etkileyen ancak interrenal doku değil morfoloji bu yöntem sayesinde kolaylıkla tespit edilebilir olmayabilir unutulmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
S843: LI1 ve Tg (EGFP kdrl): Biz Tg (GFP wt1b) hediye Prof. Christoph Englert ve Prof. Didier Stainier teşekkür suşu, sırasıyla, Tg (kdrl: mCherry) sağlanması Tayvan balığı Çekirdek Tesis ci5. Bu çalışma 102-, Bilim ve Teknoloji (96-2628-B-029-002-My3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-My3 Tayvan Bakanlığı hibe ile desteklenmiştir 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W.
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
